本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种以crispr/cas9基因编辑技术修复rc突变基因创制红米品系的方法。
背景技术
近几年，基因组编辑技术的高速发展为水稻基因功能研究和遗传育种改良提供了一种高效的辅助工具。它是利用位点特异性核酸酶在植物基因组dna序列上造成双链断，激发细胞自身同源重组和非同源末端接合的修复机制，通过随机的添加或删除靶序列的碱基个数来完成对植物基因组的靶向修饰，因此可以实现对目标dna序列的定点编辑。在水稻上，该技术已经实现了很多负调控基因的敲除以获得有利农艺性状的改良，对水稻分子育种的进程起到了强有力的推进作用。然而水稻基因组里头含义大量的有利农艺性状的正调控基因，且已经发生的突变功能已经发生变化。关于基因编辑技术利用于正调控突变基因功能的回复，目前还没文章报道过。
随着日愈复杂的环境变化以及日愈多样化的人类需求，我国的水稻育种重点也逐渐从早期的产量育种到现在品质多样性、环境高适应及低资源投入的水稻分子设计育种新理念。然而水稻品质性状的遗传研究与育种实践是我国水稻科学研究的薄弱环节，形成我国优质稻米品种较少，国际竞争低的现状。因此，提高我国稻米食味品质是现阶段水稻科研工作者的重要课题。
红米具有丰富的营养价值，如富含丰富的维生素，大量的微量元素以及丰富的黄酮类物质。随着社会的发展，人们生活水平的提高，更加营养，更加健康的食物越来越受到人们的青睐，目前市场上的有色米主要是红米和黑(紫)米。这类有色稻米是由于花青素在果皮、种皮内累积，糙米(颖果)呈有色泽的稻米。
研究发现，rc基因是导致水稻红米性状的一个主效基因，该基因cdna全长833bp，包含有7个外显子，编码一个由277（日本晴473）氨基酸组成的蛋白产物，产物是一个含有碱性螺旋-环-螺旋(bhlh)基序的蛋白。97.9%的水稻白米品种中的rc等位基因存在14bp片段缺失，其他小于3%的白米品种中的rc等位基因不存在14bp片段缺失，而是rc基因的第6个外显子存在一个单碱基多态性位点。可见，该基因的突变在白色大米品种中是普遍存在的。
利用cas9基因组编辑技术对需改良白色水稻材料中rc等位基因的突变位点处进行定点编辑，筛选基因编辑且移码突变基因功能得到回复的基因型，理论上97.3%的白色水稻品种可以通过该基因的功能回复来创制红米种质。
技术实现要素：
基于背景技术，本发明的目的是提供一种通过crispr/cas9基因编辑技术修复rc突变基因创制红米品系的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提出了一种通过crispr/cas9基因编辑技术修复rc突变基因创制红米品系的方法，该发明适应于所有含有rc突变型基因型的白米品种中，包括如下步骤：
（1）拟改良水稻品种rc基因的序列分析确定基因突变类型，选择该基因移码突变位置或者提前终止位置进行基因编辑靶点设计；
（2）构建打靶载体，将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞；
（3）rc基因编辑体的基因型检测及选取氨基酸缺失突变的基因型进行表型考察，查看功能回复情况。
具体步骤包括以下步骤：
（1）待编辑水稻品种的rc基因型的检测；
（2）选取rc基因移码突变位置构建cas9表达载体；
（3）将粳稻秀水134或籼稻冈优8518的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，鉴定转基因植株rc基因编辑情况，获得不同类型的rc等位基因，并筛选功能回复的rc等位基因，最终获得改良红米品系。
本发明的另一个目的在于提供了创制红米的cas9表达载体，包含表达cas9蛋白的基因表达盒和靶定rc基因grna，cas9蛋白的表达由ubiquitin启动子驱动，grna由u6启动子驱动。所述cas9表达载体中，grna(分别命名为grna1和grna1)的靶标序列为gcgcaagtggatgccatccaagg或ccatccaaggtgatttcagtgcc。所述两个grna编码基因处在rc基因中第5173-5208位核苷酸。所述两个grna都可靶定突变型等位基因的第七个外显子缺失14bp的突变位点处，从而产生不同类型的等位基因，并获得功能回复的rc等位基因。
与现在技术相比，本发明的有益成果在于：
本发明提出了一种基因编辑技术的运用，利用其定向打靶功能来实现已突变基因的定向回复，相比其他基因回复方式，该方法该系统简单易行、成本更低、效率高。
本发明利用基因组编辑技术对rc突变基因功能的定点回复，理论上可快速实现93%白米的米色改良。为创制红米种制资源，培育优质红米提供了一种高效的育种方式。
本发明保护一种利用基因编辑技术来回复优势失活基因的方法，上述方法基因编辑系统可以编辑突变基因的移码突变位点和提前终止位点。
附图说明
图1.水稻rc基因的序列分析及基因编辑靶点设计。黑色方框表示外显子，黑色线条表示内含子，灰色方框和字体表示缺失序列，cas9识别序列位于rc基因第七外显子的5183处。
图2.靶grna1介导的rc部分新基因型的获得。wt为野生型序列，阿拉伯数字表示发生缺失或增加的碱基数（数字前面加“-”表碱基缺失，数字前面加“+”表碱基增加），灰色字体为添加碱基，灰色标注含有缺失3n+1bp碱基基因型的植株编号。
图3.靶grna2介导的rc部分新基因型的获得。wt为野生型序列，阿拉伯数字表示发生缺失或增加的碱基数（数字前面加“-”表碱基缺失，数字前面加“+”表碱基增加），灰色字体为添加碱基，灰色标注含有缺失3n+1bp碱基基因型的植株编号。
图4.rc基因不同基因型的表型考察。xs134-wt为秀水134野生型对照植株，xs134-1到xs134-4为不同基因型编辑植株xs134-5，xs134-6为基因回复基因型植株。hh851-wt为冈优8518野生型对照植株，hh851-1到hh851-4为不同基因型编辑植株，hh851-5，hh851-6为基因回复基因型植株。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中所使用的实验验方法如没有特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。
实施例1：水稻rc基因的序列分析及基因编辑靶点设计
水稻rc基因的序列如序列1所示。序列分析显示，该基因含有7个外显子，分别为序列表中第1-95（第一外显子）、第415-720（第二外显子）、第3418-3514（第三外显子）、第3748-3762（第四外显子）、第3903-3959（第五外显子）、第4162-4711（第六外显子）、第4882-5198（第七外显子）。
本发明所实验两个白米品种秀水134和冈优8518的rc基因均在第七外显子5183处存在14个碱基的突变。因此根据本发明的原则选择在该处设计两个cas9识别位点，如图1。识别靶序列分别为：（grna1）gcgcaagtggatgccatccaagg和（grna2）ccatccaaggtgatttcagtgcc。
实施例2：打靶载体构建及水稻遗传转化
本实验采用基因编辑技术为第三代基因编辑技术crispr/cas9，所使用的载体为人工合成重组质粒pcxun-cas9-grna（环形载体），骨架载体pcxun-cas9为市面上订购的常见线性载体，（本实验购于北京唯尚立德生物科技有限公司），cas9蛋白序列全长4206个碱基对，编码1401个氨基酸。其表达由ubiquitin启动子驱动，grna由u6启动子驱动。grna片段由引物合成公司合成后通过dna连接酶连接在u6启动子之后形成重组质粒pcxun-cas9-grna（环形载体）。
本发明中，将所述载体pcxun-cas9-grna转化粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法实现遗传转化，并经抗性愈伤的筛选、分化和生根创制新的红米品种，以下秀水134和冈优8518为例进行介绍，具体步骤如下：
1、将成熟的水稻水稻种子脱壳并消毒后接种于诱导培养基（nb培养基+2,4-d2mg·l-1，ph5.8）中，28℃暗培养7天，切除胚根继续培养7天后将胚性愈伤转移到新的诱导培养基中，每隔14-20天继代一次。继代三次后的自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗粒状愈伤可用于农杆菌转化。
2、取少量重组农杆菌菌液划线于yeb固体培养基（含有卡那霉素50mg·l-1和利福平50mg·l-1，ph5.8）上，28℃暗培养36~72h进行活化；取活化平板上的单菌落转接划菌，28℃暗培养两天，用aam培养基（含有100μm·l-1乙酰丁香酮，ph5.2）洗菌及重悬菌体，调整菌液浓度至od600nm=1.5-2.0，静置1h，得到农杆菌悬浮液。
3、将步骤1得到的胚性愈伤浸泡于步骤2的农杆菌悬浮液中，静置30min后于无菌滤纸上晾干愈伤，并接种于共培养基（nb培养基+2,4-d2mg·l-1+乙酰丁香酮100μm·l-1，ph5.8）中，25℃暗培养3d。
4、挑取步骤3共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250mg·l-1羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干愈伤组织，接种于筛选培养基（nb培养基+2,4-d2mg·l-1+羧苄青霉素250mg·l-1+hygromycin50mg·l-1，ph5.8）中，28℃暗培养，每两周转接1次，约需三周即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。
5、将步骤4获得的抗性愈伤转移至分化培养基（nb培养基+2,4-d2mg·l-1+kt10mg·l-1+naa0.4mg·l-1，ph5.8）上，2周后愈伤开始转绿，3周后即长出幼芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基（1/2ms培养基，ph5.8）上，待幼苗生根长成后，洗净根上的培养基，移栽实验基地。
实施例3：rc基因编辑体的基因型检测及表型考察
a)靶grna1获得的基因型及表型考察
提取转化植株基因组dna，用引物cztf-f（5'-gggagatccagctagaggtc-3'）和cztf-f（5'-ggaaggaggaagacaagg-3'）进行pcr扩增鉴定转基因植株。进一步用引物rc-f:5'-caatcctacattacaacacgctg-3'；rc-r:5'-cattccgaaatagtgaaccct-3'，pcr扩增上述鉴定的转基因植株基因组dna，获得带有靶序列的rc基因片段，并送往公司测序。对测序结果进行分析，靶grna1介导的基因编辑在两种材料分别获得15和9种类型的rc基因型如图2列出部分缺失类型，其中各2种克隆（xs134-4，xs134-5，hh851-5，hh851-6）的基因型在移码突变位置由于碱基的删除而发生回复，回复率达到33%。进一步观察上述回复植株的表型，结果显示，稻米颜色加深，由白色变为红色。且杂合基因型也表现为红米性状。可见在原有缺失-14bp碱基的移码突变背景下，再缺失-1bp变成缺失5个氨基酸的弱突变即可完成基因功能回复，米色表型发生改变。而编号xs134-1，xs134-2，hh851-1，hh851-2克隆的基因型由于编辑之后仍然为移码突变基因型，所以表型未发生改变。如图4。
b)靶grna2获得的基因型及表型考察
靶grna2介导rc不同基因型的获得，检测方法同实例3a，我们在秀水134材料中共检测11种不同类型的基因型，而在冈优8518材料中共检测到6中不同基因型，部分缺失类型如下图3。其中以下克隆：xs134-9，xs134-10，hh851-9的基因型在移码突变位置由于碱基的删除而发生回复，米色表型同样发生改变。
本发明中利用crispr/cas9基因编辑技术获得rc基因突变体，与talen和zfn技术相比，操作过程简单方便，节约成本，一般实验室都可操作，而且用农杆菌介导法将rc基因突变体的功能回复，从而创制红米，与常规的杂交育种相比，大大节约了时间成本，是一种新的获得红米品系的分子育种方法。
综上实例证明，本发明提供的方法可以成功的改良水稻米色。该发明提供了两个设靶grna位点，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>福建省农业科学院生物技术研究所
<120>一种以基因编辑技术打靶rc基因创制红米品系的方法
<130>7
<160>7
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>6416
<212>dna
<213>人工序列
<400>1
atggccggcggcgaggcgcatgcggcgctgcaggcggtggcgcagagcctccggtggacc60
tacagcctcctctggcagctctgcccccaccaagggtacctaccctacctacctacgaca120
cgatgcacagtgttcatccatggccggccatggcggatcgtcgtcgttgtcgatgatcat180
cgaaggaagctagaggatatggctcaatactttgataatatatatactgatctctccgta240
caacaaaaatataaaaattctagctagtatcgaatgagacatatgctatgctagtactac300
gaatctaaaaagatgtacatattttgattcgtattattaggatatatcacgagtttttat360
attttgagacggatgtaataattctgaatttagttgtgatcgcatggcatgcaggagctc420
gctggtgtggggggaggggcactacaacggcgccgtcaagacgcggaagtcgacggtgat480
gcagccgccgccggcggaggaggaggacgacgccgaccacgcggcgcgccaccggagccg540
gcagctgagggagctctacgactggctgcagcaggccggggagaactccagcggcggcgt600
gcagacgtcgtcgacgacggcgagccggcggccgggggcggctctgtcgccggaggacct660
gacggagacggagtggttcttcctcatgtcggcatcctactccttccctcccggcatcgg720
gtatataataaaaaatatagatataaatatttaagcatgcatgcataaattaaaccacac780
ttcttgttacgtgttcttggcaaaatgatgaacaattaccactaattaattggagccaga840
aaccctaaagatttacccacctggttaattaatcggtgtgttgatccacgcatgcatgca900
tgcagaaaatcaagatcaggatagctccttttcttttgcaggttaattagctagatcttc960
acgtataattagctagctagattttaaaatataatttattcaatttgatttatgattttt1020
attttttatttcaaatagatacaactgtatacaaaattttattttggtacatacctccga1080
tccaactacatcagaggtaaaaaaaaaattaaaccgttggaattgattagaacaagatcg1140
tgcggtcaaattatatcataactaacttttctgattctctaaagcatagagatgtatata1200
tacatcgtattattaggctctatatttcctgattaacactagatgcatatataattttga1260
tagtcaaaatatacttttgataggctctaaagaaaaacttaataacatgtactccctcca1320
tatacttttgatagtcatatttcatcttgacacacagatcaagtataagtaattctactt1380
atcatccatttaaacacgctactagttattcctcataaacaagcgattcattaatattta1440
catttctcgatgcttgtgtagccaatattgtgtggaagaatggaatgtcattaagaggat1500
aggttgttggattgaaatatgcctatcaaaaataaatttttagatttgaaaatatgccta1560
tcaaaagtagatggagggagtattaattaatgtgaatttccaatcctactgttgtgatat1620
taggctttgtaccttcttgtccaggaggtatatatatggctcttttaaggatgggagaaa1680
atatcatctttaatacaactatatatggcttttgtttgataaatacaacttttattttgt1740
atgaatacaaatatattgataaatatccaccattataatcctaacccattaggatcatat1800
ggtgtatatttttttaactatttgttttttataaattaatattaagagatcacaataaaa1860
atatagtattatgaaagtactcttaacaacatatccaatgataaaattattattattaca1920
aaatatagtggtcaaattgtatagaattcaatagcctgattttatgacgtcaagtaaatt1980
aaataaagaatgaaggtagtgctagagtgatcaaacaatatctctcctaaaatatgtcct2040
ataagttttactccataaatccaagggtcaaaagttgttgggttatttttttagataata2100
acatactaccccttttcaaaatgtatgattctattgactttttgcacaacatttaaccat2160
ttgtcatattaaaaattagtataaacatctaaaaatataagttacaattatattttattt2220
gatgataaaacaactcacaacaaaataaataatatttatataatctttttggaataaaac2280
gaatgatcaaacattattcaaaaagtcaatggtatagtacgttttgaaattgatagacta2340
tgagagcaaaattttgagataacatggaaaattatcctcttagacattgcactgtgtaat2400
aattaataataatgaatgaaaggctaagacttttcttccaccttatataagtggttgaat2460
atatagcaatcacatcattacatgattttgtaaccaaccgtctctatagctccgatacag2520
tgctagtttcacatcgtaataattaaagagtataataataaatcgaggtgtacttctcat2580
cgatgaagtgatgtgccgcttagctaaattaaactcgtatgcgaaaaatcagtatatgtc2640
cggttaatttctaagagagagattgagagagaataattgcgcccctccaaatccccctct2700
tggacgttagggagctatatagacggtattgctaagtgcgatgtgtacataacgtacctg2760
tcgtaggaacatttctcatccaaattaagtagtaatgcatggcatgaaatccatttttgt2820
attttgcatggcaaagaatgacaacaaggaatacactagctagccctgccctttttcaat2880
ttaatttaacatcaaacttagttattgtatttcttttgtcagaatagcatgcattgcata2940
ctctttaaaaataattaattagtgtattttactagtcttacaaaagtatcaagagagaca3000
actaattatagttgggagacaccaaacttgtttttaataatgacaattaaaaccctacct3060
ctacatccaacatagacgtacatagtccgaaggcgccaaatatttgtacatttagctacc3120
agatttcagtacgagttctcacattataattttgatttttttattttttttataaacaat3180
ctggtacccttttatgtctggaaggaaaaaaaaaatctaaattgcaacattttagtcggt3240
gagaatggtactctgtcctagctactttctacacatgagagagagagagagagagagaga3300
gagagcctttaattgcccttgcccatgcatctttctttgcacacatgtatgcttttcaca3360
ttgtcatgaggagagaacttgttaagttgcacacatgtgtgctttgcatgtcttcaggtt3420
acctggaagggcatttgcaaggagaggccatgtatggctcactggagcaaatgaagttga3480
cagcaaagtattcctaagagcaattcttgccaaggttcagccatcaccttctcttaccta3540
tttttcactctgaatgccaacagtgctttgcacattgtagtctgtttgcagactgcaaat3600
gatgaccataatcagatcagaaaataaaataatattatatactttttgagccagctagca3660
agaatatgtaacaataattctcctttttttttcttgttcttttccctgatgtggtgcata3720
acaaataaccaaactgatgaatggcagagtgctggtatccaggtatttgcctctaaaagt3780
agctacacgtttactatgaaattttgtggcttttgttcatctttggatgcagtggccatt3840
atctaaaaactatgaatttccagactgcagtttttatctaattttgtgactttgtacatc3900
agacagttgtgtgcattcctgttgtcgatggcgtcctggaaattggaactacggaaaagg3960
tgatttcgtatattatcagctgacaatctaattatatgggccatataattaagtataaat4020
caaaatacctcataatatattataaagtatctaatgtgattatgtgaatattggctattt4080
caatgtaatttgatatatgaaactgataatcctctgaaactccgtaaggatcaaactaat4140
caaaatgtatatattttcaaggtggaggaagatatgggcctgattcagtatgcaaggggc4200
atcttcatggatcaacatggcatccacatgaagcctaccctctcacagcactcaacatcc4260
aacccagtcacccactgtactcatcagcatccaatccaggttcagatgcaactaggtatc4320
accagccaaacaaagtttgattattcagatgagctcaatgcagatgaggagaatgatgac4380
acagaagaagagggcatgtcaggttcagacactaacaacactgacactgaaaggaattca4440
ggccagctgcaacttcaaatgcaagaccaactgaacatggtgagcaatgaccaccagaca4500
ataccaaataatgcagtttccagtgagctaatgcagtgtgagatgtcagaagtggtaaga4560
gatggctgctcaaataatattttagaggatgaaatccaaatgctgatggattgccaaaac4620
agtaattgtcagttaaatttgcaagggccagatgagccttgtcactcttggcattttctc4680
tgcgaggagttacaaaatgattaccagccaggtattacatttgagaagataatccttcaa4740
aagcacccttgttccaaaaatatatatttgtactcttcacacaagcactgccattttttt4800
tcttttttgcatacatcctcaattcttgcatttcttttccatatatttgatacaactgtc4860
tccatttcccttctgtcacagctactgaagatcaagtggcatcacctgaaaatacccatt4920
acccaaaaacactcatgacaatcctacattacaacacgctgcgacagcaagagatgaaca4980
tcaagaactacttgccagtttcagagaaatcatcattctccagatggactactcctgaag5040
gaagtgatgacaacaagaccatgatcagtccaggcaccacacagagaatgctcaagagca5100
tcctgatgattgttcccagtagtcactgcagttacaggggagcagaaacacctgaatcaa5160
ggggcgggaaaggcgcaagtggatgccatccaaggtgatttcagtgccaaccatgtgctg5220
aaagagaggagaagaagagagaagctcaatgagaagttcataattctgcgatctttggta5280
cctttcatgacaaaggtaattaagtactccctctatttctataaagccgtatttgactag5340
ttatcttatttagaaagtatgtgcaaatatgtaaaatataagtcatacttaaagaacttt5400
taatgttattaaataataagtcacaccaaaaataaaacatatatatttttaataagataa5460
atgattaaatgtatatataaaaattaatagcgtcacatattttaaaatagaggggtattt5520
aagtacccacaggatcatcaaaattcagttatcttttcttaagcctctaacgaacattgg5580
aagatcctcactaatggcagcatgaatctagggttcactatttcggaatgcaaaatatgt5640
tttaccgggcatccgatttttaaaaaattcagaatgaagaaaattgaatcttttttatgg5700
atttgaataaatcttgataaattcgaaaaaatttccgaacttttggccagaagtgaatcc5760
tacccgtatccaccggtaataaacctaaatttttgggagtaatgaattaatgttatatat5820
aatccatgaattatatagttccaaactactccgtaacaaattttcaggagtagtgaaatt5880
aatattattacaatctcagaaaaaaatggcagaaacaattaatctgttttcaattattaa5940
ttaatttgtttttgtgtccagatggacaaggcgtcgatactaggcgacacgatcgagtac6000
gtgaagcagctaaggaaccgcatacaagagctcgagtcgtcgtcgtcgtcgtcacgagca6060
gccgcccgggcgccatcggcggcggccgccgggaggcggaggaagagatccgccgccgcc6120
gccactgccacggcggcggaagggatgagcagcagcaatggccgcaatggcggcgaggcg6180
gcggaggtggtgcaggtgtccatcatcgagagcgacgcgctgctggagctccggtgcggt6240
tgcggcggcggcggcggcggtgtggtgctgctccgggtgatgcaggcgatgcaggagctc6300
cagctggaggtcaccgccgtccaggcctcgtgcgccggtggcgagctgctcgccgagctg6360
cgcgccaaggtcgtcgttatgatcctgatctgcatgaaaatgcaaatgcaaatgca6416
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
gcgcaagtggatgccatccaagg23
<210>3
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
ccatccaaggtgatttcagtgcc23
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
gggagatccagctagaggtc20
<210>5
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
ggaaggaggaagacaagg18
<210>6
<211>23
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
caatcctacattacaacacgctg23
<210>7
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<400>7
cattccgaaatagtgaaccct21