本发明属于兽用医药领域，具体涉及一种羊的γ干扰素突变体及其制备方法与应用。
背景技术：
干扰素是一类在同种细胞上具有抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥又受细胞基因组的调节和控制，涉及rna和蛋白质的合成。ifn蛋白家族根据其编码基因的序列、染色体定位和受体特异性分为ⅰ型、ⅱ型和ⅲ型干扰素。ⅰ型干扰素包括ifn-α、ifn-β、ifn-ω、ifn-δ、ifn-ε、ifn-δ、ifn-τ等，哺乳动物中主要是ifn-α和ifn-β。ⅰ型干扰素具有较强的抗病毒活性，主要通过干扰病毒的复制抑制其增殖，还具有抗肿瘤和免疫调节的功能。ⅱ型干扰素只有ifn-γ一个成员，又称为免疫干扰素，主要作用是激活巨噬细胞杀灭微生物。ⅲ型干扰素是新发现的细胞因子，包括λ1(il-29)、λ2(il-28a)和λ3(il-28b)。ⅲ型干扰素与ⅰ型干扰素关系密切，但有特殊的生理学功能，如刺激主要组织相容性复合体(majorhistocom-patibilitycomplex，mhc)分子的活化和表达，调节先天免疫和获得性免疫等。由于干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤的活性以及强大的免疫调节作用，现已成为病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点之一。
ⅱ型干扰素的成员ifn-γ，主要由活化的nk、nkt细胞及t细胞表达，ifn-γ的受体是ifngr，属于异二聚体，广泛表达于多种细胞。是重要的免疫应答分子，参与免疫应答的整个过程，调控免疫应答的走向，尤其对细胞免疫有重要的作用。
羊的ifn-γ主要通过三条途径起作用，第一通过上调mhc-ⅰ类抗原的提呈途径增加细胞毒性t淋巴细胞对病原体的敏感性，使ctl更有效地将病原体清除；第二使免疫反应向th1表型转化，使静止的cd4+t细胞分化为th1细胞，同时抑制th2细胞的增殖；对免疫细胞进行调节来实现免疫调节功能的。第三ifn-γ还可以通过与细胞表面受体的结合，诱导病毒感染细胞产生多种抗病毒蛋白，使细胞内产生抗病毒状态而发挥抗病毒作用或者干扰细胞周期，抑制细胞增殖，抑制病毒性疾病的治疗。
羊是常见的饲养动物，抗逆能力强、肉质好、性成熟早及繁殖能力强等优点。是适合家庭养殖的重要牲畜之一。为人类提供毛皮和肉，其毛皮是多种毛织品和皮革制品的原料。羊肉是冬令绝佳的食疗保健品。羊肉含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素b、尼克酸、无机物钙、磷、铁、钾、碘等成分,营养十分全面,丰富。另外，也有较高的药用价值，但是羊养殖业仍然受到了一些病毒性疾病的侵扰，但是缺少安全可靠且价格合理的羊γ干扰素类药物治疗或预防羊病毒性疾病。
技术实现要素：
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(batzer等人，nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等人，j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和cassol等人，(1992)；rossolini等人，molcell.probes8:91-98(1994))。
术语“同源性”，指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的调控片段的核苷酸序列具有优选地85％或更高，更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。
术语“互补的”在此指的是两种包括反向平行核苷酸序列的核苷酸序列，反向平行核苷酸序列能在反向平行核苷酸序列的互补碱基残基之间形成氢键后彼此相互配对。本领域已知的是，当都从5’到3’的方向看序列时，两种互补链的核苷酸序列是彼此反向互补的。本领域也已知的是，两种在给定的条件组下能彼此杂交的序列不必必须是100％完全互补的。
术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍)。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(tijssen,techniquesinbiochemistryandmolecularbiology-hybridizationwithnucleicprobes,"overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度ph下的热熔点(tm)约5-10℃。tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、ph和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在ph7.0到8.3下盐浓度低于约1.0m钠离子浓度，通常为约0.01到1.0m钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×ssc和1％sds，在42℃下培养；或5×ssc，1％sds，在65℃下培养，在0.2×ssc中洗涤和在65℃下于0.1％sds中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。
术语“突变”和“突变体”在此具有它们的常用含义，指的是在核酸或多肽序列中的遗传的、天然存在的或引入的变化，它们的意义与本领域人员通常所知的意义相同。
术语“宿主细胞”或“重组宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“转染”指真核细胞由于外源dna掺入而获得新的遗传标志的过程。
本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种羊γ干扰素及羊的γ干扰素突变体，所述羊的γ干扰素突变体具有高抗病毒活性；
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统制备所述羊的γ干扰素或羊的γ干扰素突变体的方法；
本发明所要解决的第三个技术问题是提供所述羊的γ干扰素或羊的γ干扰素突变体在制备预防或治疗羊病毒性疾病的药物或试剂中的用途。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种羊的γ干扰素，所述羊的γ干扰素的氨基酸序列为seqidno.1所示或为与seqidno.1所示的氨基酸序列具有相同干扰素的功能或活性的氨基酸序列。
优选地，在本发明所述的羊的γ干扰素中，所述羊的γ干扰素的编码基因的多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示：
(a)seqidno.2所示的多核苷酸序列；或
(b)与seqidno.2所示的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码的蛋白仍具有相同干扰素的功能或活性；或
(c)与seqidno.2所示的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且所述多核苷酸序列编码的蛋白仍具有相同干扰素的功能或活性；优选的，与seqidno.2所示的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且所述多核苷酸序列编码的蛋白仍具有相同干扰素的功能或活性；更优选的，与seqidno.2所述的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且所述多核苷酸序列编码的蛋白仍具有相同干扰素的功能或活性。
本发明的另一方面为提供一种羊γ干扰素突变体，所述羊的γ干扰素突变体为将所述seqidno.1所示的氨基酸序列进行如下e32t、e36d、n42t、p43s、k47n、s53l、l79f、n82t、l83f、v88a、i95v、k103r、e110g、k116e、q120k、n134s、k146r、n157t、r160q中的任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体；优选地，在本发明所述的羊γ干扰素突变体中，所述羊的γ干扰素突变体为所述seqidno.1所示的氨基酸序列进行如下进行e32t、l79f、k103r、q120k、n157t中的任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体；更优选地，所述羊的γ干扰素突变体为所述seqidno.1所示的氨基酸序列进行q120k氨基酸单位点突变获得的突变体，所述突变体的氨基酸序列为seqidno.5所示，所述突变体编码基因的核苷酸序列为seqidno.6所示。
本发明的另一方面为提供一种羊γ干扰素突变体，所述羊的γ干扰素突变体为将所述seqidno.1所示的氨基酸序列进行e32t-l79f、e32t-k103r、e32t-q120k、e32t-n157t、l79f-k103r、l79f-q120k、l79f-n157t、k103r-q120k、k103r-n157t、q120k-n157t中的任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体；优选地，所述羊的γ干扰素突变体为将所述seqidno.1所示的氨基酸序列进行l79f-q120k、k103r-q120k、e32t-n157t任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体；更优选地，，所述羊的γ干扰素突变体为将所述seqidno.1所示的氨基酸序列进行l79f-q120k氨基酸双位点突变获得的突变体，所述突变体的氨基酸序列为seqidno.7所示，所述突变体的编码基因的核苷酸序列为seqidno.8所示。
本发明的另一方面为提供一种羊γ干扰素突变体，所述羊的γ干扰素突变体为将所述seqidno.1所示的氨基酸序列进行e32t-l79f-k103r、f32t-l79f-q120k、e32t-l79f-n157t、l79f-k103r-q120k、l79f-k103r-n157t、k103r-q120k-n157t任何一种氨基酸多位点突变获得的突变体；优选地，所述羊的γ干扰素突变体为将所述seqidno.1所示的氨基酸序列进行l79f-k103r-q120k氨基酸多位点突变获得的突变体；更优选地，所述羊的γ干扰素为将所述seqidno.1所示的氨基酸序列进行l79f-k103r-q120k氨基酸多位点突变获得的突变体，所述突变体的氨基酸序列为seqidno.9所示，所述突变体的编码基因的核苷酸序列为seqidno.10所示。
本发明的再一方面为提供含有上述羊γ干扰素或羊γ干扰素突变体的重组载体或重组宿主细胞。
本发明的又一方面为提供上述羊γ干扰素或羊γ干扰素突变体在制备预防或治疗羊病毒性疾病的药物或试剂中的用途。
优选地，本发明所述羊γ干扰素或羊γ干扰素突变体在制备预防或治疗羊病毒性疾病的药物或试剂中的用途中，所述羊病毒性疾病包括：羊痘病毒感染、羊传染性脓疱病毒感染或水疱性口炎病毒感染所致疾病，或者牛呼吸道合胞体病毒病中的任何一种或多种。
本发明的又一方面为制备上述羊的γ干扰素或羊γ干扰素突变体的方法，包括以下步骤：
(1)分别将权利要求1所述羊的γ干扰素的编码基因或者权利要求2至4任何一项所述羊的γ干扰素突变体的编码基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；
(2)将所述重组转移载体与杆状病毒dna共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；
(3)将所述重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的蛋白，纯化，即得。
优选地，在制备本发明所述羊γ干扰素或羊γ干扰素突变体的方法中，所述杆状病毒转移载体选自acrp23-lacz、acrp6-sc、acuwl-lacz、bacpak6、bactopac、bacmid、blucbacii(petl)、p2bac、p2blue、p89b310、pac360、pac373、pacab3、pacab4、pacas3、pacc129、pacc4、dzi、pacgp67、paciel、pacjpl、pacmlf2、pacmlf7、pacmlf8、pacmpl、pacmp2、pacrp23、pacrp25、pacrw4、pacsmag、pacuwl、pacuw21、pacuw2a、pacuw2b、pacuw3、pacuw31、pacuw41、pacuw42、pacuw43、pacuw51、pacvc2、pacvc3、pacyml、pacjcc5、pbacl、pbac2、pbluebaciii、pbluebachis、pev55、mxiv、pieineo、pjvetl、pjvnhel、pjvp10、pjvrsmag、pmbac、pp10、ppakl、ppbac、pshonex1.1、psynxivvi+、psynvi+wp、psynxivvi-、pvl1391、pvl1392、pvl1393、pvl941、pvl945、pvl985、pvtbac、pbm030或puac-5；优选地，所述杆状病毒选自家蚕杆状病毒亲本株bmbacmid、bmnpv、acmnpv、apnpv、hanpv、hznpv、ldmnpv、mbmnpv、opmnpv、slmnpv、semnpv或spltnpv；优选地，所述昆虫宿主选自家蚕(bombyxmori)、野蚕(bombyxmandarina)、蓖麻蚕(philosamiacynthiaricim)、樟蚕(dictyoplocajapanica)、樗蚕(philosamiacynthiapryeri)、柞蚕(antheraeapernyi)、日本柞蚕(antheraeayamamai)、野天蚕(antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(atographacaliforica)、茶尺蠖(ectropisobliqua)、甘兰夜蛾(mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(spodopteralittoralis)、秋粘虫(spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(trichoplusiani)、行军虫(thaumetopoeawilkinsoni)、棉铃虫(heliothisarmigera)、美国棉铃虫(heliothiszea)、烟青虫(heliothisassulta)、烟草夜蛾(heliothisvirescens)、东方粘虫(pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(lymantriadispar)；优选地，所述杆状病毒转移载体为pvl1393；所述杆状病毒为家蚕杆状病毒亲本株bmbacmid；所述昆虫宿主为家蚕(bombyxmori)；其中，步骤3)中所述感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体。本发明与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明通过分析ncbi上所有羊的γ干扰素氨基酸序列，进行序列比对及信号肽分析，最终确定以登录号为np_001009803.1的氨基酸序列为主要参考序列，以密码子优化后的序列为模板设计多对引物用融合pcr法进行氨基酸单位点突变、氨基酸双位点突变、氨基酸多位点突变，获得了多个羊的γ干扰素突变体。本发明利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕生物反应器中表达所述羊的γ干扰素突变体，所表达的羊的γ干扰素突变体的抗病毒活性大幅度提高，具有较为明显的抗病毒活性。本发明方法工艺简单，可快速获得大量安全可靠的羊的γ干扰素。本发明所述的羊的γ干扰素突变体能够用于制备预防或治疗羊病毒性疾病的药物或试剂，对畜牧业的发展具有重大意义。
附图说明
图1为本发明的一个实施例中的细胞病变比例对应的荧光图；
图2为本发明的一个实施例中的重组质粒pvl-ovifn-γ的双酶切鉴定图；
图3为本发明的一个实施例中的细胞出现荧光的各种比例的情况示意图；
具体实施方式
在本发明的一个实施例中，提供了一种羊的γ干扰素(ovifn-γ)，其氨基酸序列为seqidno.1所示，其编码基因的多核苷酸序列为(a)或(b)或(c)所示：
(a)seqidno.2所示的多核苷酸序列；或
(b)与seqidno.2的互补序列在严谨杂交条件能够进行杂交的多核苷酸序列，该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；或
(c)与seqidno.2的多核苷酸序列至少有80％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；优选的，与seqidno.2的多核苷酸序列至少有85％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性；更优选的，与seqidno.2的多核苷酸序列至少有90％以上同源性的多核苷酸序列，且该多核苷酸编码的蛋白仍具有干扰素的功能或活性。
根据家蚕密码子偏好性对羊的γ干扰素基因序列进行密码子优化，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的gc含量、cpg二核苷酸含量、密码子偏好性、mrna的二级结构、mrna自由能稳定性、rna不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高所优化基因在家蚕中的转录效率与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变；为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了kozak序列aac，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为taa。此外，还去除了基因序列内部的bamhi、ecori、smai等限制性酶切位点，在基因上游加上了bamhi，在基因下游加上了ecori限制性酶切位点；得到新的羊γ干扰素优化序列ovifn-γ-o，其氨基酸序列为seqidno.3所示，优化后的基因核苷酸序列为seqidno.4所示。
在本发明的一个实施例中，提供了一种羊的γ干扰素突变体，是将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊的γ干扰素进行e32t、e36d、n42t、p43s、k47n、s53l、l79f、n82t、l83f、v88a、i95v、k103r、e110g、k116e、q120k、n134s、k146r、n157t、r160q任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体；优选为，将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊的γ干扰素进行e32t、l79f、k103r、q120k、n157t任何一种氨基酸单位点突变获得的突变体。其中，将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊的γ干扰素进行q120k氨基酸单位点突变获得的突变体的氨基酸序列为seqidno.5所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.6所示。
其中，本发明所述氨基酸单位点突变q120k，表示将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊的γ干扰素突变体的第120位氨基酸由谷氨酰胺(q)突变成赖氨酸(k)；n157t表示将第157位氨基酸由天冬酰胺(n)突变成苏氨酸(t)；依此类推。
在本发明的一个实施例中，提供了一种羊的γ干扰素突变体，是将氨基酸序列为seqidno.5所示的羊的γ干扰素突变体进行e32t-l79f、e32t-k103r、e32t-q120k、e32t-n157t、l79f-k103r、l79f-q120k、l79f-n157t、k103r-q120k、k103r-n157t、q120k-n157t任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体；优选为，将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊的γ干扰素进行l79f-q120k、k103r-q120k、e32t-n157t任何一种氨基酸双位点突变获得的突变体。其中，将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊的γ干扰素进行l79f-q120k氨基酸双位点突变获得的突变体的氨基酸序列为seqidno.7所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.8所示。
其中，本发明所述氨基酸双位点突变l79f-q120k，表示将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊的γ干扰素的第79位氨基酸由亮氨酸(l)突变成苯丙氨酸(f)，并且将第120位氨基酸由谷氨酰胺(q)突变成赖氨酸(k)；氨基酸双位点突变e32t-q120k表示将第32位氨基酸由谷氨酸(e)突变成苏氨酸(t)，并且将第120位氨基酸由谷氨酰胺(q)突变成赖氨酸(k)；依此类推。
在本发明的一个实施例中，提供了一种羊的γ干扰素突变体，是将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊的γ干扰素进行e32t-l79f-k103r、f32t-l79f-q120k、e32t-l79f-n157t、l79f-k103r-q120k、l79f-k103r-n157t、k103r-q120k-n157t任何一种氨基酸多位点突变获得的突变体；优选为，将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊的γ干扰素进行l79f-k103r-q120k氨基酸多位点突变获得的突变体。其中，将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊的γ干扰素进行l79f-k103r-q120k氨基酸多位点突变获得的突变体的氨基酸序列为seqidno.9所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.10所示。
其中，本发明所述氨基酸多位点突变l79f-k103r-q120k表示将氨基酸序列为seqidno.3所示的羊γ干扰素的第79位氨基酸由亮氨酸(l)突变成苯丙氨酸(f)，并且将第103位氨基酸由赖氨酸(k)突变成精氨酸(r)，同时将第120位氨基酸由谷氨酰胺(q)突变成赖氨酸(k)；依此类推。
本发明申请人分析了ncbi上所有羊的γ干扰素氨基酸序列，最终确定以登录号为np_001009803.1的氨基酸序列为羊的γ干扰素原始氨基酸序列(其氨基酸序列为seqidno.1所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.2所示)，通过信号肽预测，其只有一个肽链切割位点，所以不需要再进行信号肽突变。
本发明以ovifn-γ的优化基因序列为模板设计多对引物，利用融合pcr法进行氨基酸单位点突变、氨基酸双位点突变、氨基酸多位点突变，获得了多个羊的γ干扰素突变体。
其中，在ovifn-γ-o的基础上，分别进行e32t、l79f、k103r、q120k、n157t这5个位点单位点突变后，表达的羊的γ干扰素效价高于ovifn-γ-o表达测得的效价，抗病毒效价达到2.69×106-3.72×106u/ml；而其余位点突变后效价不变甚至降低，说明这5个位点的突变是有效突变，可以达到提高抗病毒活性的目的。其中，进行q120k单位点突变获得的ovifn-γ-o-q120k突变体具有最强抗病毒作用。
本发明进一步将抗病毒活性提高的单突变位点e32t、l79f、k103r、q120k、n157t两两组合，将ovifn-γ-o进行双位点突变。抗病毒活性的检测结果表明，l79f-q120k、k103r-q120k、e32t-n157t三组双突变后，表达的羊的γ干扰素效价高于原序列、单突变序列表达测得的效价，抗病毒效价达到3.98×106-4.68×106u/ml，而其余几组位点突变后效价不变甚至降低，说明这3个组合位点的突变是有效突变，可以达到提高抗病毒活性的目的。其中，进行l79f-q120k双位点突变获得的ovifn-γ-o-l79f-q120k突变体具有最强抗病毒作用。
本发明进一步将获得的具有高效价的双突变位点组合，将ovifn-γ-o进行氨基酸多位点突变。突变体抗病毒活性的检测结果表明，l79f-k103r-q120k三位点突变后，表达的羊的γ干扰素效价远高于原序列、单突变序列、双突变序列表达测得的效价，为6.31×106u/ml；而其余几组位点突变后效价不变甚至降低。说明此组合位点的突变是有效突变，可以达到提高抗病毒活性的目的。
在本发明的一个实施例中，提供了含有所述羊的γ干扰素或者羊γ干扰素突变体的编码基因的重组载体或重组宿主细胞。其中，所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
在本发明的一个实施例中，提供了构建的转移载体，包括：
(1)含有ovifn-γ-o进行氨基酸单位点突变后的突变体(ovifn-γ-o-m1突变体)基因序列的载体pvl-ovifn-o-m1；
(2)含有ovifn-γ-o进行氨基酸双位点突变后的突变体(ovifn-γ-o-m1-m2突变体)基因序列的载体pvl-ovifn-γ-o-m1-m2；
(3)含有ovifn-γ-o进行氨基酸多位点突变后的突变体(ovifn-γ-o-m1-m2-m3突变体)基因序列的载体pvl-ovifn-γ-o-m1-m2-m3。
本发明所获得的重组杆状病毒包括：重组家蚕核型多角体病毒rbmbacmid(ovifn-γ)、rbmbacmid(ovifn-γ-o、ovifn-γ-o-m1、ovifn-γ-o-m1-m2、ovifn-γ-o-m1-m2-m3)。
在本发明的一个实施例中，提供了公开了所述的羊的γ干扰素或者羊的γ干扰素突变体在制备预防或治疗羊病毒性疾病的药物或试剂中的用途。
其中，所述羊病毒性疾病包括：羊痘病毒感染、羊传染性脓疱病毒感染或水疱性口炎病毒感染所致疾病，或者牛呼吸道合胞体病毒病中的任何一种或多种。
在本发明的一个实施例中，提供了一种制备所述羊的γ干扰素或者羊的γ干扰素突变体的方法，包括以下步骤：(1)分别将所述羊的γ干扰素或者所述羊的γ干扰素突变体的编码基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；(2)将重组转移载体与杆状病毒dna共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；(3)将重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿主表达相应的蛋白，纯化，即得。
其中，所述杆状病毒转移载体选自acrp23-lacz、acrp6-sc、acuwl-lacz、bacpak6、bactopac、bacmid、blucbacii(petl)、p2bac、p2blue、p89b310、pac360、pac373、pacab3、pacab4、pacas3、pacc129、pacc4、dzi、pacgp67、paciel、pacjpl、pacmlf2、pacmlf7、pacmlf8、pacmpl、pacmp2、pacrp23、pacrp25、pacrw4、pacsmag、pacuwl、pacuw21、pacuw2a、pacuw2b、pacuw3、pacuw31、pacuw41、pacuw42、pacuw43、pacuw51、pacvc2、pacvc3、pacyml、pacjcc5、pbacl、pbac2、pbluebaciii、pbluebachis、pev55、mxiv、pieineo、pjvetl、pjvnhel、pjvp10、pjvrsmag、pmbac、pp10、ppakl、ppbac、pshonex1.1、psynxivvi+、psynvi+wp、psynxivvi-、pvl1391、pvl1392、pvl1393、pvl941、pvl945、pvl985、pvtbac、pbm030或puac-5；
所述杆状病毒选自家蚕杆状病毒亲本株bmbacmid、bmnpv、acmnpv、apnpv、hanpv、hznpv、ldmnpv、mbmnpv、opmnpv、slmnpv、semnpv或spltnpv；
所述昆虫宿主选自家蚕(bombyxmori)、野蚕(bombyxmandarina)、蓖麻蚕(philosamiacynthiaricim)、樟蚕(dictyoplocajapanica)、樗蚕(philosamiacynthiapryeri)、柞蚕(antheraeapernyi)、日本柞蚕(antheraeayamamai)、野天蚕(antheraeapolyphymus)、苜蓿尺蠖(atographacaliforica)、茶尺蠖(ectropisobliqua)、甘兰夜蛾(mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(spodopteralittoralis)、秋粘虫(spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(trichoplusiani)、行军虫(thaumetopoeawilkinsoni)、棉铃虫(heliothisarmigera)、美国棉铃虫(heliothiszea)、烟青虫(heliothisassulta)、烟草夜蛾(heliothisvirescens)、东方粘虫(pseudaletiaseparata)或舞毒蛾(lymantriadispar)；
优选的，所述杆状病毒转移载体为pvl1393；所述杆状病毒为家蚕杆状病毒亲本株bmbacmid；所述昆虫宿主为家蚕(bombyxmori)。
所述感染是指重组杆状病毒通过吞食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体；优选为，将重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹，在感染3-6天后收集含各种羊γ干扰素基因的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆；其中，所述的蛹最优为1-2天的早期嫩蛹。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、试验材料与试剂
转移载体pvl1393，e.coli菌株top10，bmn细胞，vero细胞，vsv-gfp病毒，购自中国农业科学院生物技术研究所；试验家蚕品种jy1购自江苏科技大学蚕业研究所，亲本病毒bmbacmiddna参见文献(专利号：zl201110142492.4，授权日期：2013.01.23)中所公开的方法构建。限制性内切酶、t4dna连接酶购自promega公司，pcr反应所用的lataqdna聚合酶及其它相关试剂均购自takara公司，脂质体购自invitrogen公司，dmem细胞培养基、胎牛血清为gibco公司产品。有关溶液和培养基的配置方法参照相关工具书(josephetal.，分子克隆实验指南第三版，2002；奥斯伯，等人，精编分子生物学指南，1998；davidl.spector，细胞实验指南，2001)；除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
2、制备方法
制备方法中用于定点突变的融合pcr方法，参照邝翡婷等人(一种载体构建的新方法：重组融合pcr法，基因组学与应用生物学，2012年，第31卷，第6期，第634-639页)所描述的方法进行。
制备方法中计算干扰素的效价，利用vero/vsv*gfp系统，使用reed-muench方法，具体操作参照刘兴健，等(猫ω-like干扰素在家蚕中的表达和生物活性检测，生物技术进展，2015，5(6)：441-445)以及summersmd等(amanualofmethodsforbaculovirusvectorsandinsectcellcultureprocedures[r].texasagriculturalexperimentstation，1987)所描述的方法进行，其中判断细胞病变的标准参照图1，其中，a，“-”：无细胞病变；b，“±”：几个细胞病变；c，“+”：20％～30％细胞病变；d，“++”：50％～60％细胞病变。
每一个实施案例中的最佳改良方案均作为下一实施案例改良方案的比较标准。
实施例1羊γ型干扰素优化基因(ovifn-γ)进行优化后在家蚕生物反应器中的表达与检测
1、实验方法
1.1羊γ型干扰素优化基因的构建
本发明通过分析ncbi上所有羊的γ干扰素氨基酸序列，进行序列比对及信号肽分析，最终确定以登录号为np_001009803.1的氨基酸序列为主要参考序列，用signalp4.1在线对羊ifn-γ氨基酸序列或相关序列进行信号肽预测，发现只有一个肽链切割位点，所以无需突变信号肽。
本发明利用optimumgenetm技术对上述羊γ干扰素基因进行优化，根据生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和蛋白折叠的gc含量、cpg二核苷酸含量、密码子偏好性、mrna的二级结构、mrna自由能稳定性、rna不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高所优化基因在家蚕中的转效率录与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。
为了提高在家蚕杆状病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因前面加了kozak序列aac，为了提高翻译终止效率，终止密码子改为taa。此外，还去除了基因序列内部的bamhi、ecori、smai等限制性酶切位点，在基因上游加上了bamhi，在基因下游加上了ecori限制性酶切位点，以便后续克隆到真核转移载体pvl1393中。
所设计的γ型干扰素基因进行优化后的序列由生物科技公司人工合成，命名为ovifn-γ-o，其核苷酸序列如seqidno.4所示，合成的基因片段插入puc57载体，形成质粒puc57-ovifn，命名为puc57-ovifn-γ-o。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用bamhi和ecori对合成的质粒puc57-ovifn-γ-o进行双酶切处理，玻璃奶法回收目的片段，t4dna连接酶连接目的片段和进行双酶切处理并灭活后的杆状病毒转移载体pvl1393，16℃，连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，用bamhi和ecori双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pvl-ovifn-γ-o(如图2所示，其中，m：dna分子质量标准；1：重组质粒pvl-ovifn-γ双酶切产物；-为阴性对照)。
1.3重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增
根据已有文献报道的方法进行bmn细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当bmn细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清tc-100培养基洗三次，加1.5ml无fbs培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株bmbacmiddna，2μg重组转移质粒pvl-ovifn-γ-o和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μlfbs。27℃恒温培养4～5天，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒rbmbacmid(ovifn-γ-o)。
重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法如下：接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将收集的细胞培养液进行不同浓度稀释，取1ml加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×tc-100培养基(含20％fbs)混合均匀，每个平皿加4ml胶，待凝固后用parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。把不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-γ-o)。
将重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-γ)、rbmbacmid(ovifn-γ-o)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbmbacmid(ovifn-γ)、rbmbacmid(ovifn-γ-o)。
1.4羊γ型干扰素在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105pfu/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，ovifn-γ在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小，停止进食时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5羊γ型干扰素蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在vero/vsv*gfp系统上检测蚕血淋巴中表达的羊γ型干扰素的抗病毒活性。将状态良好的vero细胞以3.0×105个/ml的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70ml/l胎牛血清的dmem培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μl/孔接种于已经铺满vero细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设12个复孔，同时设不加蚕血淋巴及vsv*gfp的细胞对照组和添加vsv*gfp的病毒对照组，于37℃、5％co2条件下培养18～24h。将稀释至100tcid50的vsv*gfp病毒，按100μl/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％co2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pvl-ovifn-γ-o经bamhi和ecori双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段510bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pvl1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核苷酸测序，用megaalign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明羊γ型干扰素突变体基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和ecori之间。
2.2羊干扰素重组病毒的获得及重组产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在vero/vsv*gfp系统上检测家蚕幼虫表达的羊γ型干扰素抗病毒活性。如图3所示，在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组羊γ干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力(图3中a：干扰素抑制vsv病毒显示的荧光；b：vsv病毒感染对照组显示的荧光；c：部分细胞感染vsv病毒显示的荧光)。根据羊γ型干扰素对vero细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素的效价。检测结果列于表1，抗病毒活性测定结果表明在蚕幼虫体内表达的ovifn-γ-o相比于ovifn-γ有较为显著的抗病毒活性，效价达2.51×106u/ml，而ovifn-γ的效价只有1.38×105u/ml达到了预期的效果，说明对羊γ干扰素进行优化的方法来提高ovifn-γ抗病毒活性是可行和有效的。
表1羊γ干扰素突变体优化后抗病毒活性的检测结果
实施例2羊γ型干扰素突变体(ovifn-γ-o)进行氨基酸单位点突变后在家蚕生物反应器中的表达与检测
1、实验方法
1.1羊γ干扰素优化基因的构建
本发明以ovifn-γ-o的基因序列为模板，设计多对引物对序列进行定点突变，定点突变是利用融合pcr的方法进行，融合pcr的方法见前述“2、制备方法”。
突变位点分别为e32t、e36d、n42t、p43s、k47n、s53l、l79f、n82t、l83f、v88a、i95v、k103r、e110g、k116e、q120k、n134s、k146r、n157t、r160q；所得的羊γ干扰素突变体命名为ovifn-γ-o-m1(e32t、e36d、n42t、p43s、k47n、s53l、l79f、n82t、l83f、v88a、i95v、k103r、e110g、k116e、q120k、n134s、k146r、n157t、r160q)突变体。
ovifn-γ-o核苷酸序列进行氨基酸单位点、双位点及多位点突变所需引物：
(1)、两侧上下游引物：
f:
tcataccgtcccaccatcgggcgcggatcaacatgaaatacacatcatc
r:gatctgcagcggccgctccggaattccatggaggctcttcttc
(2)、中间上下游引物
1.
f1:ttcttcaaggaaatcacgaacttgaaggaatacttc
r1:gaagtattccttcaagttcgtgatttccttgaagaa
2.
f2:atcgaaaacttgaaggactacttcaacgctagc
r2:gctagcgttgaagtagtccaacaagttttcgat
3.
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r3:cccttggccacgtcaggggagctagcgttgaagta
4.
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r4：ccacccttggccacgtctgaattgctagcgttgaa
5.
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r5：gaacaatggtccaccattggccacgtcaggatt
6.
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7.
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8.
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9.
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r9：gaataacttgattgtccttgaagttttcgaagagttt
10.
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11.
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12.
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13.
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14.
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15.
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16.
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17.
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18.
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19.
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1.2构建重组杆状病毒转移载体
用重组酶(peasy-uniseamlesscloningandassemblykit)将玻璃奶法回收的上述目的片段与经过bamhi和ecori双酶切的灭活杆状病毒转移载体pvl1393同源重组。重组产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，用bamhi和ecori双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pvl-ovifn-γ-o-m1(e32t、e36d、n42t、p43s、k47n、s53l、l79f、n82t、l83f、v88a、i95v、k103r、e110g、k116e、q120k、n134s、k146r、n157t、r160q)。
1.3重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增
根据已有文献报道的方法进行bmn细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当bmn细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清tc-100培养基洗三次，加1.5ml无fbs培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株bmbacmiddna，2μg重组转移质粒pvl-ovifn-γ-o-m1和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μlfbs。27℃恒温培养4～5天，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒rbmbacmid(ovifn-γ-o-m1)。
重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法如下：接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将收集的细胞培养液进行不同浓度稀释，取1ml加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×tc-100培养基(含20％fbs)混合均匀，每个平皿加4ml胶，待凝固后用parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。把不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(pvl-ovifn-γ-o-m1)。
将重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-γ-o-m1)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbmbacmid(ovifn-γ-o-m1)。
1.4羊γ型干扰素突变体在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105pfu/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，ovifn-γ在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小，停止进食时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5羊γ型干扰素突变体蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在vero/vsv*gfp系统上检测蚕血淋巴中表达的羊γ型干扰素突变体的抗病毒活性。将状态良好的vero细胞以3.0×105个/ml的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70ml/l胎牛血清的dmem培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μl/孔接种于已经铺满vero细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设12个复孔，同时设不加蚕血淋巴及vsv*gfp的细胞对照组和添加vsv*gfp的病毒对照组，于37℃、5％co2条件下培养18～24h。将稀释至100tcid50的vsv*gfp病毒，按100μl/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％co2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pvl-ovifn-γ-o-m1经bamhi和ecori双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段510bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pvl1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核苷酸测序，用megaalign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明羊γ型干扰素突变体基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和ecori之间。
2.2羊干扰素重组病毒的获得及重组产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在vero/vsv*gfp系统上检测家蚕幼虫表达的羊γ型干扰素抗病毒活性。在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组羊γ干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据羊γ型干扰素对vero细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素效价，检测结果列于表2，所有羊γ干扰素突变体测得效价为1.26×105u/ml～3.72×106u/ml，其中e32t、l79f、k103r、q120k、n157t这5个位点突变后，表达的羊γ干扰素效价略高于原序列表达测得的效价，而其余位点突变后效价不变甚至降低，说明这5个位点的突变是有效突变，可以达到提高ovifn-γ抗病毒活性的目的。其中，ovifn-γ-o-q120k突变体具有最强抗病毒作用，其氨基酸序列为seqidno.5所示，编码基因的核苷酸序列为seqidno.6所示。
表2重组羊γ干扰素单位点突变抗病毒活性的检测结果
实施例3ovifn-γ-o-m1突变体进行氨基酸双位点突变后在家蚕生物反应器中的表达与检测
1、实验方法
1.1羊γ型干扰素突变体基因的构建
鉴于实施例2的结果，确定部分位点的突变是有效突变，可以达到提高ovifn-γ的抗病毒活性目的。考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，且实施例1中进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置可能是相互关联的，故尝试进行氨基酸双位点突变。本发明将抗病毒活性提高的单突变位点e32t、l79f、k103r、q120k、n157t两两组合，进行双位点突变，双位点突变是在实施例2获得的单位点突变序列的基础之上，以其(ovifn-γ-o-m1)作为模板，利用相应的引物(详见实施例2)，通过融合pcr的方法进行第二位的定点突变，从而获得双位点突变的目的片段，融合pcr的方法见前述“2、实验方法”。
双突变位点为e32t-l79f、e32t-k103r、e32t-q120k、e32t-n157t、l79f-k103r、l79f-q120k、l79f-n157t、k103r-q120k、k103r-n157t、q120k-n157t共10种组合，所获得的羊γ干扰素突变体命名为ovifn-γ-o-m1-m2(e32t-l79f、e32t-k103r、e32t-q120k、e32t-n157t、l79f-k103r、l79f-q120k、l79f-n157t、k103r-q120k、k103r-n157t、q120k-n157t)突变体。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用重组酶(peasy-uniseamlesscloningandassemblykit)将玻璃奶法回收的上述目的片段与经过bamhi和ecori双酶切的灭活杆状病毒转移载体pvl1393同源重组。重组产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，用bamhi和ecori双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pvl-ovifn-γ-o-m1-m2(e32t-l79f、e32t-k103r、e32t-q120k、e32t-n157t、l79f-k103r、l79f-q120k、l79f-n157t、k103r-q120k、k103r-n157t、q120k-n157t)。
1.3重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增
根据已有文献报道的方法进行bmn细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当bmn细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清tc-100培养基洗三次，加1.5ml无fbs培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株bmbacmiddna，2μg重组转移质粒pvl-ovifn-γ-o-m1-m2和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μlfbs。27℃恒温培养4～5天，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒rbmbacmid(ovifn-γ-o-m1-m2)。
重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法如下：接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将收集的细胞培养液进行不同浓度稀释，取1ml加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×tc-100培养基(含20％fbs)混合均匀，每个平皿加4ml胶，待凝固后用parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。把不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-γ-o-m1-m2)。
将重组家蚕杆状病毒rbmbacmid(ovifn-γ-o-m1-m2)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbmbacmid(ovifn-γ-o-m1-m2)。
1.4羊γ型干扰素突变体在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105pfu/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，ovifn-γ在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小，停止进食时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5羊γ型干扰素突变体蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在vero/vsv*gfp系统上检测蚕血淋巴中表达的羊γ型干扰素突变体的抗病毒活性。将状态良好的vero细胞以3.0×105个/ml的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70ml/l胎牛血清的dmem培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μl/孔接种于已经铺满vero细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设12个复孔，同时设不加蚕血淋巴及vsv*gfp的细胞对照组和添加vsv*gfp的病毒对照组，于37℃、5％co2条件下培养18～24h。将稀释至100tcid50的vsv*gfp病毒，按100μl/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％co2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pvl-ovifn-γ-o-m1-m2经bamhi和ecori双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段510bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pvl1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核苷酸测序，用megaalign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明羊γ型干扰素突变体基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和ecori之间。
2.2羊干扰素重组病毒的获得及重组产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在vero/vsv*gfp系统上检测家蚕幼虫表达的羊γ型干扰素抗病毒活性。在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组羊γ干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据羊γ型干扰素对vero细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素效价，检测结果列于表3，所有羊γ干扰素突变体测得效价在3.98×105u/ml～4.68×106u/ml，其中l79f-q120k、k103r-q120k、e32t-n157t组双突变后，表达的羊γ干扰素效价略高于原序列、单突变序列表达测得的效价，而其余几组位点突变后效价不变甚至降低，说明这3个组合位点的突变是有效突变，可以达到提高ovifn-γ-o-m1突变体抗病毒活性的目的。其中，ovifn-γ-o-l79f-q120k突变体具有最强抗病毒作用，其氨基酸序列为seqidno.7所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.8所示
表3重组羊γ干扰素双位点突变抗病毒活性的检测结果
实施例4ovifn-γ-o-m1-m2突变体进行氨基酸多位点突变后在家蚕生物反应器中的表达与检测
1、实验方法
1.1羊γ型干扰素突变体基因的构建
鉴于实施例2的结果，考虑到氨基酸的排列顺序是蛋白质的一级结构，并决定着蛋白质的高级结构，推测可能是由于进行的氨基酸单位点突变有部分突变位点的位置相互靠近彼此关联的，故尝试进行氨基酸多位点突变。本发明将获得的具有高效价的双突变位点组合，确定第三个突变位点，多位点突变是在实施例3获得的双位点突变序列的基础之上，以其(ovifn-γ-o-m1-m2)作为模板，利用相应的引物(详见实施例2)，通过融合pcr的方法进行第三位的定点突变，从而获得多位点突变的目的片段，融合pcr的方法见前述“2、实验方法”。
获得了以下6种组合：e32t-l79f-k103r、f32t-l79f-q120k、e32t-l79f-n157t、l79f-k103r-q120k、l79f-k103r-n157t、k103r-q120k-n157t。所获得的羊γ干扰素突变体命名为ovifn-γ-o-m1-m2-m3(e32t-l79f-k103r、f32t-l79f-q120k、e32t-l79f-n157t、l79f-k103r-q120k、l79f-k103r-n157t、k103r-q120k-n157t)突变体。
1.2构建重组杆状病毒转移载体
用重组酶(peasy-uniseamlesscloningandassemblykit)将玻璃奶法回收的上述目的片段与经过bamhi和ecori双酶切的灭活杆状病毒转移载体pvl1393同源重组。重组产物转化大肠杆菌感受态细胞top10，挑选菌落培养，提质粒，用bamhi和ecori双酶切鉴定阳性克隆，将鉴定正确的重组质粒送北京擎科生物技术有限公司测序，测序正确的质粒命名为pvl-ovifn-γ-o-m1-m2-m3(e32t-l79f-k103r、f32t-l79f-q120k、e32t-l79f-n157t、l79f-k103r-q120k、l79f-k103r-n157t、k103r-q120k-n157t)。
1.3重组家蚕杆状病毒的获得、纯化与扩增
根据已有文献报道的方法进行bmn细胞的复苏、传代以及重组病毒的筛选。当bmn细胞培养至细胞单层达80％左右时，倒掉旧培养基，用无血清tc-100培养基洗三次，加1.5ml无fbs培养基。向一灭菌管中依次加入1μg家蚕杆状病毒亲本株bmbacmiddna，2μg重组转移质粒pvl-ovifn-γ-o-m1-m2-m3和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15min后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4h后补加1.5ml无血清培养基和300μlfbs。27℃恒温培养4～5天，至细胞脱落浮起，收集细胞培养液，获得含有目的基因的重组病毒rbm-bacmid(ovifn-γ-o-m1-m2-m3)。
重组家蚕杆状病毒的纯化和扩增方法如下：接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将收集的细胞培养液进行不同浓度稀释，取1ml加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1h后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×tc-100培养基(含20％fbs)混合均匀，每个平皿加4ml胶，待凝固后用parafilm封口，27℃倒置培养3～5d，显微镜观察。把不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rbm-bacmid(ovifn-γ-o-m1-m2-m3)。
将重组家蚕杆状病毒rbm-bacmid(ovifn-γ-o-m1-m2-m3)感染正常生长的bmn细胞，培养3天后收集上清液，上清中即含有大量的重组病毒rbm-bacmid(ovifn-γ-o-m1-m2-m3)。
1.4羊γ型干扰素突变体在家蚕体内表达
将重组病毒培养液按105pfu/头的剂量注射5龄起蚕，在27℃、70％～80％湿度的条件下培养，家蚕幼虫生长晚期，ovifn-γ在多角体基因启动子的作用下得到高效表达。接种感染3.5d～4d左右，可以观察到家蚕幼虫体节肿胀、行为异常、食欲下降等症状，当观察到幼虫体积明显缩小，停止进食时，收集血淋巴，-20℃保存备用。
1.5羊γ型干扰素突变体蛋白抗病毒活性检测
采用微量细胞病变抑制法在vero/vsv*gfp系统上检测蚕血淋巴中表达的羊γ型干扰素突变体的抗病毒活性。将状态良好的vero细胞以3.0×105个/ml的密度接种于96孔培养板中。将已超声破碎并过滤除菌的蚕血淋巴用含70ml/l胎牛血清的dmem培养液配制成不同稀释度的溶液，将稀释好的样品按100μl/孔接种于已经铺满vero细胞的培养孔内，每个稀释度和对照蚕血至少设12个复孔，同时设不加蚕血淋巴及vsv*gfp的细胞对照组和添加vsv*gfp的病毒对照组，于37℃、5％co2条件下培养18～24h。将稀释至100tcid50的vsv*gfp病毒，按100μl/孔加入已经吸弃上清液的培养孔内，置于37℃、5％co2条件下培养。在倒置荧光显微镜下观察，当病毒对照组各孔中大量细胞出现荧光，而细胞对照组中的细胞仍完全生长良好，无荧光出现时，则表明对照系统完全合格，即可作全面观察。
2、实验结果
2.1重组转移载体的鉴定
重组转移载体pvl-ovifn-γ-o-m1-m2-m3经bamhi和ecori双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳分离出2个片段，小片段位于500-750bp之间，与目的基因片段510bp大小相符，大片段位于8000bp上方，与pvl1393片段9607bp大小相符。将酶切鉴定正确的质粒送北京擎科新业生物技术有限公司进行核苷酸测序，用megaalign比对结果表明序列与原先设计的序列一致，表明羊γ型干扰素突变体基因已成功插入到pvl1393转移载体中bamhi和ecori之间。
2.2羊干扰素重组病毒的获得及重组产物的检测
应用微量细胞病变抑制法在vero/vsv*gfp系统上检测家蚕幼虫表达的羊γ型干扰素抗病毒活性。在倒置荧光显微镜下观察到，细胞对照组中的细胞生长状态良好，无荧光出现；感染病毒对照组中的细胞发生病变，大多数细胞出现荧光，添加重组羊γ干扰素蛋白的细胞具有抵抗病毒感染的能力。根据羊γ型干扰素对vero细胞的保护作用，观察细胞的病变程度，待有绿色荧光细胞出现，这一孔细胞就记为“+”，按照reed-muench方法计算干扰素效价，检测结果列于表4，所有羊γ干扰素突变体测得效价在3.24×105u/ml～6.31×106u/ml，其中l79f-k103r-q120k三位点突变后，表达的羊γ干扰素效价远高于原序列、单突变序列、双突变序列表达测得的效价，为6.31×106u/ml。而其余几组位点突变后效价不变甚至降低，说明此组合位点的突变是有效突变，可以达到提高ovifn-γ-o-m1-m2突变体抗病毒活性的目的。ovifn-γ-o-l79f-k103r-q120k突变体的氨基酸序列为seqidno.9所示，其编码基因的核苷酸序列为seqidno.10所示。
表4重组羊γ干扰素多位点突变抗病毒活性的检测结果
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>浙江善测禾骑士生物科技有限公司
<120>一种羊的γ干扰素突变体及其制备方法与应用
<160>10
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