本发明涉及多糖结构鉴定领域，具体涉及一种用于多糖甲基化反应的自动化仪器及其使用方法。
背景技术：
越来越多的研究证明多糖具有复杂的多方面的生物活性和功能,特别是对机体免疫功能的作用。多糖不但能治疗机体的免疫系统受到产重损伤的癌症,又能治疗多种免疫缺损疾病如慢性病毒性肝炎和某些耐药细菌或病毒引起的慢性疾病,而且多糖作为药物其细胞毒极小。因此，对多糖的结构分析技术亟需探讨研究。
多糖的结构分析中的甲基化分析方法是分析多糖结构必不可少的方法。多糖甲基化反应方程式为：
甲基化分析方法的步骤是先将多糖(或配糖体中糖部分)中各种单糖残基的游离羟基转化为甲氧基,进而酸水解成各种甲基化的单糖。迄今各国常用的甲基化仍然是以hakomori法为基础再加以改良。先将样品溶解于无水二甲基亚砜中。可用超声波或磁力搅拌加热以加速溶解并使完全溶解于无水二甲基亚砜中,否则将导致不完全甲基化。样品完全溶解于无水二甲基亚砜后,与甲基亚磺酰甲基钠反应。制备甲基亚磺酰甲基钠时尤应严格控制温度,过高可加速分解,过低则反应速度太慢,然后与碘甲烷反应。反应结束时,必须将剩余碘甲烷除尽,以免影响下一步的还原反应。
要使甲基化反应完全,关键有两点:(1)样品与试剂均应干燥;(2)反应要在氮气压下进行。反应混合物经上述步骤后,用自来水透析过夜(透析袋要经预处理)。透析液或萃取液冷冻干燥或减压浓缩至干,即得全甲基化样品。全甲基化样品经ir分析在3500cm-1附近无吸收峰，则多糖上羟基已完全甲基化。
目前进行多糖甲基化反应，操作复杂不便，耗时久，且碘甲烷试剂对人员有身体伤害，人工操作易引入人员误差及环境所引起的试剂污染。这种情况使多糖的研究进程带来时间与精力的诸多损耗，故急需一种用于多糖甲基化反应的自动化仪器，以实现对多糖甲基化反应的连续、准确、安全的实验操作。
技术实现要素：
本发明克服现有缺陷提供一种用于多糖甲基化反应的自动化仪器及其使用方法，用微量注射泵自动输送反应液至锥形瓶中，然后通过锥形瓶下的磁力加热搅拌器，对反应液进行搅拌加热；同时通过蠕动泵转移多糖反应液，通过氮气输送装置的氮气驱尽瓶内空气，通过组合一系列自动化装置，组成一个可以自动连续操作的多糖甲基化反应装置，进而得到甲基化多糖产物。
一种用于多糖甲基化反应的连续操作过程的自动化仪器，包括设有三根注射器的自动微量注射泵，其中的两根注射器并联接入第一锥形瓶内、剩余的一根注射器与第二锥形瓶连通，所述的第一、第二锥形瓶之间通过导管相互连通，所述第二锥形瓶上设有出气口，第一锥形瓶上设有进气口，所述进气口与氮气输送装置连通，还包括将第二锥形瓶内的液体吸入第一锥形瓶内的蠕动泵，所述第一、第二锥形瓶、放置在磁力加热搅拌器上。
本发明进一步的改进方案是，所述第二锥形瓶的底部连通有出液管，所述出液管的出口与所述蠕动泵的进口连接，所述第一锥形瓶的瓶体上连通有进液管，所述进液管的进口与所述蠕动泵的出口相连。
本发明进一步的改进方案是，所述氮气输送装置包括氮气瓶，氮气瓶通过导管与第一锥形瓶连通，所述导管上由前至后依次设有开关阀、稳压阀、流量表，氮气瓶和第一锥形瓶之间的导管为设有球形干燥剂的导管，所述的球形干燥剂位于所述流量表的下游。
本发明进一步的改进方案是，所述第一、第二锥形瓶之间的导管上设有球形干燥剂且该球形干燥剂下游的导管上设有截止阀，所述第二锥形瓶的出气口上连接有带有球形干燥剂的出气管，所述出气管的出口处设有截止阀。
本发明进一步的改进方案是，并联的两根注射器分别通过第一输液管与主输液管连通，剩余的一根注射器通过第二输液管与第二锥形瓶连通，所述主输液管与所述第一锥形瓶连通。
本发明进一步的改进方案是，两根第一输液管上设有截止阀。
本发明进一步的改进方案是，所述第一锥形瓶和第二锥形瓶的瓶体上部开设有反应液进液口，所述的反应液进液口上塞有橡皮塞，所述主输液管和第二输液管的末端连接有金属针头，两个金属针头的前端穿过对应的橡皮塞分别进入第一、第二锥形瓶内。
本发明进一步的改进方案是，所述第一、第二锥形瓶内放置有3*5mm的微型搅拌子，第一、第二锥形瓶的瓶口塞有橡皮塞。
用于多糖甲基化反应的连续操作过程的自动化仪器的使用方法：
并联的两根注射管内分别装有无水二甲基亚砜和碘甲烷，剩余的一根注射管内装有无水二甲基亚砜，首先在第二锥形瓶内投放定量的干燥多糖样品，控制微量注射泵上与第二锥形瓶连通的注射管使其内部的无水二甲基亚砜匀速滴入第二锥形瓶内，开启氮气输送装置将第一、第二锥形瓶内空气排出并使第二锥形瓶内充满氮气，再打开第二锥形瓶底部的磁力加热搅拌器，搅拌时间为3～4h、加热温度为50～55℃，使干燥多糖样品加速完全溶于无水二甲基亚砜形成多糖反应液；
然后在第一锥形瓶内投放定量的干燥氢氧化钠粉末，控制微量注射泵上并联的两根注射器中装有无水二甲基亚砜的注射器使其内部的无水二甲基亚砜匀速滴入第一锥形瓶内，然后开启第一锥形瓶底部的磁力加热搅拌器，搅拌时间3～4h、加热温度为55～60℃，使干燥的氢氧化钠粉末加速完全溶于无水二甲基亚砜后形成甲基亚磺酰甲基钠反应液；随后开启蠕动泵将第二锥形瓶内的多糖反应液转移至第一锥形瓶内，控制微量注射泵上并联的两根注射器中装有碘甲烷的注射器使其内部的碘甲烷匀速滴入第一锥形瓶内，继续搅拌加热2.5h至反应完成。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
本发明是在封闭环境中通过利用自动微量注射泵注射反应液、氮气输送装置通入氮气、磁力搅拌器搅拌及加热以加速反应速度，能够制备二甲基亚砜碳负离子、蠕动泵转移多糖反应液、碘甲烷加入混合液并最终达到多糖甲基化的目的，使反应体系隔绝空气而得到完全甲基化多糖产物。该装置能减少人工操作，避免人员受到碘甲烷伤害和外在环境的污染、安全完成多糖的甲基化反应。
本发明中的微量注射泵可通过控制器的指令，在预设程序的控制下，对液体试样按设置的速度进行输送注射，能高精度控制液体滴入的速度和体积，同时避免手工操作引起的体积误差和可能的外来污染。
本发明通过合理的工程设计，将自动微量注射泵、氮气输送装置、和甲基化反应的设备三个独立的实验装置整合到一个操作仪器中，实现无交叉污染，整合后的仪器大大减轻了操作人员的劳动强度，减少了人工操作过程中的失误和感染，加强了多糖甲基化反应的安全性、准确度，加快了多糖甲基化反应进程。另外，整合后的仪器，各个装置安置合理，空间利用度高，且多数操作过程由软件和控制器完成，自动完成多糖的甲基化反应操作，节省了实验人员的时间和精力，使多糖的甲基化反应操作变得轻松、简便。
附图说明
图1为本发明整体示意图。
图2为本发明局部示意图。
具体实施方式
下面结合附图1至2对本发明做进一步说明。
一种用于多糖甲基化反应的连续操作过程的自动化仪器，包括设有三根注射器2的自动微量注射泵1，其中的两根注射器2并联接入第一锥形瓶3内、剩余的一根注射器2与第二锥形瓶4连通，所述的第一、第二锥形瓶3、4之间通过导管相互连通，所述第二锥形瓶4上设有出气口5，第一锥形瓶3上设有进气口6，所述进气口6与氮气输送装置7连通，还包括将第二锥形瓶4内的液体吸入第一锥形瓶3内的蠕动泵8，所述第一、第二锥形瓶3、4放置在磁力加热搅拌器9上。
第二锥形瓶4的底部连通有出液管10，所述出液管10的出口与所述蠕动泵8的进口连接，所述第一锥形瓶3的瓶体上连通有进液管11，所述进液管11的进口与所述蠕动泵8的出口相连。
氮气输送装置7包括氮气瓶12，氮气瓶12通过导管与第一锥形瓶3连通，所述导管上由前至后依次设有开关阀22、稳压阀14、流量表15，氮气瓶12和第一锥形瓶3之间的导管为设有球形干燥剂16的导管，所述的球形干燥剂16位于所述流量表15的下游。
第一、第二锥形瓶3、4之间的导管上设有球形干燥剂16且该球形干燥剂16下游的导管上设有截止阀13，所述第二锥形瓶4的出气口上连接有带有球形干燥剂16的出气管17，所述出气管17的出口处设有截止阀13。
并联的两根注射器2分别通过第一输液管18与主输液管23连通，剩余的一根注射器2通过第二输液管19与第二锥形瓶4连通，所述主输液管23与所述第一锥形瓶3连通。
两根第一输液管18上设有截止阀16。
第一锥形瓶3和第二锥形瓶4的瓶体上部开设有反应液进液口，所述的反应液进液口上塞有橡皮塞20，所述主输液管23和第二输液管19的末端连接有金属针头21，两个金属针头21的前端穿过对应的橡皮塞分别进入第一、第二锥形瓶3、4内。
第一、第二锥形瓶内放置有3*5mm的微型搅拌子24，第一、第二锥形瓶的瓶口塞有橡皮塞20。
用于多糖甲基化反应的连续操作过程的自动化仪器的使用方法：
并联的两根注射管2内分别装有无水二甲基亚砜和碘甲烷，剩余的一根注射管2内装有无水二甲基亚砜，首先在第二锥形瓶4内投放定量的干燥多糖样品，控制微量注射泵1上与第二锥形瓶连通的注射管2使其内部的无水二甲基亚砜匀速滴入第二锥形瓶4内，开启氮气输送装置7将第一、第二锥形瓶内空气排出并使第二锥形瓶内充满氮气，再打开第二锥形瓶4底部的磁力加热搅拌器9，搅拌时间为3～4h、加热温度为50～55℃，使干燥多糖样品加速完全溶于无水二甲基亚砜形成多糖反应液；
然后在第一锥形瓶3内投放定量的干燥氢氧化钠粉末，控制微量注射泵1上并联的两根注射器2中装有无水二甲基亚砜的注射器使其内部的无水二甲基亚砜匀速滴入第一锥形瓶3内，然后开启第一锥形瓶3底部的磁力加热搅拌器9，搅拌时间3～4h、加热温度为55～60℃，使干燥的氢氧化钠粉末加速完全溶于无水二甲基亚砜后形成甲基亚磺酰甲基钠反应液；随后开启蠕动泵8将第二锥形瓶4内的多糖反应液转移至第一锥形瓶3内，控制微量注射泵1上并联的两根注射器中装有碘甲烷的注射器2使其内部的碘甲烷匀速滴入第一锥形瓶3内，继续搅拌加热2.5h至反应完成。
实施例1：圆田螺多糖样品的甲基化
并联的两根注射管2内分别装有无水二甲基亚砜和碘甲烷，剩余的一根注射管2内装有无水二甲基亚砜，也就是上中下三根注射管内分别装有无水二甲基亚砜、碘甲烷、无水二甲基亚砜；从第二锥形瓶4的开口处加入2mg经纯化分离后的圆田螺多糖样品和3*5mm微型搅拌子24，从第一锥形瓶3的开口处加入10mg干燥研磨的氢氧化钠粉末和3*5mm微型搅拌子24。
打开氮气输送装置的开关阀22、调节稳压阀14向反应装置输送氮气15分钟后关闭开关阀22，将第一、第二锥形瓶内空气排出并使反应液隔离空气，设置注射泵的注射参数，开启上侧注射管的截止阀，关闭中部注射管的截止阀，将上注射器和下注射器内的无水二甲基亚砜以速度为0.5ml/min分别注射3ml进入第一、第二锥形瓶内；设置第二锥形瓶下的搅拌器温度为55℃、搅拌速度为1000r/min，搅拌时间为4.5h；第一锥形瓶下的搅拌器设置温度为60℃，搅拌速度为1000r/min，搅拌时间为4.5h；
搅拌结束后，第二锥形瓶4内生成多糖反应液，通过蠕动泵将该多糖反应液转移至第一锥形瓶3内，设置搅拌器参数，即第一锥形瓶下方的搅拌器关闭温度开关，设置搅拌速度为1000r/min，搅拌2h后，打开中部注射器的截止阀，关闭上侧注射器的截止阀，开启中部的注射器，使其内部的碘甲烷以流速0.025ml/min滴入第一锥形瓶3的混合反应液中，继续搅拌2.5h后停止。最后收集甲基化多糖产物，用蒸馏水透析24h，减压浓缩后冷冻干燥，得到圆田螺甲基化多糖衍生物，产率为93.5%±0.5%。
实施例2：铁皮石斛多糖样品的甲基化
并联的两根注射管2内分别装有无水二甲基亚砜和碘甲烷，剩余的一根注射管2内装有无水二甲基亚砜，也就是上中下三根注射管内分别装有无水二甲基亚砜、碘甲烷、无水二甲基亚砜；从第二锥形瓶4的开口处加入2mg经纯化分离后的铁皮石斛多糖样品和3*5mm微型搅拌子24，从第一锥形瓶3的开口处加入10mg干燥研磨的氢氧化钠粉末和3*5mm微型搅拌子24。
打开氮气输送装置的开关阀22、调节稳压阀14向反应装置输送氮气15分钟后关闭开关阀22，将第一、第二锥形瓶内空气排出并使反应液隔离空气，设置注射泵的注射参数，开启上侧注射管的截止阀，关闭中部注射管的截止阀，将上注射器和下注射器内的无水二甲基亚砜以速度为0.5ml/min分别注射3ml进入第一、第二锥形瓶内；设置第二锥形瓶下的搅拌器温度为55℃、搅拌速度为1000r/min，搅拌时间为4.5h；第一锥形瓶下的搅拌器设置温度为60℃，搅拌速度为1000r/min，搅拌时间为4.5h；
搅拌结束后，第二锥形瓶4内生成多糖反应液，通过蠕动泵将该多糖反应液转移至第一锥形瓶3内，设置搅拌器参数，即第一锥形瓶下方的搅拌器关闭温度开关，设置搅拌速度为1000r/min，搅拌2h后，打开中部注射器的截止阀，关闭上侧注射器的截止阀，开启中部的注射器，使其内部的碘甲烷以流速25μl/min滴入第一锥形瓶3的混合反应液中，继续搅拌2.5h后停止。最后收集甲基化多糖产物，用蒸馏水透析24h，减压浓缩后冷冻干燥，得到圆田螺甲基化多糖衍生物，产率为91.4%±0.9%。