本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种索玛鲁肽的合成方法。
背景技术：
中文名：索玛鲁肽
英文名：sermaglutide
肽序列为：
h-his-aib-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-val-ser-ser-tyr-leu-glu-gly-gln-ala-ala-lys(octadecanedioic-γ-glu-peg2-peg2)-glu-phe-ile-ala-trp-leu-val-arg-gly-arg-gly-oh；
索玛鲁肽由丹麦诺和诺德公司开发的新型长效glp-1类似物，从氨基酸序列上看，肽序2位为非天然氨基酸氨基异丁酸，肽序20位的lys侧链氨基经过了peg、γ-glu和十八烷二酸的修饰。与索玛鲁肽相比，修饰后的索玛鲁肽亲水性增强，抑制dpp-4酶的水解，延长生物半衰期，长效降低血糖，促进胰岛细胞再生，延长胃排空等多种作用，应用前景广泛。
depsipeptideunits是一种脂肽结构单元，在公开号为：ep1642921a1的专利里已有描述。
cn201511027176的专利公开了索玛鲁肽的制备方法，固相逐一合成索玛鲁肽直链肽，合成侧链修饰基团，脱去lys的保护基，并偶联侧链修饰基团，最终裂解得到该多肽产物。该方法采用氨基酸逐个偶联的方式，随着直链肽的延长，大量的疏水性保护基团加剧了分子间的缔合作用，部分活性基团被包裹其中，直连肽的偶联会异常困难，工艺中产生不易除去的缺陷肽，增加投料和延长时间无法从根本上解决问题。
cn201610926972的专利公开了一种合成索玛鲁肽的固相合成方法，同样采用的是逐一偶联的办法。
因此，本领域迫切需要提供一种索玛鲁肽的合成方法，以解决现有索玛鲁肽合成过程中存在，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量的问题；本发明解决这些问题。
技术实现要素：
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种索玛鲁肽的合成方法，本方法引入depsipeptideunits解决索玛鲁肽困难序列合成问题，再通过酯键转酰胺键反应得到目标产物；本发明的合成方法提高了粗肽的纯度和收率，有利于下游纯化，适合于工业化生产。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种索玛鲁肽的合成方法，包括如下步骤：
步骤一，制备fmoc-gly-wang树脂；
步骤二，将fmoc-gly-wang树脂、保护氨基酸、十八烷二酸(otbu)-γ-glu-otbu-peg-peg-oh作为原料，制备全保护肽树脂，全保护肽树脂包含depsipeptideunits结构，
depsipeptideunits的化学结构式为：
其中r包括：h，ch3(ser，thr)；
步骤三，将所述肽树脂进行tfa裂解，得到粗肽；
步骤四，将步骤三得到的粗肽溶解调ph，经过酯键转酰胺键反应后得到索玛鲁肽粗品。
前述的一种索玛鲁肽的合成方法，步骤二，制备全保护肽树脂；
步骤a，制备保护氨基酸片段，
保护氨基酸片段的化学结构式为：
其中r包括：h，ch3(ser，thr)；
步骤b，将fmoc-gly-wang树脂加入到固相反应器中；
步骤c，将单保护氨基酸和所述保护氨基酸片段逐一加入固相反应器中进行偶合反应，按照索玛鲁肽的氨基酸序列倒序合成；
单保护氨基酸包括：fmoc-gly-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(x)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-tyr(tbu)-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-thr(tbu)-oh，fmoc-aib-oh，boc-his(trt)-oh；
保护氨基酸片段包括：boc-thr5(fmoc-gly4)-oh，boc-thr7(fmoc-phe6)-o，boc-ser8(fmoc-thr7(tbu))-oh，boc-ser11(fmoc-val10)-oh，boc-ser12(fmoc-ser11(tbu))-oh；
步骤d，加入十八烷二酸(otbu)-γ-glu-otbu-peg-peg-oh，再经过缩合反应得到具有depsipeptideunits的肽树脂，
所述depsipeptideunits的化学结构式为：
其中r包括：h，ch3(ser，thr)。
前述的一种索玛鲁肽的合成方法，
步骤二，制备全保护肽树脂；
步骤a，将fmoc-gly-wang树脂加入到固相反应器中；
步骤b，固相合成方法逐一将fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(x)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、boc-ser-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-aib-oh、boc-his(trt)-oh偶联到fmoc-gly-wang上；
在单保护氨基酸偶联到fmoc-gly-wang上的过程中引入depsipeptideunits，可引入depsipeptideunits的位点包括：gly4-thr5，phe6-thr7，thr7-ser8，val10-ser11，ser11-ser12；
步骤c，加入pal-γ-glu-otbu，再经过缩合反应得到具有depsipeptideunits的肽树脂，
所述depsipeptideunits的化学结构式为：
其中r包括：h，ch3(ser，thr)。
前述的一种索玛鲁肽的合成方法，fmoc-lys(x)-oh中的x包括：alloc、dde、ivdde、mtt、十八烷二酸(otbu)-γ-glu-otbu-peg-peg-oh；若lys20的侧链为alloc、dde、ivdde、mtt，则需要先脱去这些保护基团后偶联十八烷二酸(otbu)-γ-glu-otbu-peg-peg-oh。
前述的一种索玛鲁肽的合成方法，偶合反应采用的fmoc脱除试剂为v/v25％哌啶/dmf溶液。
前述的一种索玛鲁肽的合成方法，缩合反应采用的缩合剂包括：dic/hobt，hbtu/hobt/diea，pybop/hobt/diea。
前述的一种索玛鲁肽的合成方法，缩合反应采用的反应溶剂包括：dcm，dmf，nmp，dmso。
前述的一种索玛鲁肽的合成方法，
步骤三，将所述肽树脂进行tfa裂解，得到粗肽；
裂解采用的试剂的配比为：tfa:苯甲硫醚:茴香醚:edt:h2o＝90:3:3:2:2。
前述的一种索玛鲁肽的合成方法，步骤四，将步骤三得到的粗肽溶解溶于乙腈/水溶液中，碱性试剂调节ph到7.5～9.5，反应5-7h，经过酯键转酰胺键反应后得到索玛鲁肽粗品。
前述的一种索玛鲁肽的合成方法，碱性试剂包括：氨水，碳酸钠，磷酸钠，氢氧化钠，三乙胺，吡啶。
本发明的有益之处在于：
本方法通过引入depsipeptideunits得到全保护肽树脂，再经过裂解、酯键转酰胺键反应得到目标产物；引入depsipeptideunits可以解决索玛鲁肽困难序列合成问题；
本发明采用二肽的形式进行偶联，破坏了直链肽的二级结构，解决了偶联困难问题，去除了工艺产生的缺失肽，从而减少了投料，降低成本；
本方法合成出的粗肽，具有优秀的纯度和收率，有利于下游纯化，适合于工业化生产。
附图说明
图1是本发明的合成方法的流程图；
图2是本发明的前体粗品经酯键转酰胺键反应得到索玛鲁肽粗品的路线图；
图3是本发明的depsipeptideunits的合成路线图；
图4是本发明实验一合成得到的索玛鲁肽的粗品的1/2色谱图；
图5是本发明实验一合成得到的索玛鲁肽的粗品的1/2色谱图；
图6是本发明实验二合成得到的索玛鲁肽的粗品的1/2色谱图；
图7是本发明实验二合成得到的索玛鲁肽的粗品的2/2色谱图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
制备索玛鲁肽，有两种方案：
如图1所示的方案一；
一种索玛鲁肽的合成方法，包括如下步骤：
步骤一，制备fmoc-gly-wang树脂；
步骤二，制备全保护肽树脂；
步骤a，制备保护氨基酸片段，
保护氨基酸片段的化学结构式为：
其中r包括：h，ch3(ser，thr)；在肽序中为thr5、thr7、ser8、ser11、ser12。
写成化学式为：boc-thr5(fmoc-gly4)-oh，boc-thr7(fmoc-phe6)-oh，boc-ser8(fmoc-thr7(tbu))-oh，boc-ser11(fmoc-val10)-oh，boc-ser12(fmoc-ser11(tbu))-oh。
步骤b，将fmoc-gly-wang树脂加入到固相反应器中；
步骤c，将单保护氨基酸和所述保护氨基酸片段逐一加入固相反应器中进行偶合反应，按照索玛鲁肽的氨基酸序列倒序合成；
单保护氨基酸包括：fmoc-gly-oh，fmoc-arg(pbf)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-trp(boc)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-lys(x)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-tyr(tbu)-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-thr(tbu)-oh，fmoc-aib-oh，boc-his(trt)-oh；
保护氨基酸片段包括：boc-thr5(fmoc-gly4)-oh，boc-thr7(fmoc-phe6)-o，boc-ser8(fmoc-thr7(tbu))-oh，boc-ser11(fmoc-val10)-oh，boc-ser12(fmoc-ser11(tbu))-oh；
步骤d，加入十八烷二酸(otbu)-γ-glu-otbu-peg-peg-oh，再经过缩合反应得到具有depsipeptideunits的肽树脂，
depsipeptideunits的化学结构式为：
步骤三，将肽树脂进行tfa裂解，裂解试剂及配比为tfa:thioanisole:anisole:edt:h2o＝90:3:3:2:2；裂解后得中间体粗品，如下式含有val10-ser11构成1个depsipeptideunits的索玛鲁肽前体；
步骤四，将步骤三得到的索玛鲁肽前体溶于乙腈/水溶液中，通过碱性试剂调节ph到7.5～9.5，反应5-7h，前体粗品经酯键转酰胺键反应得到索玛鲁肽粗品，如图2所示；碱性试剂包括：氨水，碳酸钠，磷酸钠，氢氧化钠，三乙胺，吡啶。
方案二；
一种索玛鲁肽的合成方法，包括如下步骤：
步骤一，制备fmoc-gly-wang树脂；
步骤二，制备全保护肽树脂；
步骤a，将fmoc-gly-wang树脂加入到固相反应器中；偶合反应采用的fmoc脱除试剂为v/v25％哌啶/dmf溶液。
步骤b，固相合成方法逐一将fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(x)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、boc-ser-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-aib-oh、boc-his(trt)-oh偶联到fmoc-gly-wang上；
需要说明的是：其中fmoc-lys(x)-oh中的x包括：alloc，dde，ivdde，mtt，十八烷二酸(otbu)-γ-glu-otbu-peg-peg-oh；如果lys20的侧链为alloc，dde，ivdde，mtt，则需要脱去这些保护基团后再偶联十八烷二酸(otbu)-γ-glu-otbu-peg-peg-oh。
在单保护氨基酸偶联到fmoc-gly-wang上的过程中引入depsipeptideunits，可引入depsipeptideunits的位点包括：gly4-thr5，phe6-thr7，thr7-ser8，val10-ser11，ser11-ser12；depsipeptideunits的合成的路线图如图3所示。
步骤c，加入pal-γ-glu-otbu，再经过缩合反应得到具有depsipeptideunits的肽树脂，
depsipeptideunits的化学结构式为：
其中r包括：h，ch3(ser，thr)；
缩合反应采用的缩合剂包括：dic/hobt，hbtu/hobt/diea，pybop/hobt/diea(n,n-二异丙基乙胺)。缩合反应采用的反应溶剂包括：dcm，dmf，nmp，dmso。
步骤三，将肽树脂进行tfa裂解，裂解试剂及配比为tfa:thioanisole:anisole:edt:h2o＝90:3:3:2:2；得到粗肽；
步骤四，将步骤三得到的粗肽溶于乙腈/水溶液中，通过碱性试剂调节ph到7.5～9.5，反应5-7h，前体粗品经酯键转酰胺键反应得到索玛鲁肽粗品，如图2所示。作为一种实施例，碱性试剂包括：氨水，碳酸钠，磷酸钠，氢氧化钠，三乙胺，吡啶。
为了证明本发明的方法具有优秀的纯度和收率，做如下验证实验：
按照方案一进行如下合成实验一：
步骤一，fmoc-gly-wang树脂的制备；
称取wang树脂17.0g(sub＝0.61mmol/g)加入到固相反应器中，加入150mldcm溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，加入fmoc-gly-oh9.02g，hobt5.6g，dic5.6ml160mldmf溶液，搅拌反应5h。抽干溶剂，加入醋酸酐11ml，吡啶8ml，dmf160ml，封闭2h。dcm与甲醇交替洗涤3次，每次170ml。真空干燥后，得到经紫外分光光度法测定fmoc-gly-wang树脂的sub＝0.55mmol/g。
步骤二，boc-ser11(fmoc-val10)-oh的制备；
称取ctc-resin35g加入到固相反应器中，加入160mldmf洗涤树脂10min，称量fmoc-ser-oh23.2g，diea25.1g，加入dmf90ml溶解，冰浴活化搅拌8min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应3h，抽干溶剂。加入dmf洗涤3次，每次90ml。
称取fmoc-val-oh18.7g，hobt6.3g，cdi6.3ml，dmap0.6g,加入dmf100ml溶解冰与活化8min，加入到反应器中，反应2h，抽干溶剂。加入dmf洗涤3次，每次100ml；再用dcm洗涤3次每次100ml；将洗涤好的树脂干燥，称量得boc-ser(fmoc-val)-ctc-resin78.9g。
将上一步得到的78.9gboc-ser(fmoc-val)-ctc-resin投入到700ml含1％tfa的冷dcm溶液中，裂解2小时；过滤后得裂解液692ml；裂解旋蒸浓缩到三分子一体积后，补加3倍体积的dcm继续旋蒸，循环加液三次后蒸干，得boc-ser(fmoc-val)-oh粗品33.7g。
步骤三，全保护肽的制备；
称取fmoc-gly-wang树脂20.0g，加入到固相反应器中，加入90mldcm溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，分别加入2次90mlv/v20％哌啶/dmf溶液，反应5min和15min。抽干溶剂，加入dmf90ml洗涤4次。茚检结果呈阳性。
称取如下的保护氨基酸19.8g，hobt5.6g，dic5.6ml，加入dmf90ml溶解，冰浴活化8min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入dmf洗涤3次，每次90ml。
重复以上步骤，保护氨基酸为：按照氨基酸序列，依次加入fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、boc-ser(fmoc-val)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-aib-oh、boc-his(trt)-oh进行偶联反应。
称取四三苯基膦钯12.2g，吗啡啉1ml，100mlthf加入到固相反应器中，反应3h，dmf洗涤3次，每次加入100ml，茚检结果呈阳性。
称取十八烷二酸(otbu)-γ-glu-otbu-peg-peg-oh21.6g，hobt5.6g，dic5.6ml加入dmf90ml溶解，冰浴活化8min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应3h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入dmf洗涤3次，每次90ml。dcm与甲醇交替洗涤3次，每次90ml，真空干燥。
步骤四，裂解；
配制500ml裂解试剂为tfa:thioanisole:anisole:edt:h2o＝90:3:3:2:2，冰浴条件下加入到全保护肽中，0.5h后恢复至室温继续反应2.5h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀。离心沉淀3次，每次加入乙醚3l。粗肽进行干燥。所得粗肽47.8g。
步骤五，酯键转酰胺键反应；
将上一步47.8g粗肽产品溶于5％的乙腈水溶液中，用30％的氨水调节溶液ph，反应3h，得到索玛鲁肽。
溶液经对照品定量含索玛鲁肽40.2g，合成总收率84.1％，粗品纯度80.0％(如图4、5所示的hplc谱图)。由此可以看出按照方案一合成的索玛鲁肽粗品的收率和纯度都很优秀。
按照方案二的方法，做如下合成实验二；
步骤一，fmoc-gly-wang树脂的制备；
称取wang树脂17.0g(sub＝0.61mmol/g)加入到固相反应器中，加入150mldcm溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，加入fmoc-gly-oh9.02g，hobt5.6g，dic5.6ml160mldmf溶液，搅拌反应5h。抽干溶剂，加入醋酸酐11ml，吡啶8ml，dmf160ml，封闭2h。dcm与甲醇交替洗涤3次，每次170ml。真空干燥后，得到经紫外分光光度法测定fmoc-gly-wang树脂的sub＝0.55mmol/g。
步骤二，全保护肽的制备；
称取fmoc-gly-wang树脂20.0g，加入到固相反应器中，加入90mldcm溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，分别加入2次90mlv/v20％哌啶/dmf溶液，反应5min和15min。抽干溶剂，加入dmf90ml洗涤4次。茚检结果呈阳性。
如下的保护氨基酸19.8g，hobt5.6g，dic5.6ml，加入dmf90ml溶解，冰浴活化8min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入dmf洗涤3次，每次90ml。其中fmoc-val10-oh的偶联试剂使用hobt5.6g、dic5.6ml、diea0.52g。
重复以上步骤，保护氨基酸为：按照氨基酸序列，依次加入fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-lys(alloc)-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、boc-ser(tbu)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-aib-oh、boc-his(trt)-oh进行偶联反应。需要说明的是：此处相比方案一的合成方法中未加入boc-ser(fmoc-val)-oh，而是加入的fmoc-val-oh。
称取四三苯基膦钯12.2g，吗啡啉1ml，100mlthf加入到固相反应器中，反应3h，dmf洗涤3次，每次加入100ml，茚检结果呈阳性。
称取十八烷二酸(otbu)-γ-glu-otbu-peg-peg-oh21.6g，hobt5.6g，dic5.6ml加入dmf90ml溶解，冰浴活化8min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应3h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入dmf洗涤3次，每次90ml。dcm与甲醇交替洗涤3次，每次90ml，真空干燥。
步骤三，裂解；
配制500ml裂解试剂为tfa:thioanisole:anisole:edt:h2o＝90:3:3:2:2，冰浴条件下加入到全保护肽中，0.5h后恢复至室温继续反应2.5h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀。离心沉淀3次，每次加入乙醚3l。粗肽进行干燥。所得粗肽45.3g。
步骤四，酯键转酰胺键反应；
将上一步45.3g粗肽产品溶于5％的乙腈水溶液中，用30％的氨水调节溶液ph，反应5h，得到索玛鲁肽。
溶液经对照品定量含索玛鲁肽37.1g，合成总收率81.9％，粗品纯度75.4％(如图6、7所示的hplc谱图。
由此可以看出按照方案一或方案二合成的索玛鲁肽粗品的收率和纯度都很优秀。
本方法通过引入depsipeptideunits得到全保护肽树脂，再经过裂解、酯键转酰胺键反应得到目标产物；引入depsipeptideunits可以解决索玛鲁肽困难序列合成问题；采用二肽的形式进行偶联，破坏了直链肽的二级结构，解决了偶联困难问题，去除了工艺产生的缺失肽，从而减少了投料，降低成本；本方法合成出的粗肽，具有优秀的纯度和收率，有利于下游纯化，适合于工业化生产。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。