本发明涉及基因编辑技术进行农作物育种技术领域，尤其是一种通过基因编辑创制抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新种质的方法及其应用。
背景技术
番茄(solanumlycopersicum)是世界上重要的蔬菜作物，在促进农业经济发展、农民增收方面发挥着巨大的作用。种植过程中易受到多种病害的影响，导致产量下降，选育抗病品种十分重要。
番茄黄化曲叶病(tomatoyellowleafcurldiseasetylcd)是番茄的重要病害，该病害是由双生病毒科(geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属(begomovirus)的番茄黄化曲叶病毒(tomatoyellowleafcurlvirustylcv)引起，主要通过烟粉虱(bemisiatabaci)传播。该病害最早报道于以色列，随着国际贸易往来的深入，tylcv逐渐向全球范围扩展，20世纪90年代，该病害传入我国，目前已经遍布我国所有的番茄主产区，对番茄生产造成严重危害，造成巨大的经济损失。
tylcv危害番茄后，通过农业防治、化学防治不仅效果差，甚至还会对生态环境造成破坏，选育和种植抗病品种是最经济、有效、环保的防治方法。由于tylcv自身的变异，使得只含有ty-1和ty-2的番茄材料在一些区域丧失了抗性。此外，病毒的复合侵染，可以使对tylcv具有抗性的材料丧失抗性。通过对含有ty-5番茄材料进行抗性鉴定，明确含有该基因的番茄材料对tylcv具有很高的抗病性。通过遗传分析，明确该抗病基因为单隐性遗传基因，这与其他已知显性基因控制的番茄黄化曲叶病抗病基因不同。抗病基因ty-5的等位基因ty-5为感病基因，ty-5抗性丧失可以赋予感病材料对tyclv的抗病性。
与显性抗病基因不同，在对隐性抗病基因进行利用时，需要在父本和母本材料中都转入纯合的基因，才能赋予其后代f1材料抗病性。这较显性基因育种的工作量增加了一倍，育种周期长。此外，在进行多代回交转育的时候，由于抗病基因供体材料遗传背景的影响，使得新的材料园艺性状发生变化，影响了品种的特性。基因编辑技术的发展，为ty-5基因在育种中的利用提供了有力的武器。
现有的基因编辑技术主要有锌指核酸酶技术、类转录激活因子效应物核酸酶技术，以及最新的crispr/cas9基因编辑技术。基因编辑实现了对特定dna序列的识别、剪切，并在dna双链断裂位点(double-strandbreaks，dsbs)处引入碱基的缺失、替换、插入等不同突变类型，实现对dna的定点编辑。
目前尚无利用基因编辑的手段，创制抗tyclv新种质的相关研究。
技术实现要素：
本发明针对番茄中现有抗tyclv材料抗原不足，抗病材料在生产上发生丧失抗性的问题，以及常规育种时间长，成本高的问题，通过基因编辑的手段对ty-5基因进行基因编辑，快速赋予感病材料对tylcv的抗性，同时保留原感病材料的园艺性状不变。
为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案得以解决：
(1)现有技术中的基因编辑手段均可以用于本研究对ty-5的编辑，本发明仅列出利用crispr/cas9技术对ty-5的基因编辑，利用植物自身对dbs的修复机制，引入dna序列的缺失，使ty-5基因功能的丧失，从而获得抗病性；
(2)grna靶位点选择在ty-5基因的外显子区域，根据crispr/cas9靶位点锚定原理，选取原型间隔序列毗邻基序(protospacer-associatedmotif，pam)上游18-20bp碱基作为靶位点，即(5'-n18-20ngg-3'，ngg为pam序列，n18-20代表18-20bp碱基的识别序列)；
(3)根据识别序列设计oligo序列引物：
target-sense：5’-ttg-nnnnnnnnnnnnnnnnnnn(n表示grnasense序列)
target-anti：5’-aac-nnnnnnnnnnnnnnnnnnn(n表示grnasense的反向互补序列)
将引物浓度稀释为10μm，取上述引物各5μl，加水15μl，混匀。95℃放置3分钟，之后慢慢冷却至25℃，之后16℃5分钟，完成oligo二聚体的合成；
(4)选用北京唯尚立德生物科技有限公司的crispr/cas9试剂盒vk005-14，利用已合成的oligo二聚体1μl，cas9/grna载体1μl，solution和solution2各1μl，h2o加入6μl混合均匀，16℃反应2h；
(5)将连接后的载体转入大肠杆菌感受态，挑取单克隆进行质粒测序分析，测序引物为sqprimer：5’-gatgaagtggacggaaggaaggag-3’，如seqinno.5所示，将测序结果阳性的质粒，转入农杆菌gv3101；
(6)以番茄子叶为外植体，通过叶盘法进行番茄再生，用阳性农杆菌gv3101介导番茄转化，经过潮霉素抗性筛选，获得再生番茄植株；
(7)根据靶位点上下游序列，设计可以扩增靶位点的引物，提取再生植株dna，以其为模板进行pcr扩增，对扩增产物进行测序，对再生植株的是否发生基因编辑，以及编辑类型是否为纯合突变进行测序分析；
(8)测序分析后，纯合基因编辑类型的株系进行tylcv的接种鉴定，鉴定结果为tcylv抗性的植株即为基因编辑创制的抗番茄黄化曲叶病毒病新种质。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明提供了一种通过基因编辑手段创制番茄抗番茄黄化曲叶病新种质的方法，通过对ty-5基因外显子区域，进行基因编辑，获得纯合编辑植株，即为抗tylcv番茄新种质。
(2)本发明的方法较常规育种可以更快的赋予感病材料对tylcv的抗性；本发明的方法较常规育种可以更好的保留受体材料的园艺性状；
(3)通过本发明创制的抗性新种质是对现有tyclv抗病材料的有力补充；
(4)本发明的分子标记应用于对ty-5基因抗性材料的选育，可减少生产过程中化学农药的施用量，减轻病害的传播流行，节约生产成本，保障番茄生产的顺利开展，提高番茄产业的经济效益。
附图说明
图1为基因编辑引物对编辑后再生植株扩增图谱；
(m：100bpmarker；1：基因编辑后1号再生植株；2：基因编辑后2号再生植株；3：野生型moneymaker材料)；
图2为crispr5-f引物对各材料扩增条带测序结果
(a：1号再生植株；b：野生型moneymaker测序结果；c：2号再生植株；三角框分别表示1号和2号再生植株缺失的序列)；
图3为接种tylcv后抗病性鉴定；
(a：1号再生植株；b：野生型moneymaker；c：2号再生植株)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
通过基因编辑手段创制番茄抗番茄黄化曲叶病新种质的方法，包括以下步骤：
(1)材料
番茄材料：感番茄黄化曲叶病材料moneymaker；
crispr/cas9试剂盒：北京唯尚立德生物科技有限公司的crispr/cas9试剂盒vk005-14；
t载体：北京全式金生物技术有限公司(ct301-01)；
dna提取试剂盒：天根生化科技(北京)有限公司(dp305)；
农杆菌感受态：gv3101；
引物合成及测序均由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
(2)grna靶位点的选择
ty-5基因全长序列(如seqidno.1所示)共包含16个外显子，本实施例选择第二个外显子序列进行grna靶位点的设计。靶序列长19bp(如seqinno.2所示)。根据靶序列，设计引物：
target-f：5’-ttg-agaagaagctgatgatcta-3’，如seqinno.3所示，
target-r：5’-aac-tagatcatcagcttcttct-3’，如seqinno.4所示；
(3)oligo二聚体合成：
将target引物稀释为10μm，取上述引物各5μl，加水15μl，混匀。95℃放置3分钟，之后慢慢冷却至25℃，之后16℃5分钟，完成oligo二聚体的合成；
(4)crispr/cas9重组载体的构建及农杆菌转化
反应体系为：已合成的oligo二聚体1μl，cas9/grna载体1μl，solution和solution2各1μl，h2o加入6μl混合均匀，16℃反应2h；将连接后的载体转化大肠杆菌感受态trans1-t1，涂板过夜，挑取单菌落，提取质粒，对质粒进行测序分析，测序引物为sqprimer：5’-gatgaagtggacggaaggaaggag-3’，如seqinno.5所示。将测序结果正确的菌提取质粒，通过冻融法转入农杆菌gv3101中.
(5)番茄转化：
主要步骤如下：
外植体预培养准备：选择刚从种皮出现的子叶用于转化。将子叶切下并放入50-100mlms液体培养基中。将子叶的柄端和尖端切除，放在d1培养基上颠倒放置培养。将培养皿放在24℃恒温培养室(16l/8d)预培养2天。
共培养：每10ml的ms液体培养基中加入5ul的0.074m乙酰丁香酮。吸取5ml的ms液体培养基(+as)冲洗农杆菌菌落，将菌液od600稀释至0.3-0.4，吸取菌液加入到预培养(2days)子叶中。农杆菌侵染子叶8-10分钟之后，将多余菌液菌吸出。将子叶转移到该含有滤纸的d1培养基上。子叶倒置(叶片下表面朝上)。24℃，黑暗培养2天。
筛选：将无菌子叶转移至50ml离心管中，无菌水洗涤2次，+car洗涤一次；将子叶倒置(背面朝上)在分化培养基2z上，每皿20-30片子叶，以保证子叶所需生长空间。双层封口膜封口，24℃培养10天(16l/8d)。在第10天，将子叶转移到新鲜2z培养基平板。然后每2-3周继代培养一次。2-3周后会长愈伤。4-6周之内会出现初始芽。当芽开始出现后，每2周继代一次外植体，培养基为1z选择性培养基。
生根：从外植体摘下幼芽，将幼芽放入含40ml的mmsv培养基(含0.5mg/liba，15mg/l潮霉素和200mg/l特美汀)的100ml无菌瓶中。2周左右开始出现根。当植物生长足够大时，可将幼苗移栽进含蛭石和土壤混合物的小塑料盆中，并用营养水浇灌。通过番茄转化，共获得2株转化番茄幼苗。
6.再生植株基因编辑检测：
分别提取2株再生植株和野生型moneymaker材料的叶片dna，用扩增引物为：
crispr5-f：5’-tccattgaactgaagcaaatctc-3’，如seqinno.6所示，
crispr5-r：5’-gctaataatgctaagccctcaca-3’，如seqinno.7所示。
扩增片段长度约为450bp，对pcr扩增后的产物进行琼脂糖电泳检测，判断条带大小是否正确(图1)。电泳条带显示，再生植株和野生型moneymaker材料均可以扩增出450bp大小的条带，将再生植株和野生材料扩增后的3个pcr产物，用crispr5-f引物进行测序分析，检测基因编辑部位碱基序列的变异情况(图2)。检测结果证实，1号和2号再生植株与野生型相比，在基因编辑位点处均发生了序列的变异，但1号植株的变异为杂合类型，双链dna其中一条发生了13bp碱基的缺失；2号植株的变异类型为纯合变异，dna双链均在同一位点处缺失了6bp碱基序列。
7.抗性鉴定
利用携带tylcv的烟粉虱对2株再生植株及野生型moneymaker进行病毒接种，侵染一周后，将粉虱用吡虫啉杀死，之后正常管理，1个月后对发病情况进行调查。通过接种鉴定，1号再生植株和野生型moneymaker均出现发病症状，但2号再生植株无发病症状，对tylcv表现出极高的抗性(图3)。证实纯合编辑类型的植株具有对tylcv的抗性。2号植株可以作为抗番茄黄化曲叶病的抗病新种质。
综上所述，本方法提供了一种通过基因编辑手段创制番茄抗番茄黄化曲叶病新种质的方法，通过对ty-5基因外显子区域，进行基因编辑，获得纯合编辑植株，即为抗tylcv番茄新种质。
seqidno.1
番茄材料moneymaker内ty-5基因全长序列，下划线标出的序列为内含子序列；阴影标出的为基因识别位点。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110>江苏省农业科学院
<120>一种通过基因编辑创制抗番茄黄化曲叶病毒病番茄新种质的方法及其应用
<160>7
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>7740
<212>dna
<213>ty-5基因全长序列(ty-5)
<400>1
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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