本发明属于植物基因工程
技术领域：
，具体地说，涉及紫云英leafy基因、其编码蛋白及其在花期调控中的应用。
背景技术：
：紫云英(astragalussinicusl.)，豆科黄芪属越年生草本植物，原产中国，是重要的绿肥作物，同时也是优质的豆科牧草和蜜源植物，中国、韩国、日本等亚洲国家普遍种植。紫云英是重要的清洁有机肥源，在绿肥中占有相当高的比例，对优化土壤的理化性质，培肥土壤，改善土壤生态环境发挥着巨大作用。上世纪八十年代以来，随着化肥工业的发展，长期大量使用化肥、农药，单纯追求作物产量的耕作和施肥方式，使得土壤资源面临着严重的生产和生态危机。紫云英对土壤资源的可持续利用，具有重要意义，近年来，国家对于紫云英的科研和生产的投入大大增加。成花是植物从营养生长向生殖生长的关键转换，同时也是是实现世代交替的中心环节，在很大程度上决定了植物繁殖的成功与否。紫云英按开花早晚可分特早花型、早花型、中花型和晚花型，开花时间直接决定了有效生长季的长短。作为绿肥，紫云英的种植和收获时间取决于主作物，保证紫云英产量的同时还要与主作物的生育期相协调。在合适的时间促使或避免开花，根据当地的耕作制度选育花期适当的品种是重要的育种目标。因此，成花基因研究对紫云英生长发育及遗传改良具有重要意义。但对于紫云英成花机制的研究，国内外均无深入的研究，开花相关基因在此过程中的作用还不清楚。leafy基因是植物界所特有的基因，属于花原基分化特异性基因，控制着茎尖分生组织向花序分生组织的转变，它不属于目前所知道的任何一个基因家族。已公布的leafy基因序列比对发现，不同植物leafy同源基因编码区长度变化不大，最长的为拟南芥，长为1275bp，编码424个氨基酸，最短的为桉树，长为1080bp，编码359个氨基酸。leafy基因在植物成花过程中发挥重要作用，控制花序分生组织向花分生组织的转变，以及植物的开花时间。在成花转变中，leafy基因的参与是花分生组织形成的关键。leafy基因在成花前表达于叶原基，但是当其表达量积累到一定水平后则抑制叶原基的启动，抑制分生组织细胞向营养生长发育的转变，从而使更多分生组织细胞形成花原基。leafy基因在维持花分生组织的正常功能、花启动、防止花分生组织的逆转等过程中均起作用。在拟南芥中超表达该基因可以使侧枝转变为花，并能使花期提前。超表达该基因可以使本来8-10年开花的杨树经6-7个月的营养生长后就能开花。除此之外，该基因还在花序和花发育的各个阶段中发挥着作用，在高等植物的营养生长和生殖的各个阶段都有广泛的表达，在生殖阶段，表达量明显增大。技术实现要素：本发明的目的是提供紫云英leafy基因及其应用。本发明首先提供紫云英leafy基因，其具有：1)seqidno.1所示的核苷酸序列；或2)seqidno.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与1)限定的dna序列杂交的核苷酸序列。本发明提供了上述紫云英leafy基因编码的蛋白，其具有：1)如seqidno.2所示的氨基酸序列；或2)seqidno.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明提供了含有上述编码紫云英leafy基因的生物材料，所述生物材料为表达载体、宿主细胞或表达盒。本发明提供了上述紫云英leafy基因或其编码的蛋白或含有该基因的生物材料在促进植物提早抽薹中的应用。本发明提供了上述紫云英leafy基因或其编码的蛋白或含有该基因的生物材料在促进植物提前开花中的应用。本发明提供了上述紫云英leafy基因或其编码的蛋白或含有该基因的生物材料在增加植物开花数目中的应用。本发明提供了上述紫云英leafy基因或其编码的蛋白或含有该基因的生物材料在制备转基因植物中的应用。本发明提供了上述紫云英leafy基因或其编码的蛋白或含有该基因的生物材料在植物种质资源改良中的应用。所述植物为紫云英、拟南芥。本发明提供的紫云英leafy基因序列如seqidno.1所示，其编码蛋白序列如seqidno.2所示。通过农杆菌介导法侵染拟南芥，将该基因转入拟南芥中，得到转紫云英leafy基因的拟南芥株系，结果发现转紫云英leafy基因的拟南芥株系出现抽薹提前，开花提前，抽薹天数比野生型平均早3d，开花天数比野生型平均早2d，开花数比野生型平均多1.79个。这表明了紫云英leafy基因与成花关系密切，其具有调节开花时间的功能。将该基因应用于植物性状改良，具有良好的应用前景。为开发调控成花的技术手段提供理论依据，同时为分子育种改良紫云英性状奠定基础。附图说明图1为实施例1目的片段电泳图，其中右泳道为markerdl2000；左泳道为目的片段。图2为5’race实验目的片段电泳图。图3为3’race实验目的片段电泳图。图4为leafy蛋白质二级结构预测及功能位点注释图。图5为利用mega5.2构建的leafy基因氨基酸序列的nj系统进化树(数字为置信度)。bootstrep设置为1000，采用jones-thorton-taylor模型构建nj树。图6为leafy基因在紫云英不同器官中的表达量比较图。图7为超表达leafy基因拟南芥植株的pcr阳性检测，从左至右泳道依次是目的基因p1233checkf/p1233r引物检测，泳道12为阴性对照。图8为生长32d后的拟南芥植株图片，左侧为野生型，右侧为转leafy基因拟南芥。图9为超表达紫云英leafy基因拟南芥的抽薹天数、开花天数和开花数统计。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的生化试剂、材料均为市售可得。实施例1紫云英leafy基因的获得1.试验材料新鲜紫云英组织样本。2.rna提取与cdna第一链的合成常规方法提取rna，使用fermentas公司的revertaidfirststrandcdnasynthesiskit合成cdna第一链。3.引物的设计及序列采用primerpremier5.0软件进行验证实验引物的设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。表1引物名称及序列4.5’race实验4.1引物的设计及序列利用转录组测序验证结果，采用primerpremier5.0软件设计两条特异性5’race引物，见表1。由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。4.2目的基因第一链cdna的合成使用superscriptiirt酶和引物gsp-1对总rna进行目的基因第一链cdna的合成，使用rnasemix对合成的cdna进行去rna处理。4.3使用dnapurificationsystem:glassmaxdnaisolationspincartridges对经rnaase处理过的cdna进行纯化。4.4使用tdt酶和dctp对纯化后的cdna进行末端加上多聚c4.5使用引物gsp-2和试剂盒里面带的桥连铆钉引物aap对已经加dc尾的cdna进行pcr第一轮扩增。4.6使用引物gsp-3和试剂盒里面带的桥连通用扩增引物auap进行巢式pcr第二轮扩增。4.7目的片段的回收纯化将第二轮pcr产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，步骤按回收试剂盒说明书进行，电泳检测结果见图2。4.8目的片段的克隆及测序纯化后的pcr产物与pmd18t进行连接，转化后对阳性克隆进行测序，结果见seqidno.11。5.3’race实验5.1引物的设计及序列利用转录组测序验证结果，采用primerpremier5.0软件设计两条特异性3’race引物，见表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成。5.2实验方法及结果1)使用逆转录酶smartscribetmreversetranscriptase和引物3’cdsprimera对总rna进行逆转录合成cdna.2)使用引物rlfy-f1和upm(5'-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3'(long)；5'-ctaatacgactcactatagggc-3‘(short))，以前述合成的cdna为模板进行第一轮pcr扩增。3)将第一轮pcr扩增产物稀释50倍，然后用引物rlfy-f2和upm进行第二轮pcr扩增。4)将第二轮pcr产物进行电泳并对目的条带进行切胶回收纯化，电泳结果见图3。5)纯化后的pcr产物与pmd18t进行连接，转化后送至上海生工直接测序。6.根据转录组序列验证，5’raec和3’race结果，拼接出实验目的基因的全长cdna序列，然后通过ncbi比对分析预测出基因的起始和终止密码子位置。结果见seqidno.1，其编码的蛋白氨基酸序列如seqidno.2所示。实施例2紫云英leafy基因的生物信息分析1、orf识别race技术获得的leafy基因(seqidno.1)的全长cdna长度为1400p，含有一个1191bp长的开放阅读框，5’和3’非编码区的长度分别为33bp和176bp，polya尾巴位于1386-1400bp处。见图4。2、序列组分和理化性质分析使用protparam进行蛋白质氨基酸含量和理化性质分析。leafy基因编码的蛋白质含有396个氨基酸，其分子量为44723道尔顿，理论等电点为6.41，其化学组分如表2所示。该蛋白含有59个带负电荷的氨基酸残基和56个带正电荷的氨基酸残基，它的n端以蛋氨酸起始。该蛋白共含有6222个原子，其中碳原子1956个，氢原子3075个，氮原子579个，氧原子594个，硫原子15个，其脂肪族指数为72.20，疏水性指数为-0.651，不稳定性指数为51.52。综合以上数据，该蛋白被归类为不稳定性蛋白。发现紫云英leafy蛋白含有一个典型的floricaula/leafyprotein结构域(ipr002910)。表2leafy基因编码蛋白的化学组分氨基酸数量数量占比质量占比氨基酸数量数量占比质量占比ala(a)358.80％6.02％lys(k)205.10％5.64％arg(r)369.10％12.10％met(m)82.00％2.30％asn(n)164.00％4.08％phe(f)123.00％3.82％asp(d)215.30％5.39％pro(p)225.60％4.89％cys(c)71.80％1.64％ser(s)225.60％4.46％gln(q)133.30％3.67％thr(t)143.50％3.22％glu(e)389.60％10.79％trp(w)61.50％2.36％gly(g)317.80％4.49％tyr(y)143.50％4.89％his(h)102.50％2.99％val(v)266.60％5.88％ile(i)164.00％4.05pyl(o)00.00％0.00％leu(l)297.30％7.34sec(u)00.00％0.00％3、磷酸化位点预测应用clcgenomicsworkbench进行leafy蛋白的二级结构预测，该蛋白由396个氨基酸组成，包含22个α螺旋和5个β折叠。氨基酸序列中的酰胺化位点和n-糖基化位点已在图4中标注。用netphos预测蛋白质中丝氨酸、苏氨酸和络氨酸的磷酸化位点，在leafy蛋白质中共预测出8个丝氨酸磷酸化位点，2个苏氨酸磷酸化位点和2个络氨酸磷酸化位点(表3)。表3磷酸化位点预测结果4、进化树构建应用blastp程序对紫云英的leafy蛋白与其他9个物种同源蛋白进行了比较分析，结果显示物种之间有一定的相似性(表4)。其中，紫云英与蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)和紫花苜蓿(medicagosativa)的leafy蛋白的相似度达到85.43％，与鹰嘴豆(cicerarietinum)leafy蛋白的相似度分别达到了84.67％，这一结果表明紫云英leafy蛋白与这几个物种有一定的同源性。用mega5.2软件进行不同物种leafy蛋白进化树的构建，结果显示紫云英与鹰嘴豆(cicerarietinum)，蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)，紫花苜蓿(medicagosativa)和豌豆(pisumsativum)聚为一类(图5)，可能具有相似的功能。应用clcgenomicsworkbench软件进行多序列比对。表4紫云英leafy蛋白与其他物种leafy蛋白的比较分析5、同源建模和蛋白质三级结构预测蛋白三维结构的预测是基于同源建模的i-tasser在线软件(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/i-tasser/)预测得到的。模板结构与预测结构的相似性由tm值和rmsd值来衡量。两个结构的重叠图是由pymol软件(http://pymol.sourceforge.net)得到的。预测得到的结构整体质量好坏由c值衡量。c值是由穿线使用的模板序列和模拟结构聚合的参数计算得到的，值一般在-5到2之间。c值越高说明预测得到的结构越可信，反之亦然。结果显示，紫云英leafy和拟南芥leafy分别有396和420个氨基酸组成。拟南芥leafy蛋白在pdb数据库里的id为2vy1。紫云英leafy蛋白的三维结构是以2vy1为模板在i-tasser软件上预测的。紫云英leafy蛋白从红色的碳端到蓝色的氮端。预测的蛋白结构c值为-0.98，表示其与2vy1的a链在折叠和二级结构方面非常类似。显示目标蛋白和模板蛋白的结构相似性的dna溶解温度(meltingtemperature,tm)值为0.59±0.14，均方根偏差(rootmeansquaredeviation,rmsd)值为实施例3紫云英leafy基因在紫云英各组织的相对表达水平检测1、总rna提取紫云英均为温室种植的植物材料，是用普通紫云英植株材料采集种子培养而成的新鲜紫云英组织样本，种植于浙江省农业科学院温室。表5样品rna含量及纯度2、荧光定量pcr引物设计和合成采用primerpremier6.0和beacondesigner7.8软件进行定量pcr引物设计，然后由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，荧光定量检测引物和内参引物序列见表1。3、real-timepcr扩增体系和反应条件表6定量pcr反应体系及条件4、real-timepcr基因表达差异统计分析每个样品重复三次，各个基因的相对表达水平以2(ct内参基因－ct目的基因)进行统计分析。结果见表7。表7以18srrna为内参，应用qrt-pcr检测leafy基因在不同器官中的表达，结果表明，leafy基因在各器官中均有表达，表达量由高到低依次为花芽、花、叶、叶芽、根、茎和荚。经spss软件分析，在不同器官间，紫云英leafy基因在花芽、花中表达差异显著(p＜0.05)，在叶、叶芽、根、茎和荚果中差异不显著(图6)。由此可说明leafy基因的表达具有组织特异性，可能在紫云英花发育过程中起到重要的作用。实施例4转基因拟南芥的培养及其表型分析1、含本发明紫云英leafy基因(seqidno.1)的重组质粒的构建。2、转化农杆菌感受态将测序正确的重组质粒转化农杆菌感受态。菌落pcr鉴定表明载体质粒已成功转入到农杆菌中。3、拟南芥转化流程(花序浸染法)(1)种植：选择吸水性好，土质松软的至石配合营养土(1：1/2)作为拟南芥种植土壤。直径9cm的花盆，每盆播种100-150颗。播种以后在花盆上罩上薄膜，给植株的生长提供一个湿润的环境。(2)移栽：播种10-15天，待拟南芥幼苗长至四叶时期开始移栽，每盆4-5棵。(3)去顶：拟南芥初次开花时将花蕾剪掉，可以促进侧枝更多的花枝的增生。适合转化植株的花卉并没有成熟，也没有产生已受精的角果。(4)配制浸染液：在5％的蔗糖溶液中重悬转化后的农杆菌使od＝0.8，为了保持蔗糖溶液的新鲜，可以现配现用，无需灭菌。100-200ml浸染2-3个小盆植株，400-500ml浸染，2-3个花盆(9cm)植株。在浸染之前加入表面活性剂至浓度0.05％(500ul/l)。(5)浸染：将盛花期拟南芥的花表面部分浸泡在转化后的农杆菌悬浮液中20-30s，同时轻轻旋转。(6)暗培养：将浸染后植株套袋保持高度的湿润状态暗室培养24h。(7)浸染后培养：隔天浇水，保证水分充足即可。(8)种子收集：种子成熟，角果自然开裂后可以收种子。(9)转基因种子筛选：在含有潮霉素抗生素的平板上培养浸染后所得种子。40mg的种子大约200颗于含潮霉素10-50μg/ml的0.5×ms培养基上春化2天，之后在持续光照条件下培养7-10天。根据生长状况判断是否为转基因种子。成功转入重组质粒的种子能够在抗性培养及上正常生长出4片以上真叶。非转基因种子不能正常生长，仅能长出2片子叶，根的生长也受到严重抑制，一般萌发10天后死亡。(10)转基因植株转土栽培。转基因种子在ms+潮霉素平板上萌发2周以后，将阳性植株转入土壤继续培养。(11)pcr鉴定：取阳性植株叶片进行基因组dna的提取并使用目的基因序列和载体35s启动子序列引物进行pcr验证，引物序列为p1233checkf：5'-ctagacgaggaggtgtc-3'(seqidno.17)；p1233r：5'-ccgctcgaggaaaggaagatgggcacttc-3’(seqidno.18)。检测结果见图7。检测转基因阳性植株。从左至右依次是植物筛选标记潮霉素基因检测。潮霉素f：gagcatatacgcccggagtc，潮霉素r：gtctccgacctgatgcagctctcgg。将leafy基因转化到农杆菌c5c81，利用花序法侵染拟南芥。将待检测的拟南芥种子在抗性培养基上种植，转化成功的植株能够正常生长，而未转化成功的植株是黄色死亡植株leafy基因未转化成功。将初筛得到的幼苗移栽到培养钵中继续培养，当生长至10～12片时，剪取叶片进行基因组dna的提取，并使用目的片段扩增引物及载体35s启动子序列引物进行pcr检测，电泳结果出现目的条带，表明leafy基因已经整合到拟南芥基因组中。4、转基因拟南芥表型分析播种转基因拟南芥t2代，记录转基因株系的开花情况。从播种后开始计算抽薹、开花所需天数，以及开花数，结果见表8和图8、图9。表8与野生型拟南芥植株相比，转基因拟南芥的系表现出早花表型。对转基因拟南芥及野生型拟南芥的抽薹天数、开花天数及开花数进行统计。结果显示，超表达leafy基因拟南芥株系的抽薹天数比野生型平均早3d，开花天数比野生型平均早2d，开花数比野生型平均多1.79个。这表明leafy基因的超表达对拟南芥的抽薹、花期、开花数均有影响。leafy基因的表达可以促进植物开花。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表<110>浙江省农业科学院<120>紫云英leafy基因及其应用<130>khp181113716.9<160>12<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1400<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atcttttacacttctcacttcatttccaaaacaatggaccccgatgctttcactgcaagc60ctattcaagtgggacccacgcaccgttctcccgcctgctccgcctcctcgtcctccactt120cttgaatacactatgtctccggcaacagctccggtgccatatcatcctgtcagagcgccg180agagagctaggagggcttgaggaactctttcaagcttacggtatcagatactacacggcc240gcaaagatagctgagctaggtttcacggtgagcacgctgattgacatgaaggacgaagag300ttggacgatatgatgaacagcctttcccagatttttcgctgggacctccttgtcggtgaa360cgttacggcatcaaagccgccatcagagctgagcggagacgcgtcgacgatgaggaaatc420aaacgtcgtagccttctgtccaacgataccaacgcaattgatgctctctctcaagaaggt480ttatcagaggagccagtgatgcaaagagataaggaggtagtgggaagcggaggaggaaac540acgtgggaagttgttgcggcggaggagaggaggaagcagaggaggaggaggtcgagaatg600aaggtgaatgttcatggtgatgagaacgaggaagcagaagatgaagaaggagaagataac660aacaacagcggtggtggtggtggtggtggagtttgtgaaaggcaaagagaacaccctttc720attgtaactgaacctggtgaagttgcacgtggtaagaaaaacggtcttgattatctgttt780catctatacgaacaatgccgtgaattcttgattcaagttcagaccatcgctaaggaccgc840ggtgaaaaatgccccaccaaggtgacaaatcaggtatttaggtatgcgaagaaagctgga900gctagttacataaacaagccaaaaatgagacactacgtgcattgctacgcactgcattgt960ctagacgaggaggtgtctaatgaactgagaagaggttttaaggagagaggggagaatgtt1020ggagcgtggaggcaagcatgttataagccacttgtggcaatagctggacgtcaaggttgg1080gatattgatgccattttcaatgcgcattctcgtctttcaatttggtatgtgcctaccaag1140ctccgtcagctttgtcacgctgagagaaacagtgctgctgcttctagttccgtttctgtt1200ggaagtgcccatcttcctttctaacttaaacaccatgtactcaagtaatacatcagatcg1260tctagaatttcgaattatttatgtatgagtagaaactccctctttcactaggtttcttaa1320tgagtttgcatgtaccaatggagggacttttttaagttatgaagaagaaatcactgtgtc1380attccaaaaaaaaaaaaaaa1400<210>2<211>396<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2metaspproaspalaphethralaserleuphelystrpaspproarg151015thrvalleuproproalaproproproargproproleuleuglutyr202530thrmetserproalathralaprovalprotyrhisprovalargala354045proarggluleuglyglyleuglugluleupheglnalatyrglyile505560argtyrtyrthralaalalysilealagluleuglyphethrvalser65707580thrleuileaspmetlysaspglugluleuaspaspmetmetasnser859095leuserglnilepheargtrpaspleuleuvalglygluargtyrgly100105110ilelysalaalaileargalagluargargargvalaspaspgluglu115120125ilelysargargserleuleuserasnaspthrasnalaileaspala130135140leuserglnglugl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