本发明涉及一种无筛选过程的高效豇豆遗传转化方法及其应用，属于农作物遗传转化技术领域。
背景技术
豇豆是重要的粮油兼用作物，也是目前转基因品种种植面积最大的作物之一。由于传统育种方法存在的局限性，使得转基因技术成为豇豆新品种培育的重要手段。
豇豆目前使用较为广泛的豇豆转化体系，以根癌农杆菌介导的子叶节转化体系和基因枪介导的愈伤组织转化体系为主。由于基因枪介导的愈伤组织转化受难于再生的限制，实际应用中主要还是采用根癌农杆菌介导的子叶节转化方法，转化体系周期长(通常是用发芽5天的种子制备外植体)、转化效率低，制约着豇豆分子育种的发展。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种无筛选过程的高效豇豆遗传转化方法及其应用，能克服现有技术的不足，能提高转化效率，取代现有使用筛选剂进行筛选的方法，增加豇豆转基因后续使用的安全性。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种无筛选过程的高效豇豆遗传转化方法，它包含以下步骤：
s1、构建豇豆遗传转化的载体质粒；
s2、将上述载体质粒中转化到农杆菌中，置于-60℃至-100℃保存；
s3、制备遗传转化前农杆菌重悬液：将上述农杆菌进行活化培养，挑取单克隆，27-29℃振荡培养过夜，该温度能较好的满足农杆菌的生存，进行pcr检测，阳性菌液送样测序，得到工程菌；
将工程菌涂板，27-29℃暗培养22-30h，待用；
取含工程菌的平板，刮取菌斑于侵染液中，吹打均匀，直至侵染液0d600在0.8-1.2，然后按照15-25mg/l的标准加入as(acetosyringone)，得到农杆菌重悬液，其中，侵染液ph4.5-5.5，能配合超声波辅助最大限度提高农杆菌侵染效率，农杆菌在该范围内具有较高的侵染效率；
s4、豇豆子叶节的准备：将豇豆种子萌发12-18h豇豆去除主芽，划伤子叶节，将具有创伤的豇豆子叶节作为外植体用于侵染；
s5、超声波辅助农杆菌侵染：将农杆菌重悬液倒入洁净的无菌培养瓶中,放入具有创伤的外植体，重悬液完全淹没外植体，匀速震荡0.5-3min，将消毒后的超声仪器探头置入重悬液中进行超声波处理，超声波频率35-50khz，处理2-5分钟，超声波处理对创伤的子叶节部位细胞产生空化效应，然后室温静置侵染0.5-2h；
s6、适度共培养：在灭菌后的培养皿中放入0.8-1.5mm厚的无菌滤纸或海绵，再加入1/20-1/10培养皿体积的液体共培养基，液体共培养基ph6.0-7.0，该ph能较好的抑制农杆菌不会过度生长，将侵染的豇豆子叶取出，盾片朝下，均匀置于滤纸或海绵上，透气封口后进行光周期为18-22/4-6h的500-800lx弱光交替恒温适度共培养4-7天，豇豆子叶节达到瞬时转化率不低于90％，温度22-26℃；
s7、子叶节再生：将共培养后的豇豆子叶节，创伤一端朝下，斜插入到芽诱导培养基中，控制温度26-32℃，光周期14-18/8-12h的4000-6000lx强光照培养10-15天；
待新生芽长出后，转接到新鲜的芽伸长培养基中，控制温度为26-32℃，光周期14-18/8-12h的4000-6000lx强光照继续培养10-15天；
其中，芽诱导培养基和芽伸长培养基ph均为6.0-7.0；
s8、转化苗生根及炼苗：将伸长3-4cm的幼芽切下，转接到生根培养基，控制温度为22-28℃，光周期14-18/8-12h的4000-6000lx强光照继续培养7-10天，待诱导出强壮的根后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽至育苗盘中，继续培养10-15天，将成活的幼苗移栽至大田或者温室即可。
所述的载体质粒为pcambia1301，所述的农杆菌为eha105，其感受态制备方法为现有cacl2化学法。
所述的菌种活化培养的过程为将含目的基因载体的农杆菌划线在lb培养基平板上27-29℃暗培养22-30h，lb培养基为固体或液体培养基；
其中，lb固体培养基包含以下重量份的原料：蛋白胨8-12份、酵母膏3-7份、nacl8-12份、琼脂粉12-18份；
lb液体培养基包含以下重量份的原料：蛋白胨8-12份、酵母膏3-7份、nacl8-12份。
所述的lb培养基为抗性lb液体培养基，在每mllb液体培养基中加入30-50ug抗生素均匀混合即可。
所述的侵染液以b5培养基为基础，还包括以下成分：蔗糖25-35g/l、mes3-5g/l、ga30.2-0.4mg/l、6-ba1-3mg/l、l-半胱氨酸300-500mg/l、dtt150-160mg/l。
所述的豇豆种子采用升汞法灭菌消毒，然后放在无菌培养皿中用无菌水浸泡萌发，其外植体制备方法如下：将吸胀的豇豆种子置于无菌吸水纸上，沿着种脐用手术刀纵向切割种子，将子叶和下胚轴均匀分开两瓣，去除种皮后，在子叶节部位用手术刀片尖端，轻划4-5下，造成创伤后，放置到有少量无菌水的培养皿里待用。
所述的适度共培养步骤中：在规格100mm的标准培养皿中放入3-5张9cm的无菌滤纸，再加入5-10ml的液体共培养基，然后透气封口后在600lx下光周期20/4h交替进行恒温培养5-7天，温度24-26℃，其中，规格100mm的标准培养皿的高度为20mm,生长面积55cm2,液体共培养基以b5培养基为基础，还包括以下成分：蔗糖25-35g/l、琼脂5-7g/l、ga30.2-0.4mg/l、6-ba1-3mg/l、l-半胱氨酸300-500mg/l、dtt150-160mg/l、as15-30mg/l。
所述的子叶节再生步骤中，芽诱导培养基以b5培养基为基础，还包含以下成分：蔗糖25-35g/l、mes0.5-0.7g/l、琼脂5-7g/l、6-ba1-3mg/l、羧苄青霉素300-500mg/l；
芽伸长培养基以ms培养基为基础，还包含以下成分：b5维他命5-10g/l、蔗糖25-35g/l、mes0.5-0.7g/l、琼脂5-7g/l、ga30.4-0.6mg/l、羧苄青霉素300-500mg/l、天冬氨酸40-60mg/l、l-脯氨酸80-120mg/l、iaa0.05-0.2mg/l、zt0.5-2mg/l、agno38-15mg/l，fena-edta10-20mg/l。
所述的转化苗生根及炼苗步骤中，生根培养基以ms培养基为基础，还包含以下成分：fena-edta10-20mg/l、蔗糖15-25g/l、mes0.5-0.7g/l、琼脂5-7g/l、naa0.3-0.7mg/l、iaa0.1-0.5mg/l、zt0.05-0.1mg/l。
一种无筛选过程的高效豇豆遗传转化方法在双子节叶植物上的应用。
本发明的有益效果在于：在农杆菌侵染阶段，切除其主芽，主芽在萌发一定时间后其内部细胞已经分化，不利用后续的侵染，利用双子节叶植物子叶具有较高的生物活性，因此本申请利用具有创伤的豇豆子叶作为外植体用于侵染，添加合适的超声波处理，可以对创伤的子叶节部位细胞产生空化效果，进而使子叶节细胞更容易被农杆菌侵染，利用gus报告基因，对共培养的子叶节进行显色反应，可以直观的观察到不同功率，不同时间超声波辅助处理后的子叶染色个数和面积，感染效率明显增加；
通过实验比较，使用适度共培养法，与传统固体培养基共培养法相比，适度共培养既可以保证豇豆子叶节具有更高的瞬时转化效率，同时也不会导致农杆菌过度生长，几乎没有农杆菌过度生长造成的细菌污染，再生阶段出芽率更高。
通过超声波辅助处理和适度共培养法，可以获得大量具有活性转化成功的细胞，从而使得再生出芽阶段，即使未添加筛选剂，仍然有不少的阳性细胞分化出小芽，进而伸长成一个幼苗，所以本发明在子叶再生阶段采用不添加筛选剂的方法，与添加筛选剂的方法相比，再生后仍有15％左右的幼芽为阳性；无添加筛选剂进行抗压筛选的遗传转化方法，可以使载体构建阶段不需要带有筛选标记基因，只需含有目的基因即可，当前使用的筛选标记一般为除草剂抗性基因和抗生素抗性基因，给转基因育种和生产带来了很大的不安全因素，由于筛选基因只在遗传转化阶段发挥作用，后续育种和生产并不需要，所以开发无筛选过程的转基因方法，可使增加豇豆转基因后续使用的安全性。
附图说明
图1为本发明实施例1豇豆子叶节侵染显色试验图；
图2为现有技术豇豆子叶节侵染显色试验图。
具体实施方式
下面结合实施例进一步描述本发明的技术方案，但要求保护的范围并不局限于所述。
实施例1
一种无筛选过程的高效豇豆遗传转化方法，它包含以下步骤：
s1、构建豇豆遗传转化的载体质粒，为了验证豇豆子叶的后期瞬时侵染率，该载体质粒包含gus报告基因的目的基因，该基因启动子为camv35s，终止子为nos；
s2、将上述载体质粒中转化到农杆菌中，置于-80℃保存；
s3、制备遗传转化前农杆菌重悬液：将上述农杆菌进行活化培养，挑取单克隆，28℃振荡培养过夜，进行pcr检测，阳性菌液送样测序，得到工程菌；
将工程菌涂板，28℃暗培养24h，待用；
取含工程菌的平板，刮取菌斑于侵染液中，吹打均匀，直至侵染液0d600在1.0，然后按照20mg/l的标准加入as，得到农杆菌重悬液，其中，侵染液ph5.0；
s4、豇豆子叶节的准备：将豇豆种子萌发16h豇豆去除主芽，划伤子节叶，将具有创伤的豇豆子叶作为外植体用于侵染；
s5、超声波辅助农杆菌侵染：在工程菌涂板后36h，将农杆菌重悬液倒入洁净的无菌培养瓶中,放入具有创伤的外植体，重悬液完全淹没外植体，匀速震荡1.5min，将消毒后的超声仪器探头置入重悬液中进行超声波处理，超声波频率40khz，处理3分钟，超声波处理对创伤的子叶节部位细胞产生空化效应，然后室温静置侵染1h；
s6、适度共培养：在灭菌后的培养皿中放入1.0mm厚的无菌滤纸，再加入1/10培养皿体积的液体共培养基，液体共培养基ph6.0，将侵染的豇豆子叶取出，盾片朝下，均匀置于滤纸上，透气封口后进行光周期为20/4h的600lx弱光交替恒温适度共培养5天，(光周期为20/4h的600lx弱光交替是指光20h/暗4h交替周期，光是指600lx弱光，下同)，豇豆子叶节达到瞬时转化率不低于90％，温度25℃；利用gus报告基因，可以对该实施例的子叶节进行显色反应，图1为实施例1超声波辅助处理后的子叶染色个数和面积，图2为现有技术中未经过超声波处理的子叶染色个数和面积，明显得可以看出，实施例1中的豇豆子叶染色个数和面积远远超过现有技术的处理效果。
s7、子叶节再生：将共培养后的豇豆子叶节，创伤一端朝下，斜插入到芽诱导培养基中，控制温度28℃，光周期16/8h的5500lx强光照培养12天；
待新生芽长出后，转接到新鲜的芽伸长培养基中，控制温度为28℃，光周期16/8h的5500lx强光照继续培养15天；
其中，芽诱导培养基和芽伸长培养基ph均为6.0；
s8、转化苗生根及炼苗：将伸长3cm的幼芽切下，转接到生根培养基，控制温度为25℃，光周期16/8h的5500lx强光照继续培养7天，待诱导出强壮的根后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽至育苗盘中，继续培养15天，将成活的幼苗移栽至大田即可。
所述的载体质粒为pcambia1301，所述的农杆菌为eha105，其感受态制备方法为现有cacl2化学法。
实施例2
一种无筛选过程的高效豇豆遗传转化方法，它包含以下步骤：
s1、构建豇豆遗传转化的载体质粒；
s2、将上述载体质粒中转化到农杆菌中，置于-60℃保存；
s3、制备遗传转化前农杆菌重悬液：将上述农杆菌进行活化培养，挑取单克隆，27℃振荡培养过夜，进行pcr检测，阳性菌液送样测序，得到工程菌；
将工程菌涂板，27℃暗培养22h，待用；
取含工程菌的平板，刮取菌斑于侵染液中，吹打均匀，直至侵染液0d600在0.8，然后按照15mg/l的标准加入as，得到农杆菌重悬液，其中，侵染液ph4.5；
s4、豇豆子叶节的准备：将豇豆种子萌发12h豇豆去除主芽，划伤子节叶，将具有创伤的豇豆子叶作为外植体用于侵染；
s5、超声波辅助农杆菌侵染：在工程菌涂板后48h，将农杆菌重悬液倒入洁净的无菌培养瓶中,放入具有创伤的外植体，重悬液完全淹没外植体，匀速震荡1min，将消毒后的超声仪器探头置入重悬液中进行超声波处理，超声波频率35khz，处理2分钟，超声波处理对创伤的子叶节部位细胞产生空化效应，然后室温静置侵染1.5h；
s6、适度共培养：在灭菌后的培养皿中放入0.8mm厚的无菌海绵，再加入1/20培养皿体积的液体共培养基，液体共培养基ph6.5，将侵染的豇豆子叶取出，盾片朝下，均匀置于海绵上，透气封口后进行光周期为18/6h的500lx弱光交替恒温适度共培养4天，豇豆子叶节达到瞬时转化率不低于90％，温度22℃；
s7、子叶节再生：将共培养后的豇豆子叶节，创伤一端朝下，斜插入到芽诱导培养基中，控制温度26℃，光周期14/10h的5000lx强光照培养15天；
待新生芽长出后，转接到新鲜的芽伸长培养基中，控制温度为26℃，光周期14/10h的5000lx强光照继续培养10天；
其中，芽诱导培养基和芽伸长培养基ph均为6.5；
s8、转化苗生根及炼苗：将伸长4cm的幼芽切下，转接到生根培养基，控制温度为22℃，光周期14/10h的5000lx强光照继续培养10天，待诱导出强壮的根后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽至育苗盘中，继续培养10天，将成活的幼苗移栽至温室即可。
所述的载体质粒为pcambia1301，所述的农杆菌为eha105，其感受态制备方法为现有cacl2化学法。
实施例3
一种无筛选过程的高效豇豆遗传转化方法，它包含以下步骤：
s1、构建豇豆遗传转化的载体质粒；
s2、将上述载体质粒中转化到农杆菌中，置于-100℃保存；
s3、制备遗传转化前农杆菌重悬液：将上述农杆菌进行活化培养，挑取单克隆，29℃振荡培养过夜，进行pcr检测，阳性菌液送样测序，得到工程菌；
将工程菌涂板，29℃暗培养26h，待用；
取含工程菌的平板，刮取菌斑于侵染液中，吹打均匀，直至侵染液0d600在1.2，然后按照25mg/l的标准加入as，得到农杆菌重悬液，其中，侵染液ph5.5；
s4、豇豆子叶节的准备：将豇豆种子萌发18h豇豆去除主芽，划伤子节叶，将具有创伤的豇豆子叶作为外植体用于侵染；
s5、超声波辅助农杆菌侵染：在工程菌涂板后60h，将农杆菌重悬液倒入洁净的无菌培养瓶中,放入具有创伤的外植体，重悬液完全淹没外植体，匀速震荡0.5min，将消毒后的超声仪器探头置入重悬液中进行超声波处理，超声波频率50khz，处理5分钟，超声波处理对创伤的子叶节部位细胞产生空化效应，然后室温静置侵染0.5h；
s6、适度共培养：在灭菌后的培养皿中放入1.2mm厚的无菌滤纸，再加入1/15培养皿体积的液体共培养基，液体共培养基ph7.0，将侵染的豇豆子叶取出，盾片朝下，均匀置于滤纸上，透气封口后进行光周期为22/5h的800lx弱光交替恒温适度共培养7天，豇豆子叶节达到瞬时转化率不低于90％，温度26℃；
s7、子叶节再生：将共培养后的豇豆子叶节，创伤一端朝下，斜插入到芽诱导培养基中，控制温度32℃，光周期18/8h的4000lx强光照培养10天；
待新生芽长出后，转接到新鲜的芽伸长培养基中，控制温度为32℃，光周期18/8h的4000lx强光照继续培养10天；
其中，芽诱导培养基和芽伸长培养基ph均为7.0；
s8、转化苗生根及炼苗：将伸长3.5cm的幼芽切下，转接到生根培养基，控制温度为28℃，光周期18/8h的4000lx强光照继续培养8天，待诱导出强壮的根后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽至育苗盘中，继续培养12天，将成活的幼苗移栽至温室即可。
实施例4
一种无筛选过程的高效豇豆遗传转化方法，它包含以下步骤：
s1、构建豇豆遗传转化的载体质粒；
s2、将上述载体质粒中转化到农杆菌中，置于-75℃保存；
s3、制备遗传转化前农杆菌重悬液：将上述农杆菌进行活化培养，挑取单克隆，28℃振荡培养过夜，进行pcr检测，阳性菌液送样测序，得到工程菌；
将工程菌涂板，28℃暗培养30h，待用；
取含工程菌的平板，刮取菌斑于侵染液中，吹打均匀，直至侵染液0d600在1.0，然后按照22mg/l的标准加入as，得到农杆菌重悬液，其中，侵染液ph5.0；
s4、豇豆子叶节的准备：将豇豆种子萌发15h豇豆去除主芽，划伤子节叶，将具有创伤的豇豆子叶作为外植体用于侵染；
s5、超声波辅助农杆菌侵染：在工程菌涂板后42h，将农杆菌重悬液倒入洁净的无菌培养瓶中,放入具有创伤的外植体，重悬液完全淹没外植体，匀速震荡3min，将消毒后的超声仪器探头置入重悬液中进行超声波处理，超声波频率38khz，处理4分钟，超声波处理对创伤的子叶节部位细胞产生空化效应，然后室温静置侵染2h；
s6、适度共培养：在灭菌后的培养皿中放入1.5mm厚的无菌滤纸，再加入1/10培养皿体积的液体共培养基，液体共培养基ph6.0，将侵染的豇豆子叶取出，盾片朝下，均匀置于滤纸上，透气封口后进行光周期为20/4h的600lx弱光交替恒温适度共培养6天，豇豆子叶节达到瞬时转化率不低于90％，温度24℃；
s7、子叶节再生：将共培养后的豇豆子叶节，创伤一端朝下，斜插入到芽诱导培养基中，控制温度28℃，光周期15/12h的6000lx强光照培养10天；
待新生芽长出后，转接到新鲜的芽伸长培养基中，控制温度为28℃，光周期15/12h的6000lx强光照继续培养12天；
其中，芽诱导培养基和芽伸长培养基ph均为6.0；
s8、转化苗生根及炼苗：将伸长3cm的幼芽切下，转接到生根培养基，控制温度为24℃，光周期15/12h的6000lx强光照继续培养10天，待诱导出强壮的根后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽至育苗盘中，继续培养10天，将成活的幼苗移栽至温室即可。
实施例5
一种无筛选过程的高效豇豆遗传转化方法，它包含以下步骤：
s1、构建豇豆遗传转化的载体质粒；
s2、将上述载体质粒中转化到农杆菌中，置于-65℃保存；
s3、制备遗传转化前农杆菌重悬液：将上述农杆菌进行活化培养，挑取单克隆，27.5℃振荡培养过夜，进行pcr检测，阳性菌液送样测序，得到工程菌；
将工程菌涂板，27℃暗培养25h，待用；
取含工程菌的平板，刮取菌斑于侵染液中，吹打均匀，直至侵染液0d600在1.2，然后按照18mg/l的标准加入as，得到农杆菌重悬液，其中，侵染液ph4.8；
s4、豇豆子叶节的准备：将豇豆种子萌发16h豇豆去除主芽，划伤子节叶，将具有创伤的豇豆子叶作为外植体用于侵染；
s5、超声波辅助农杆菌侵染：在工程菌涂板后54h，将农杆菌重悬液倒入洁净的无菌培养瓶中,放入具有创伤的外植体，重悬液完全淹没外植体，匀速震荡2min，将消毒后的超声仪器探头置入重悬液中进行超声波处理，超声波频率42khz，处理3分钟，超声波处理对创伤的子叶节部位细胞产生空化效应，然后室温静置侵染1.5h；
s6、适度共培养：在灭菌后的培养皿中放入1.2mm厚的无菌滤纸，再加入1/15培养皿体积的液体共培养基，液体共培养基ph6.5，将侵染的豇豆子叶取出，盾片朝下，均匀置于滤纸上，透气封口后进行光周期为18/6h的800lx弱光交替恒温适度共培养5天，豇豆子叶节达到瞬时转化率不低于90％，温度25℃；
s7、子叶节再生：将共培养后的豇豆子叶节，创伤一端朝下，斜插入到芽诱导培养基中，控制温度30℃，光周期16/10h的5000lx强光照培养12天；
待新生芽长出后，转接到新鲜的芽伸长培养基中，控制温度为30℃，光周期16/10h的5000lx强光照继续培养10天；
其中，芽诱导培养基和芽伸长培养基ph均为6.5；
s8、转化苗生根及炼苗：将伸长4cm的幼芽切下，转接到生根培养基，控制温度为25℃，光周期16/10h的5000lx强光照继续培养7天，待诱导出强壮的根后，取出幼苗，洗净根部培养基，移栽至育苗盘中，继续培养15天，将成活的幼苗移栽至大田即可。
分别将实施例1-5中选取50粒种子，重复三次试验，观察到不同功率，不同时间超声波辅助处理后的子叶染色个数和面积，其余步骤相同，主要差异在于超声处理条件(超声处理后，静置相同时间后进行对比)，试验结果如下：
可见，由于超声波处理对创伤的子叶节部位细胞产生空化效应，使得豇豆子叶节瞬时转化效率有了大幅度的提高，在35-50khz的频率之间效果最为明显，通过实验比较，使用适度共培养法，与传统固体培养基共培养法相比，适度共培养既可以保证豇豆子叶节具有更高的瞬时转化效率，同时也不会导致农杆菌过度生长，几乎没有农杆菌过度生长造成的细菌污染，再生阶段出芽率更高。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。