本发明涉及基因编辑技术领域，尤其涉及一种以crispr/cas9基因编辑技术创制oself3基因突变体来改良水稻抽穗的方法。
背景技术
近几年，基因组编辑技术的高速发展为水稻基因功能研究和遗传育种改良提供了一种高效的辅助工具。它是利用位点特异性核酸酶在植物基因组dna序列上造成双链断，激发细胞自身同源重组和非同源末端接合的修复机制，通过随机的添加或删除靶序列的碱基个数来完成对植物基因组的靶向修饰，因此可以实现对目标dna序列的定点编辑。crispr/cas9系统是继zfns和talens技术之后出现的基因组定点编辑新技术。与zfns和talens不同的是，该系统简单易行、成本更低、效率高，因此成为最受欢迎的基因编辑工具。
水稻是我国的主要粮食作物。近年来，随着我国居民生活水平的提高与饮食习惯的改变，人们对粳米的需求不断扩大。我国粳稻供给主要以北方为主，空间有限。而南方稻区虽然水稻种植面积大，却以米质差、经济效益低、抗寒能力弱、抗倒伏性能较差的籼稻为主。原因在于，在南方地区短日照环境条件下，北粳品种表现营养生长不足、植株矮小，分蘖少、抽穗期提早等一系列不适应现象，甚至一些极端敏感的种质在南方稻作地区根本不能进行生殖生长。光周期敏感性的存在是粳稻种质资源北粳南移的重要限制因素；因此针对市场需求和粳稻南种的这些弱点，加强南方稻区“籼改粳”的技术研究，为该稻区推进“籼改粳”提供技术支撑，已成为当下我国稻作研究领域的重要课题之一。
研究发现，水稻抽穗期相关基因oself3与拟南芥中elf3蛋白的编码基因同源，编码一个水稻类elf3蛋白，在长日照和短日照条件下都通过负向调节开花抑制子基因ghd7的表达，从而间接调控其下游成花素基因hd3a和rft1的的表达，来调节水稻的花期转变，表明oself3基因充当开花激活子与生物钟基因互作促进水稻开花，是水稻光周期开花途径中的一个重要组成部分。通过该基因的突变在多种生长条件下生长下表现为晚抽穗表型。
本发明的出发点是利用cas9基因组编辑技术对水稻oself3等位基因的第一外显子进行定点编辑，快速地获得不同突变类型的oself3突变体，并从中筛选出能延迟抽穗的弱突变体材料，为水稻抽穗期改良提供丰富的种质资源。
技术实现要素：
基于背景技术，本发明提出了一种以crispr/cas9基因编辑技术创制oself3基因突变体来改良水稻抽穗的方法。最终获得晚熟优质水稻品种，促进北方粳品种南移，扩大种植面积。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提出了一种以crispr/cas9基因编辑技术创制oself3基因弱突变体来改良水稻抽穗的方法，该发明适应于所有含有功能型oself3基因的水稻品种中，包括以下步骤：
（1）拟改良水稻品种oself3基因的序列分析确定基因突变类型，选择该基因移码突变位置或者提前终止位置进行基因编辑靶点设计；
（2）构建打靶载体，将拟改良水稻品种的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法将打靶载体导入愈伤组织细胞；
（3）对oself3基因编辑体的基因型检测及选取移码突变的基因型进行表型考察，考察抽穗期变化情况。
具体为：
（1）水稻中oself3基因的检测；
（2）水稻中oself3基因cas9敲除表达载体的构建；
（3）将粳稻秀水134的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，鉴定转基因植株oself3基因编辑情况，获得不同突变类型的oself3等位基因，并筛选功能发送改变的弱突变基因型，最终获得抽穗期改良品系。
所述oself3基因为编码oself3蛋白的基因。
所述oself3基因编码的oself3蛋白为：
(1)由序列表中seqidno.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或
(2)将seqidno.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。
所述oself3基因为：
1)编码区如序列表中seqidno.1所示的dna分子；或
2)序列表中seqidno.2所示所示的dna分子；或
3)与1)或2)限定的dna序列杂交且编码oself3蛋白的dna分子；或
4)与1)或2)限定的dna序列至少具有70％以上同源性且编码所述oself3功能蛋白的dna分子。
所述水稻中oself3基因的表达是通过对水稻中oself3基因进行基因编辑实现的。所述基因编辑是借助crispr/cas9系统实现的。
所述crispr/cas9系统中，cas9蛋白的表达由ubiquitin启动子启动，grna由u6启动子启动。grna的靶标序列如下：aacgacgcggccaagggcgg。所述grna的编码基因如序列表的序列1中第88-110位核苷酸所示，该序列靶定oself3等位基因的第1个外显子。
与现在技术相比，本发明的有益成果在于：
本发明提出了一种基因编辑技术的巧妙运用，利用其定向打靶功能来实现基弱突变体的获得，该方法该系统简单易行、成本更低、效率高。本发明利用基因组编辑技术对oself3基因功能的的定点编辑，成功的获得了能适当延迟抽穗的粳稻品种。为水稻不同抽穗期新种质的创制及优势水稻特别是北粳南移的育种实践提供一种高效的可操作方式。
附图说明
图1水稻oself3基因的序列分析及基因编辑靶点设计图。其中，黑色方框表示外显子，黑色线条表示内含子，灰色方框表示cas9识别序列，识别位点位于oself3基因第二外显子处。
图2cas9介导的oself3不同基因型的获得。wt为野生型序列，阿拉伯数字表示发生缺失或增加的碱基数（数字前面加“-”表碱基缺失，数字前面加“+”表碱基增加），灰色字体为添加碱基。
图3秀水134材料野生型和突变体在海南福州两地的抽穗考察。
图4秀水134材料野生型和突变体在海南福州两地的表型考察。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中所使用的实验验方法如没有特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的的实验材料如无特别说明均为市售购买产品。
实施例1：水稻oself3基因的序列分析及基因编辑靶点设计
水稻oself3基因的序列如seqidno.1所示。序列分析显示，该基因含有4个外显子，分别为序列表中第1-261（第一外显子）、第1660-2645（第二外显子）、第3330-3381（第三外显子）、第3495-4478（第四外显子）。
本发明所设靶均在两个品种秀水134材料中oself3基因上的第1外显子88-110处的碱基。
实施例2：打靶载体构建及水稻遗传转化
本实验采用基因编辑技术为第三代基因编辑技术crispr/cas9，所使用的载体为人工合成重组质粒pcxun-cas9-grna（环形载体），骨架载体pcxun-cas9为市面上订购的常见线性载体，（本实验购于北京唯尚立德生物科技有限公司），cas9蛋白序列全长4206个碱基对，编码1401个氨基酸。其表达由ubiquitin启动子驱动，grna由u6启动子驱动。grna片段由引物合成公司合成后通过dna连接酶连接在u6启动子之后形成重组质粒pcxun-cas9-grna（环形载体）。其中，grna序列如下：aacgacgcggccaagggcgg。
本发明中，将所述载体pcxun-cas9-grna转化粳稻、籼稻和糯稻的愈伤组织作为遗传转化的受体材料，用农杆菌介导法实现遗传转化，并经抗性愈伤的筛选、分化和生根创制新的红米品种，以下秀水134例进行介绍，具体步骤如下：
1、将成熟的水稻水稻种子脱壳并消毒后接种于诱导培养基（nb培养基+2,4-d2mg·l-1，ph5.8）中，28℃暗培养7天，切除胚根继续培养7天后将胚性愈伤转移到新的诱导培养基中，每隔14-20天继代一次。继代三次后的自然分散、颜色鲜黄、直径约为2-3mm的颗
粒状愈伤可用于农杆菌转化。
2、取少量重组农杆菌菌液划线于yeb固体培养基（含有卡那霉素50mg·l-1和利福平50mg·l-1，ph5.8）上，28℃暗培养36~72h进行活化；取活化平板上的单菌落转接划菌，28℃暗培养培养两天，用aam培养基（含有100μm·l-1乙酰丁香酮，ph5.2）洗菌及重悬菌体，调整菌液浓度至od600nm=1.5-2.0，静置1h，得到农杆菌悬浮液。
3、将步骤1得到的胚性愈伤浸泡于步骤2的农杆菌悬浮液中，静置30min后于无菌滤纸上晾干愈伤，并接种于共培养基（nb培养基+2,4-d2mg·l-1+乙酰丁香酮100μm·l-1，ph5.8）中，25℃暗培养3d。
4、挑取步骤3共培养后的愈伤于广口培养瓶中，用无菌水冲洗3-5次，每次摇动数次，直至水中不见丝状菌体。最后一次用含250mg·l-1羧卞青霉素的无菌水静置1h，然后置于无菌滤纸上晾干愈伤组织，接种于筛选培养基（nb培养基+2,4-d2mg·l-1+羧苄青霉素250mg·l-1+hygromycin50mg·l-1，ph5.8）中，28℃暗培养培养，每两周转接1次，约需三周即可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。
5、将步骤4获得的抗性愈伤转移至分化培养基（nb培养基+2,4-d2mg·l-1+kt10mg·l-1+naa0.4mg·l-1，ph5.8）上，2周后愈伤开始转绿，3周后即可长出幼芽，随后根也长出。将幼苗移至生根培养基（1/2ms培养基，ph5.8）上，待幼苗生根长成后，洗净根上的培养基，移栽实验基地。
实施例3：oself3基因突变体的获得和弱突变体的筛选
提取转化植株基因组dna，用引物cztf-f（5'-gggagatccagctagaggtc-3'）和cztf-f（5'-ggaaggaggaagacaagg-3'）进行pcr扩增鉴定转基因植株。进一步用引物oself3-f:5'-aatgggcgtatggatgag-3'，oself3-r:5'-cgagataactacaaagggtaag-3'，pcr扩增上述鉴定的转基因植株基因组dna，获得带有靶序列的oself3基因片段，并送往公司测序。对测序结果进行分析，两种材料各获得18个oself3基因发生编辑的克隆，其中大部分克隆的基因型为碱基添加1bp和删除1bp的突变。进一步观察上述突变植株的表型，结果显示，在福州三亚两地，改良材料抽穗延迟20d左右。如图3-4。
本发明中利用crispr/cas9基因编辑技术获得oself3基因突变体，与talen和zfn技术相比，操作过程简单方便，节约成本，一般实验室都可操作，是一种快速获得晚花品系的分子育种方法。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>厦门大学，福建省农业科学院生物技术研究所
<120>一种基因编辑技术打靶oself3基因延长水稻抽穗的方法
<130>8
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