本发明涉及靶向wt1的的嵌合抗原受体t细胞及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
传统的肿瘤治疗手段如手术、放化疗使恶性肿瘤患者的生存期和生存质量得到了很大改善，但存在毒副作用大、治疗效果难以进一步提高等诸多问题。近几年在细胞过继治疗领域的发展也取得令人瞩目的成果，在act治疗领域中，研究最大的热点是基因修饰的抗原特异性t细胞过继治疗。单纯t细胞过继免疫治疗的诸多缺陷：缺少免疫原性强、特异性高的抗原，存在免疫逃逸，肿瘤的异质性，肿瘤微环境的免疫抑制。利用靶向cd19和cd20修饰的t细胞进行过继输注，治疗血液系统恶性肿瘤是目前临床研究的热点。
car(chimericantigenreceptor，嵌合抗原受体)由抗原识别区，铰链区，跨膜区和信号传导区组成。目前对car的结构设计主要集中在：胞外抗原的完善，铰链区的长短和空间构象的研究；信号转导和共刺激分子序列的改进等的探究。旨在构造一种更加安全，靶向性更好，作用更加持久，副作用更小，功能更加完善的car的结构。
wt1基因，1972年首次由knudson和strong发现其是定位于11号染色体短臂，长约50kb，有10个外显子，转录产物长约3kb的基因。wt1蛋白的主要功能是调节基因的转录，可以抑制胰岛素样生长因子ⅱ、集落刺激因子、pax2血小板衍生生长因子a(pdgf-a)和转化生长因子β1(tgfβ1)等多种生长因子及受体基因的转录。如果wt1基因突变功能丧失，可使细胞继续分裂，而失去正常分化，导致癌变。因此，wt1基因启动子的突变在wilms'瘤的发生发张中发挥着不可替代的作用。
wt1基因具有组织特异性，主要在胎儿肾脏、睾丸及卵巢等组织中表达，同时还参与人类的造血调控，参与造血细胞增殖、分化、凋亡等各个过程的调控。在白血病的形成中也发挥一定作用，已有人发现wt1基因在多种白血病中均有异常高表达。1992年miwa等首先报道了70％～80％的急性白血病患者中wt1高度表达。随后，miyagi等检测到wtl在急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，aml)、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征异常地表达。wt1在胎脾脏细胞及造血祖细胞中高度表达，在分化过程中与许多在造血细胞增殖、分化及凋亡中起重要作用的因子相互作用。gaidzik等检测了617例aml患者，其中78例(12.6％)被鉴定存在wtl突变，并且wtl突变的往往年龄更小、乳酸脱氢酶水平较高、白细胞数较高、完全缓解率更低、更容易复发、预后差。目前wtl已经成为一个患者复发和存活的独立的预测指标，在预测复发方面要优于疾病的分期。
近年来，wt1已经成为白血病基因治疗和特异性免疫治疗的新靶点，用于制备白血病疫苗、白血病细胞的体内抗原特异性治疗及体外净化，利用反义rna技术进行反义基因治疗也得到了较快发展。因此，wt1作为多种肿瘤细胞的高表达抗原，可作为car-t细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。
技术实现要素：
为了克服现有技术中的不足，本发明提供了一种靶向wt1的嵌合抗原受体t细胞(antiwt1car-t细胞)，该t细胞经过修饰和改造得到，能够特异性识别和杀伤wt1高表达的肿瘤细胞。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种靶向wt1的嵌合抗原受体，具体技术方案如下：
一种靶向wt1的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含顺序串联的抗原结合区scfv和信号传导区cd28-cd3ζ；其氨基酸序列如seqidno.1所示。
上述嵌合抗原受体中，所述抗原结合区scfv的氨基酸序列如seqidno.2所示。
上述嵌合抗原受体中，所述cd28的氨基酸序列如seqidno.3所示。
上述嵌合抗原受体中，所述cd3ζ的氨基酸序列如seqidno.4所示。
上述嵌合抗原受体中，所述抗原结合区scfv位于胞膜，信号传导区cd28-cd3ζ跨膜并且部分位于胞内。
本发明还提供了一种核酸分子，其编码上述嵌合抗原受体。
优选的，所述核酸分子的核苷酸序列如seqidno.5所示。
本发明还提供了一种载体，其包括上述核酸分子。
优选的，所述载体为是慢病毒表达载体。
本发明还提供了一种靶向wt1的嵌合抗原受体t细胞，其表达上述嵌合抗原受体。
本发明还提供了上述嵌合抗原受体t细胞在制备检测、预防和治疗癌症药物中的用途。
上述用途中，所述癌症为表达wt1的癌症，优选的，所述癌症为表达wt1的慢性骨髓性白血病和淋巴瘤。所述白血病为慢性骨髓性白血病。
本发明的靶向wt1的嵌合抗原受体t细胞可以按以下方法制备，具体包括以下步骤：
1)合成、扩增靶向wt1的嵌合抗原受体表达基因，构建表达靶向wt1的嵌合抗原受体的表达载体，所述表达载体可以为慢病毒表达载体；
2)利用慢病毒包装质粒和所述慢病毒表达载体感染t细胞，优选，293t细胞，得到慢病毒；
3)分离t淋巴细胞，并用所述慢病毒感染所述t淋巴细胞，获得所述靶向wt1嵌合抗原受体t细胞。
所述合成和扩增靶向wt1的嵌合抗原受体表达基因的方法可按照本领域常规技术手段获得。
上述方法中，进一步地，还包括对所述慢病毒进行纯化，并用所述纯化后的慢病毒感染所述t淋巴细胞。一般的，该纯化手段可以使用本领域常规手段进行，例如过滤、超滤等。
本发明的有益效果：
1、本发明提供了一种靶向wt1的嵌合抗原受体，所述受体可用于antiwt1car-t细胞的构建，所述靶向wt1的嵌合抗原受体结构简单但是对wt1蛋白进行有效结合，能简单、有效的制备具有特异性识别和杀伤肿瘤的antiwt1car-t细胞。
2、本发明提供的靶向wt1的的嵌合抗原受体t细胞对于表达wt1的癌细胞具有高效的肿瘤杀伤活性，尤其是对于表达wt1的癌症，例如于表达wt1的慢性骨髓性白血病和淋巴瘤。
附图说明
图1为anti-wt1car慢病毒表达载体结构图谱。
图2为靶向wt1嵌合抗原受体t细胞以及未感染的t细胞在5:1效靶比时对wt1高表达靶细胞k562的杀伤效果随时间变化的曲线图。
图3为靶向wt1嵌合抗原受体t细胞以及未感染的t细胞在4h时不同效靶比对wt1高表达靶细胞k562的杀伤效果图。
图4为靶向wt1嵌合抗原受体t细胞以及未感染的t细胞在5:1效靶比时对wt1高表达靶细胞raji的杀伤效果随时间变化的曲线图。
图5为靶向wt1嵌合抗原受体t细胞以及未感染的t细胞在4h时不同效靶比对wt1高表达靶细胞raji的杀伤效果图。
图6为antiwt1car-t细胞、t细胞以及肿瘤对照组对治疗k562移植瘤模型小鼠后的小鼠生存期曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1靶向wt1嵌合抗原受体t细胞的制备
1、构建慢病毒表达载体
含有编码编码cd28-cd3ζ的核酸片段(bamhi-sp-ecori-nhei-cd28-cd3zeta-sali，由中美泰和生物技术(北京)有限公司合成)，如seqidno.6所示，命名为pgsi-seq8。用bamhi和sali限制性内切酶分别双酶切3ugpgsi-seq8和重组慢病毒载体质粒pcdh-ef1(addgene公司)，酶切产物胶回收后用t4dna连接酶连接，4℃连接过夜，转化dh5α感受态细胞，取100μl菌液涂布至含有氨苄抗性的lb板上，37℃过夜培养。挑取单克隆进行菌落pcr，将阳性克隆送样测序，保存测序结果正确的克隆并提取质粒，命名为pcdh-ef1-emcar。
优化合成含有酶切位点5’端酶切位点ecori和3’端酶切位点nhei的编码scfv-antiwt1的核苷酸序列(要求不含bamhi、ecori、nhei和sali酶切位点，中美泰和生物技术(北京)有限公司合成)，如seqidno.7所示，命名为pgsi-seq12。
用ecori和nhei限制性内切酶分别双酶切3ugpgsi-seq12和骨架质粒pcdh-ef1-emcar，酶切产物胶回收后用t4dna连接酶连接，4℃连接过夜，转化dh5α感受态细胞，取100μl菌液涂布至含有氨苄抗性的lb板上，37℃过夜培养。挑取单克隆进行菌落pcr，将阳性克隆送样测序，保存测序结果正确的克隆并提取质粒，命名为anti-wt1car载体，载体图谱如图1所示。
2、慢病毒包装
从液氮中取出1支冻存的293t细胞迅速放到37℃水浴中直至冰块消失，逐滴加入含有5ml预热培养基的15ml离心管中，1200rpm离心3min，弃上清，用293t培养基(10％fbs+dmem)重悬细胞接种至150mm培养皿中，37℃、5％co2饱和湿度培养。
待细胞汇合度达90％以上时，弃去旧培养基，加入5ml灭菌pbs溶液，轻轻晃动，洗涤细胞后弃去pbs溶液，加入2ml0.25％trypsin-edta消化液，消化1-2min直到细胞完全消化下来。加入含血清的培养基终止消化，细胞悬液1200rpm离心3min，离心所得细胞用培养基重悬，每个150mm培养皿细胞接种1.2×107细胞用于包装慢病毒，37℃、5％co2饱和湿度培养，20ml培养基/皿。
转染前2h，将293t细胞培养基更换为18mldmem培养基，向a灭菌离心管中加入1ml预热的dmem培养基，然后加入所制备的anti-wt1car载体质粒、phelper1质粒和phelper2质粒(anti-wt1car载体质粒：phelper1：phelper2的质量比＝1：1：1，共54μg，phelper1和phelper2质粒为慢病毒包装的辅助质粒)，混合均匀。向b灭菌离心管中加入1ml预热的dmem培养基，然后加入108μllipofectamin2000(脂质体)溶液，混合均匀。a管和b管在室温下温育5分钟。将b管中的液体成滴的加入到a管中，混合均匀，室温孵育20min，得到dna-脂质体转染复合物。
将dna-脂质体转染复合物转移至预先换液的293t细胞中，混匀，37℃、5％co2饱和湿度培养。培养6-8h后吸弃含有转染混和物的培养基，每皿细胞加入20ml预热的含5％fbs的dmem培养基，37℃、5％co2饱和湿度培养，得到携带anti-wt1car序列的慢病毒(anti-wt1car)。
3、慢病毒纯化
换液后分别在24h和48h，收集上清液暂存储于4℃，并换20ml新鲜培养基。将收集到的液体4℃、3500rpm离心15min，弃沉淀，将上清用millipore蛋白超滤柱(10kd)进行浓缩同时进行病毒滴度测定，根据测定结果将慢病毒(anti-wt1car)稀释为1*108tu/ml，分装后的慢病毒(anti-wt1car)置于-80℃保存。
4、cd3+t细胞的分离
全血倒入50ml离心管，室温离心20分钟，控制离心力为700g；取上述离心下部细胞成分，加杜氏磷酸盐缓冲液dpbs至50ml；分别取25ml上述液体加到20ml人淋巴细胞分离液，将离心管室温离心15分钟，控制离心力为800g；取白膜层细胞，加入dpbs，补足至50ml；离心10分钟，控制离心力为600g，弃上清液，得外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，简称：pbmc)。
5、慢病毒载体感染t淋巴细胞
用质量分数为10％fbs的rpmi1640完全培养基培养分离得到的外周血单个核细胞，第一天加入抗cd3单克隆抗体活化；第三天加入80moi的纯化后的慢病毒(anti-wt1car)，1000g离心1h，然后将培养基更换为含有700iu/ml重组人il-2的x-vivo15无血清培养基，继续培养7天，得到靶向wt1嵌合抗原受体t细胞。
实施例2靶向wt1嵌合抗原受体t细胞体外抗肿瘤效果
以淋巴系统表达wt1的细胞系k562细胞(人慢性骨髓性白血病细胞系)和raji细胞(人burkitt's淋巴瘤细胞)作为靶细胞，分别用实施例1制备的靶向wt1嵌合抗原受体t细胞和未感染慢病毒(anti-wt1car)的t细胞制得效应细胞，将靶细胞按照密度10000个/ml接种96孔板，每孔100μl，按照1:1，5:1，10:1效靶比将效应细胞加入靶细胞，同时加入cck8(碧云天)试剂，置于5％co2，37℃培养箱连续培养4h，期间在450nm波长下每隔1h连续读数，计算杀伤效率。结果如图2-6所示，结果表明，靶向wt1的嵌合抗原受体t细胞对wt1阳性细胞(k562细胞和raji细胞)具有很强且特异的杀伤作用。
实施例3靶向wt1嵌合抗原受体t细胞体内抗肿瘤效果
取6周龄体重在25-30g的雌性nodscid鼠(购买自北京维通利华实验动物技术有限公司)30只，每只小尾静脉注射5*106k562细胞，总体积共0.1ml，接种肿瘤细胞3天后将小鼠按照体重随机分成3组：对照组、正常t细胞(未感染anti-wt1car慢病毒)组和靶向wt1嵌合抗原受体t细胞细胞(实施例1制备)组；对照组尾静脉注射生理盐水200ul/次，每周1次，共2次；正常t细胞组尾静脉注射t细胞1*107个/次，每周1次，共2次；靶向wt1嵌合抗原受体t细胞细胞组尾静脉注射抗wt1嵌合抗原受体t细胞1*107个/次，每周1次，共2次；统计100天内小鼠生存状态，做生存率曲线。结果如图6所示，结果表明，靶向wt1嵌合抗原受体t细胞相对于正常t细胞以及对照组可延迟wt1高表达细胞系k562细胞移植瘤小鼠模型的生存期。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。