本发明涉及天然表面活性蛋白sp-b的肽类似物及其在制备用于预防和/或治疗呼吸窘迫综合征(rds)和其他呼吸道疾病的制剂中的用途。
发明背景
人肺由称为肺泡的大量小气囊组成，在其中，气体在血液与肺的气室之间交换。在健康个体中，这种交换通过含有蛋白质的表面活性复合物的存在来介导，这种复合物防止肺在呼气末期塌陷。
肺表面活性复合物主要由脂质组成，并含有少量的各种蛋白质。缺少足够水平的这种复合物导致肺功能失常。这种综合征被称为呼吸窘迫综合征(rds)，它通常侵袭早产儿。
用提取自动物肺的改性天然表面活性制剂能有效地治疗所述综合征。
这些表面活性制剂的主要成分是磷脂，如1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱，通常称为二棕榈酰-磷脂酰胆碱(dppc)，磷脂酰甘油(pg)和表面活性疏水性蛋白b和c(sp-b和sp-c)，已知其具有实现所述制剂的表面活性剂样活性的能力。
由于来自动物组织的表面活性制剂的缺点，如复杂的生产和灭菌过程以及可能的免疫反应诱导，因此已经研发了模拟改性天然表面活性剂组成的合成表面活性剂。
所述合成表面活性剂称为重建表面活性剂。
然而，已经证实了研发临床活性的重建表面活性剂非常复杂，因为从天然来源分离大量的疏水性sp-b和sp-c蛋白费用高且劳动密集。
同样，就设计和获得最佳宿主/载体表达系统而言，通过重组dna技术生产这些蛋白需要非常大的努力。此外，需要相当大的努力来研发有效的分离策略以将所表达的目标蛋白与不需要的物质分离和纯化。
特别地，sp-b蛋白的特征在于高分子量，极端疏水性和大量的半胱氨酸残基，这使得通过从天然物质分离或通过重组dna策略表达的商业生产变得非常复杂。
因此，医学界需要能够模拟天然蛋白所有特性的简单、易于制备、合成的蛋白sp-b类似物。
更特别地，需要这样一种合成的蛋白sp-b类似物，当其与合成的天然蛋白sp-c类似物和与脂质载体混合时，产生能够有效维持呼气末期肺泡开放的重建表面活性制剂。
发明概述
本发明涉及通式(i)所示序列的多肽。
xδlcralikr-seq-pqlvcrlvlrφσn(i)
其中
x是独立地选自c、a、g、k、r、d和e的氨基酸残基；
δ是选自w、l、nl和i的氨基酸残基；
seq是选自fnrylt和yngk的氨基酸序列；
φ是独立地选自c、a、g、k、r、d和e的氨基酸残基；
σ是选自s、g和a的氨基酸残基；
n是0或1。
本发明还包括所述多肽的药物学上可接受的盐及其例如通过乙酰化和酰胺化的封端n-和/或c-末端衍生物。
在另一个实施方案中，本发明提供了含有与通式(i)的多肽混合的脂质载体的重建肺表面活性剂及其药物制剂。
最后，本发明涉及通式(i)的多肽用于制备预防和/或治疗呼吸窘迫综合征和其他呼吸道疾病的重建表面活性剂的用途。
附图
附图显示了人蛋白sp-b的氨基酸序列。
定义
通过测量两个参数来确定用外源性表面活性制剂进行体内治疗后的呼吸功能：
i)潮气量，是肺顺应性的指标，和
ii)肺气体容量，是呼气末期肺泡空气扩张或开放程度的指标，并且因此是呼气末期在肺泡中形成稳定的磷脂膜的能力的指标。
蛋白sp-b，还被限定为“sp18”，是17kda二聚蛋白，其中单体链是79个残基多肽并具有三个链内二硫键，连接cys8和cys77，cys11和cys71以及cys35和cys46。在其天然形式中，人sp-b亚基作为二硫键连接的同型二聚体存在，该二聚体在cys48具有链间二硫键。图中报道了人sp-b单体链的序列。
如在此所用的，术语“重建表面活性剂”意指一种脂质载体，其中加入了通过重组技术或合成方法制备的表面活性蛋白的多肽类似物。
如在此所用的，术语“脂质载体”意指磷脂和任选的其他脂质组分的混合物，其他脂质成分例如为中性脂质，如三酰基甘油、游离脂肪酸和/或胆固醇。
术语“多肽”和“肽”在此可互换使用，用来表示通过邻近残基的α-氨基与羧基之间的肽键彼此连接的线性系列的不超过约60个氨基酸残基。
术语“天然表面活性蛋白sp-b的多肽类似物”包括含有如下氨基酸序列的肽，该肽与天然蛋白相比，一个或多个氨基酸丢失或已经被其他氨基酸置换，只要该多肽与脂质载体的混合物显示出肺表面活性剂活性。
术语“天然表面活性蛋白sp-c的多肽类似物”包括含有如下氨基酸序列的多肽，该多肽与天然蛋白相比，一个或多个氨基酸丢失或已经被其他氨基酸置换，只要该多肽和脂质载体的混合物显示出肺表面活性剂活性。
呈现出保守置换的多肽是其中一个氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基置换的多肽。保守置换的实例包括一个疏水性残基，如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸置换另一个，或一个极性残基置换另一个，如精氨酸与赖氨酸之间，或谷氨酸与天冬氨酸之间。
术语“保守置换”还包括使用置换的氨基酸替代未置换的母体氨基酸，条件是所得到的多肽也呈现出所需的表面活性剂活性。
此外，术语“保守置换”包括不同于之前那些的置换，条件是所得到的多肽维持母体多肽的二级结构以及所需的表面活性剂活性。
根据三字母代码来显示氨基酸序列，其中带有游离氨基的氨基酸在左端(氨基末端)，而带有游离羧基的氨基酸在右端(羧基末端)。
在此鉴定的所有氨基酸残基都具有天然的l-构型，并且在此鉴定的序列按照以下对照表中所示的氨基酸残基的标准缩写来表示。
对照表
发明详述
本发明涉及具有通式(i)所示序列的多肽。
xδlcralikr-seq-pqlvcrlvlrφσn(i)
其中
x是独立地选自c、a、g、k、r、d和e的氨基酸残基；
δ是选自w、l、nl和i的氨基酸残基；
seq是选自fnrylt和yngk的氨基酸序列；
φ是独立地选自c、a、g、k、r、d和e的氨基酸残基；
σ是选自s、g和a的氨基酸残基；
n是0或1。
本发明的多肽包括通过氨基酸序列连接的sp-b蛋白的n-末端序列8-17和c-末端序列67-78，该氨基酸序列能够形成选自fnrylt和yngk的回转模体。
所述多肽还包括修饰如通式(i)所包括的那些，其中天然sp-b蛋白序列的一些氨基酸残基已经被置换和/或丢失。
另外，它们可以在氨基-或羧基-末端进一步包括附加的氨基酸残基。所述修饰可以用来增强多肽的表达或可以用作“连接”序列，但优选没有降低或另外影响本发明的多肽的生物活性。
本发明还包括所述多肽的药物学上可接受的盐及其例如通过乙酰化或酰胺化的封端n-和/或c-末端衍生物。
药物学上可接受的盐包括，例如，盐酸、醋酸和三氟乙酸的盐。
在一个实施方案中，通式(i)的多肽可以是二硫键连接的分子的形式，其中分子内二硫键在位置4的cys残基和c-末端部分中的cys残基之间。
第一组优选的通式(i)的多肽是这样的多肽，其中：
x和φ都是c；
δ如上定义；
seq是fnrylt；
n是0。
有利地，所述多肽可以是二硫键连接的分子的形式，其中分子内二硫键位于位置1和27的两个cys残基之间和/或位于位置4和21的两个cys残基之间。
第二组优选的通式(i)的多肽是这样的多肽，其中：
x和φ都是c；
δ如上定义；
seq是yngk；
n是0或1。
有利地，所述多肽可以是二硫键连接的分子的形式，其中分子内二硫键位于位置1和25的两个cys残基之间和/或位于位置4和19的两个cys残基之间。
第三组优选的通式(i)的多肽是这样的多肽，其中：
x是a或g；
δ如上定义；
seq是fnrylt；
n是0或1；
φ是a或g。
有利地，所述多肽可以是环状分子的形式，其中分子内二硫键位于位置1和27的ala或gly残基之间。更有利地，二硫键还存在于位置4和21的两个cys残基之间。
第四组优选的通式(i)的多肽化合物是这样的多肽，其中：
x是a或g；
δ如上定义；
seq是yngk；
n是0或1；
φ是a或g。
有利地，所述多肽可以是环状分子的形式，其中分子内键位于位置1和25的ala或gly之间。更有利地，二硫键还存在于位置4和19的两个cys残基之间。
第五组优选的通式(i)的多肽是这样的多肽，其中：
x是k或r；
δ如上定义；
seq是fnrylt；
n是0或1；
φ是d或e。
有利地，所述多肽可以是环状分子的形式，其中所述键位于位置1的k或r和位置27的d或e之间。所述键可以是k或r残基的游离氨基和d或e残基的游离羧基之间的酰胺共价键的形式，另外所述键可以是盐桥形式。
更有利地，二硫键还存在于位置4和21的两个cys残基之间。
第六组优选的通式(i)的多肽化合物是这样的多肽，其中：
x是k或r；
δ如上定义；
seq是yngk；
n是0或1；
φ是d或e。
有利地，所述多肽是环状分子的形式，其中所述键位于位置1的k或r和位置25的d或e之间。所述键可以是k或r残基的游离氨基和d或e残基的游离羧基之间的酰胺共价键的形式，另外所述键可以是盐桥形式。
更有利地，二硫键还存在于位置4和19的两个cys残基之间。
第七组优选的通式(i)的多肽化合物是这样的多肽，其中：
x是d或e；
δ如上定义；
seq是fnrylt；
n是0或1；
φ是k或r。
有利地，所述多肽可以是环状分子的形式，其中所述键位于位置1的d或e和位置27的k或r之间。所述键可以是k或r残基的游离氨基和d或e残基的游离羧基之间的酰胺共价键的形式，另外所述键可以是盐桥形式。
更有利地，二硫键还存在于位置4和21的两个cys残基之间。
第八组优选的通式(i)的多肽化合物是这样的多肽，其中：
x是d或e；
δ如上定义；
seq是yngk；
n是0或1；
φ是k或r。
有利地，所述多肽可以是环状分子的形式，其中所述键位于位置1的d或e和位置25的k或r之间。所述键可以是k或r残基的游离氨基和d或e残基的游离羧基之间的酰胺共价键的形式，另外所述键可以是盐桥形式。
更有利地，二硫键还存在于位置4和19的两个cys残基之间。
以下记载了通式(i)所包括的优选多肽
其中分子内二硫键位于cys残基之间的二硫键连接的分子形式的多肽(ic)和(id)在下文中表示为ox-(ic)和ox-(id)多肽。
本发明的多肽，当与包含磷脂的脂质载体混合时，形成能够使表面张力降至接近0的数值的重建表面活性剂。
我们还发现了，在其中没有应用呼气末期正压(peep)来治疗未成熟新生儿的rds模型中，通式(i)的多肽，当与特定的合成的蛋白sp-c类似物和与合适的脂质载体混合时，使通过潮气量表示的呼吸机能改善到给予改性天然表面活性剂后所达到的相当的程度。
此外，证明了所述重建表面活性制剂能改善肺气体容量，这是呼气末期肺泡开放程度的指标。
可以通过多肽领域中的技术人员已知的任何技术来合成通式(i)的多肽。
许多可用的技术可以在以下文献中找到，j.m.steward和j.d.young，“solidphasepeptidesynthesis”(固相肽合成)，w.h.freemanco.，sanfrancisco，1969，和j.meienhofer，hormonalproteinsandpeptides(激素蛋白质和肽)，vol.2，p.46，academicpress(纽约)，1983，用于固相肽合成，和e.schroder和k.kubke，“thepeptides”(肽)，vol.1，academicpress(纽约)，1965，用于传统的溶液合成。还可以使用最初由merrifield描述的固相合成技术来制备本发明的多肽，见j.am.chem.soc.85:2149-2154(1963)。其他多肽合成技术可以在例如m.bodanszky等，peptidesynthesis(肽合成)，johnwiley&sons，第2版，(1976)中以及本领域技术人员已知的其他参考著作中找到。
用于这些合成中的合适的保护基团将在以上的文献以及j.f.w.mcomie，protectivegroupsinorganicchemistry(有机化学中的保护基团)，plenumpress，纽约，ny(1973)中找到。
一般来说，这些方法包括将一个或多个氨基酸残基或适当保护的氨基酸残基按序加入到生长的肽链中。
使用固相合成来举例，将受保护的或衍生化的氨基酸通过其未受保护的羧基或氨基附着到惰性固体支持物上。然后选择性地除去氨基或羧基的保护基团，并在适于与已经附着到固体支持物上的残基形成酰胺键的条件下，使具有适当保护的互补基团(氨基或羧基)的序列中的下一个氨基酸混合并反应。然后从这个新添加的氨基酸残基上除去氨基或羧基的保护基团，然后添加下一个(适当保护的)氨基酸，依此类推。
所有所需的氨基酸以正确顺序连接后，按序或同时除去剩余的末端和侧基保护基团(和固体支持物)，以产生最终的多肽。
粗制多肽一般通过hplc来纯化并通过冻干来分离。
可以获得药物学上可接受的盐形式的多肽。任选地，可以根据本领域技术人员公知的程序使用由合适的离子交换树脂填装的柱子，将所获得的盐转化成另一种类型的盐。
还可以使用本领域公知的重组核酸方法来制备本发明的多肽。
因此，本发明中包括编码本发明的多肽的dna序列，能够表达它们的重组表达载体及其方法。
可以通过本领域技术人员公知的化学技术来合成编码本发明的多肽的dna序列。然后将该dna区段连接至表达载体中，并且用其转化的宿主可以用于生产多肽。
通过化学合成该编码序列，可以简单地通过用合适的碱基置换编码天然氨基酸残基序列的那些来进行任何所需的修饰。
本发明中包括能够表达目标多肽的重组表达载体及其用于生产通式(i)的多肽的方法。
本发明中还包括上述dna区段的核糖核酸(rna)等同物。
遗传密码的重要且公知的特征是其冗余性。即，对于大多数用于形成蛋白质的氨基酸，超过一个编码核苷酸三联体(密码子)可以编码或表示特定的氨基酸残基。因此，多个不同的核苷酸序列可以编码特定的氨基酸残基序列。这样的核苷酸序列被认为在功能上是等同的，因为它们可以在所有生物体中导致相同的氨基酸残基序列的产生。
可以将通式(i)的多肽与药物学上可接受的脂质载体混合来形成重建表面活性剂。
多肽与脂质载体之间的重量比有利地在约1:5至约1:5000的范围内，优选约1:10至约1:2000，且更优选约1:50至约1:1000。在更优选的实施方案中，多肽:脂质载体重量比在约1:5至约1:1000的范围内，优选约1:7至约1:500，且更优选约1:10至约100。
有利地，脂质载体包括天然肺表面活性制剂中含有的磷脂，例如磷脂酰胆碱(pc)，如二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)和棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(popc)，以及磷脂酰甘油(pg)，如棕榈酰油酰磷脂酰甘油(popg)和二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)。
其他可以有利地使用的磷脂是磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂(sm)。
在特定的实施方案中，脂质载体可以包括另外的成分，例如中性脂质，如三酰甘油、游离脂肪酸和/或胆固醇。
重建表面活性剂可以包含一种或多种通式(i)的多肽或可以进一步包含天然表面活性蛋白sp-c的合成肽类似物，如wo95/32992，wo00/47623和wo03/097695中公开的那些。
可以通过混合所述多肽的溶液或悬浮液，任选地另一种肽的溶液或悬浮液和脂质载体，随后通过将该混合物干燥来制备含有本发明的多肽的重建表面活性剂。
另外，可以按照本领域已知的方法通过冻干或喷雾干燥来制备它们。
可以以本领域技术人员已知的方式来进行所述重建表面活性制剂的给药，优选通过气管内滴注(灌输或推注)。另外，可以通过气雾化或通过雾化来进行给药。
本发明还涉及包括含有本发明的多肽的重建表面活性剂的药物组合物。
有利地，以溶液、分散体、悬浮液或干粉的形式来给予所述组合物。优选，所述组合物含有溶解或悬浮于合适的溶剂或再悬浮介质中的重建表面活性剂。
优选，作为一次性玻璃小瓶中的缓冲生理盐水溶液中的悬浮液来提供所述药物组合物。有利地，重建表面活性剂浓度(以磷脂含量来表示)在约2至约160mg表面活性剂/ml的范围内，优选10至100mg/ml，更优选20至80mg/ml。
所述组合物可以进一步含有电解质，如钙、镁和/或钠盐(例如，氯化钙或氯化钠)。
还可以通过雾化来给予含水悬浮液形式的组合物。
如果要将其用于气雾剂给药中，可以以细碎形式连同推进剂一起来提供重建表面活性剂。有用的推进剂通常在环境条件下是气体，在压力下被压缩，如氢氟烷烃。
将气雾剂包装在配备有合适阀门的容器中，使得成分可以维持在压力下直至释放。
用本发明的多肽获得的药物组合物适于治疗或预防早产儿的呼吸窘迫综合征(rds)或用于治疗或预防其他与表面活性剂缺乏或机能障碍相关的疾病，包括成人rds(ards)、胎便吸入综合征(mas)和支气管肺发育不良(bpd)。
它们也可用于治疗或预防其他呼吸疾病，如肺炎、支气管炎、copd(慢性梗阻性肺病)、哮喘和囊性纤维化病，以及用于治疗浆液性中耳炎(胶耳)。
以下实施例更详细地说明了本发明。
实施例1-多肽ox-(ic)的合成和纯化
按照以下所示的方案1，基于fmoc化学，通过标准spps(固相肽合成)来制备多肽ox-(ic)。
方案1
固相合成后，通过标准方法从树脂上裂解没有二硫桥的粗制肽，然后通过两个不同的氧化步骤选择性地形成二硫桥。
为了选择性地形成二硫桥，在合成过程中选择用于四个半胱氨酸侧基的限定保护模式。在方案1中所示的方法中，在spps过程中将cys1和cys27作为fmoc-cys(trt)-oh引入，而作为相应的acm-衍生物来偶联cys4和cys21。
通过空气氧化形成第一个二硫桥，通过hplc系统来纯化具有一个桥键的肽，并通过冻干来分离。通过碘氧化来形成第二个二硫桥，通过hplc系统来纯化最终的肽，并通过冻干来分离。
使用c18柱，通过反相高效液相色谱(hplc)来检查最终多肽的纯度，显示出为92％。
通过esi-ms来确定其分子量。
产量：1.73g(2.4％)。
实施例2-多肽ox-(id)的合成和纯化
按照以下所示的方案2以相似的方式来制备多肽ox-(id)。
方案2
按照实施例1中所记载的，在cys1与cys27之间以及cys4与cys21之间引入二硫桥，并进行纯化和分离。
使用c18柱，通过反相高效液相色谱(hplc)来检查最终多肽的纯度，显示出为86％。
通过esi-ms来确定其分子量。
产量：0.81g(2.4％)。
图例
aa-oh氨基酸
acn乙腈
acoet乙酸乙酯
acoh醋酸
acm乙酰氨基甲基
boc叔-丁氧羰基
n-buoh正-丁醇
tbu叔-丁基
dipean,n-二异丙基乙胺
dmfn,n-二甲基酰胺
edt1,2-乙二硫醇
esi-ms电喷雾离子化质谱
fmoc9-芴基甲氧羰基
hplc高效液相色谱
lyo冻干
mtt甲基三苯甲基
pbf2,2,4,6,7-五甲基-2,3-二氢-苯并呋喃-5-
磺酰
spps固相肽合成
tbtu2-(1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲
四氟硼酸盐
tfa三氟醋酸
tips三异丙基硅基
trt三苯甲基
序列表
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