一种重组免疫毒素及其制备方法和应用与流程

文档序号：15714893发布日期：2018-10-19 21:56阅读：264来源：国知局

本发明涉及一种重组免疫毒素及其制备方法和应用。

背景技术：

免疫毒素是由具有导向能力的载体分子(如抗体、细胞因子等)和具有细胞毒作用的毒性分子(如植物毒素、细菌毒素等)连接而成的具有特异性细胞杀伤能力的杂合分子，它通过载体的导向作用，使其所携带的毒性分子到达靶细胞，继而在胞内抑制蛋白质合成导致细胞死亡，达到特异性杀伤靶细胞的作用而不损伤正常组织。免疫毒素可用于治疗恶性肿瘤、器官移植后的排斥反应或自身免疫性疾病和病毒感染等疾病，尤其在恶性肿瘤的治疗中具有广阔的应用前景。

免疫毒素的毒性分子是指蛋白质毒素，主要包括细菌毒素和植物毒素。细菌毒素主要有假单胞菌外毒素(pe)和白喉毒素(dt)，它们进入胞浆后通过催化使真核细胞延长因子2发生adp核糖基化失活，从而抑制细胞蛋白质合成。植物毒素即为核糖体失活蛋白(rip)，通常按结构不同分为两型：ⅰ型rip为单链蛋白，如天花粉蛋白、皂草毒素和白树毒素等；ⅱ型rip是通过二硫键连接a链和b链的双链蛋白，如蓖麻毒素和相思子毒素等。ⅰ型rip与ⅱ型rip的a链一样，是一类rnan-糖苷酶，能专一地水解真核细胞核糖体28srrna第4324位上的腺嘌呤，使核糖体失活，从而抑制蛋白质的生物合成。但天然完整的dt和pe具有细胞受体结合区，ⅱ型rip的b链具有凝集素的功能，均能结合正常细胞从而产生毒性，因此需经过基因工程技术改造去除细胞受体结合区或b链方可用于制备免疫毒素。而ⅰ型rip由于不具有b链，不易进入胞内，对正常细胞毒作用小，可直接用于制备免疫毒素。但ⅰ型rip的品种多，内化后杀伤细胞的活性相差也较大。这些毒素是否适合制备免疫毒素及所制备免疫毒素的活性高低，需经实验验证。

免疫毒素的载体分子主要是指抗体或抗体片段(fab段、单链抗体和纳米抗体等)，其识别的靶点应有如下特点：为特异性表达或过度表达的肿瘤细胞表面抗原；不易脱落；当其与免疫毒素结合后容易内化。当前较受关注的肿瘤靶点有白细胞分化抗原、表皮生长因子受体(egfr和her2)、间皮素(msln)、上皮细胞粘附分子(epcam)和b7-h3等。如何选择这些靶点以及获得满意的靶向部分用于制备免疫毒素也有待于深入研究。

免疫毒素可通过化学方法偶联的偶联免疫毒素或通过基因工程手段制备的重组免疫毒素。后者主要是将抗体功能区或配体(包含生长因子、细胞因子和亲和体等)的基因与毒蛋白基因融合后体内表达产生的，其载体分子多为小分子抗体(抗体fab段、单链抗体、单域抗体和纳米抗体等)，分子小，可增加对实体瘤的穿透性，有望在实体瘤的治疗中获得突破性进展。

南瓜蛋白(cucurmosin,cus)是从南瓜果肉中提取的新的i型核糖体失活蛋白，分子量28,203da，为碱性单肽链糖蛋白。近20年来，本课题组与中科院福建物质结构研究所陈明晃课题组合作，系统地研究南瓜蛋白的结构及抗肿瘤作用：测定了其氨基酸顺序和dna序列，培养出单晶并测定了二、三级结构；南瓜蛋白具有rnan-糖苷酶活性，能显著抑制多种肿瘤细胞增殖及诱导其凋亡，活性强于天花粉蛋白、八棱丝瓜蛋白、丝瓜蛋白、苋菜籽核糖体失活蛋白和巴豆毒素等多种同类蛋白，也是我们课题组发现的抗肿瘤活性最强的ⅰ型核糖体失活蛋白。因此，南瓜蛋白有望成为制备免疫毒素的理想弹头药物(毒性分子)。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种通过基因工程方法将南瓜蛋白或南瓜蛋白突变体基因与能结合靶细胞(包括肿瘤细胞和病毒细胞等)的抗体基因连接(融合)，表达出重组免疫毒素；并测试该免疫毒素的应用。

本发明的目的是这样实现的：

所述的免疫毒素包括毒性分子和载体，所述的毒性分子为南瓜蛋白或南瓜蛋白的突变体。

所述南瓜蛋白的氨基酸序列为基于seq.idno1所示的序列。

所述南瓜蛋白为基因工程表达的南瓜蛋白。

所述南瓜蛋白的突变体为点突变或缺失突变或插入突变所获得的突变体。

所述载体包含能结合肿瘤细胞的抗体或配体、能结合致病性免疫细胞的抗体或细胞因子以及能结合病原体或机体病变细胞的抗体；其中，抗体包含抗体片段或小分子抗体。

所述载体包含能结合肿瘤细胞表面抗原(如cd分子、egfr、her2、b7-h3、间皮素、上皮细胞粘附等分子)的抗体或配体；其中，抗体包含抗体片段或小分子抗体。

其中，所述的免疫毒素是南瓜蛋白或南瓜蛋白突变体基因通过基因工程方法与能结合靶细胞的抗体基因连接(融合)表达出重组免疫毒素；

并对重组免疫毒素在抗肿瘤活性、治疗器官移植后的排斥反应或自身免疫性疾病、治疗病原体引起的感染性疾病等可能的适应证中的抗肿瘤活性进行了测试。

重组免疫毒素的制备方法，通过基因工程手段，将南瓜蛋白或其突变体的基因与载体基因连接或者通过接头连接，并表达出的融合蛋白。

具体为南瓜蛋白基因与erfr纳米抗体7d12基因通过接头(linker)连接并经原核表达系统制备免疫毒素7d12-cus，及在此基础上构建靶向egfr的双特异免疫毒素7d12-9g8/cus，并测定这两种免疫毒素对egfr阳性的肿瘤细胞的杀伤作用；通过基因工程方法将南瓜蛋白基因经街头(linker)与her2单链抗体基因连接并通过原核表达系统制备免疫毒素her2-scfv-cus，用于测定其对her2阳性的肿瘤细胞的杀伤作用。

所述重组免疫毒素的应用，用于治疗肿瘤，治疗器官移植后的排斥反应或自身免疫性疾病以及用于病原体引起的感染性疾病。

本发明的优点如下：以南瓜蛋白或南瓜蛋白突变体为毒素分子制备的重组免疫毒素对靶细胞的特异性增强，杀伤靶细胞的活性显著提高，使用量可明显减少，毒性也就大大降低。总之，以南瓜蛋白或南瓜蛋白突变体为毒素分子的免疫毒素具有增效和减毒的优点。

附图说明

图1重组免疫毒素7d2-cus的构建/表达和纯化

a：三种重组表达载体目的基因pcr产物琼脂糖凝胶电泳；m：dnamarker，1:7d12，2：cus，3：7d12-cus；

b：三种纯化产物的sds-page；m:marker，1：cus，2:7d12，3：7d12-cus；

c和d：三种纯化产物的的westernblot检测，c图一抗为小鼠抗cus单抗，d图一抗为小鼠抗his单抗；1：cus，2：7d12，3：7d12-cus；

图2流式细胞术检测重组免疫毒素7d12-cus与肿瘤细胞的结合活性

粉红色为对照组，浅蓝色为实验组；从左到右分别为a549、hepg2、sw116和sw620细胞，第一排为7d12实验组，第二排为重组免疫毒素7d2-cus实验组。

图3重组免疫毒素7d12-cus体外对肿瘤细胞杀伤作用

hepg2、a549、sw116和sw620分别为7d12-cus(re/cus)、cus和7d12对相应肿瘤细胞系的杀伤作用图

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：

实施例1：重组免疫毒素7d12-cus的制备及其抗肿瘤活性测定

1.重组纳米抗体7d12表达载体pet32a-7d12的构建按照文献(laeremanst,etal.nanobodiesandpolypeptidesagainstegfrandicf-ir:u.s.patent2009/0252681a1[p].2009-10-8.)获得纳米抗体7d12的氨基酸序列(seq.idno2)，据此合成两端分别含有ndei/xhoi酶切位点的适合在大肠杆菌中表达的基因序列(seq.idno3)，经pcr扩增，用ndei和xhoi双酶切该基因及pet32a质粒后分别回收，并将两片段用t4dna连接酶连接，连接产物转化进入大肠杆菌bl21(de3)，在含氨苄西林的lb平板上挑选克隆制备质粒，通过ndei/xhoi双酶切及pcr筛选出阳性克隆，并经测序鉴定。结果表明，7d12基因被扩增(图1)并成功构建了表达载体pet32a-7d12，其编码表达的7d12的氨基酸序列为seq.idno4(pet32a载体编码c端6个组氨酸)。

⒉重组免疫毒素7d12-cus表达载体pet32a-7d12-cus的构建从本课题组前期构建的重组南瓜蛋白表达载体pet32a-cus中扩增cus基因(图1)，与7d12基因通过重叠延伸pcr法经linker序列拼接，两端分别含有ndei/xhoi酶切位点的基因序列(seq.idno5)，经pcr扩增，用ndei和xhoi双酶切该基因及pet32a质粒后分别回收，并将两片段用t4dna连接酶连接，连接产物转化进入大肠杆菌bl21(de3)，在含氨苄西林的lb平板上挑选克隆制备质粒，通过ndei/xhoi双酶切及pcr筛选出阳性克隆，并经测序鉴定。结果表明，重组免疫毒素7d12-cus基因拼接成功并构建了表达载体pet32a-7d12-cus(图1)，其编码表达的7d12-cus的氨基酸序列为seq.idno6(pet32a载体编码c端6个组氨酸)。

⒊重组免疫毒素7d12-cus、重组7d12及重组cus的表达及纯化按常规方法分别将上述三种表达载体(pet32a-7d12-cus、pet32a-7d12和pet32a-cus)转化到大肠杆菌bl21(de3)中，分别挑取阳性克隆，用lb培养基1l在37℃进行培养，至a600值为0.8时，加入iptg至终浓度为1mmol/l，于25℃震荡培养18h。离心收集菌体沉淀，pbs溶液洗涤2次后用平衡液(50mmtris,300mmnacl)20ml溶解沉淀，充分混匀并加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，超声破碎(冰浴，20min)2次，离心(10000rpm，20min)取上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤后缓慢加到ni-nta柱上，上样后用30ml平衡液洗涤柱子，用含15mm咪唑的平衡液30ml洗涤除杂蛋白，最后用含150mm咪唑的平衡液缓慢洗脱，用1.5ml的ep管分管收样(0.5-1ml/管)，将收集到的样品进行sds-page，把含目的蛋白的洗脱液收集到透析管中，透析除去咪唑后用0.22μm的微孔滤膜过滤分装保存，并通过bca法进行蛋白定量。并对所制备的重组免疫毒素进行westernblot及与肿瘤细胞结合活性的检测。结果表明，7d12-cus、7d12及cus三种重组蛋白均已表达及纯化成功，免疫毒素与egfr阳性的肿瘤细胞具有一定的结合活性(图1和图2)。三种转化菌每升细菌培养液分别可获得7d12-cus、7d12及cus约为5mg、7mg和10mg。

4.重组免疫毒素7d12-cus体外抗肿瘤活性测定分别取对数生长期的人肿瘤细胞系：肝癌细胞hepg2(egfr阳性)、肺癌细胞a549(egfr阳性)、结肠癌细胞sw1116(egfr阳性)和sw620(egfr阴性)，接种于96孔培养板上，每孔接种量分别为4000/100μl。培养24h后，实验组加不同浓度(2、0.2、0.02、0.002、0.0002、0.0000002μmol/l)的重组免疫毒素(7d12-cus)、南瓜蛋白(cus)、纳米抗体(7d12)100μl，每个浓度做4个复孔；阴性对照组加营养液100μl，空白对照孔加营养液200μl，用于仪器调零。作用72h后，弃上清，每孔加预冷的10％的三氯乙酸100μl，4℃固定1h；倒掉固定液，小孔用去离子水洗3遍，甩干，空气干燥；每孔加srb液(sulforhodamineb，用1％醋酸配成0.4％溶液)50ul，在室温放置30分钟，用1％醋酸液洗4遍，空气干燥；用100μl10mmol/l非缓冲tris碱液(ph10.5)溶解，用酶标仪在570nm波长处测定每个小孔的吸光度值(a570)，各组取平均值，计算抑制率：抑制率＝(1－实验组a570/对照组a570)×100％。用spss12.0进行统计学分析，并计算ic50。实验重复一次。结果见图3，相同的浓度梯度下，7d12-cus对egfr强阳性的肿瘤细胞系(hepg2、a549和sw116)杀伤作用明显强于cus，而对egfr阴性的肿瘤细胞系(sw620)的杀伤作用与cus相近(稍弱)；而7d12在所用各浓度下对上述四种肿瘤细胞系基本无作用。7d12-cus和cus对肿瘤细胞作用72h的半数抑制浓度(ic50)见表1，cus对egfr阳性的肿瘤细胞系hepg2、a549和sw116的ic50分别为7d12-cus的217倍、39倍和89倍，表明7d12-cus对egfr阳性肿瘤细胞杀伤活性明显强于cus。

表1重组免疫毒素7d12-cus对肿瘤细胞的ic50(srb法，72h)

*:与cus相比,p<0.05。

实施例2：重组免疫毒素7d12-9g8/cus的制备及其抗肿瘤活性测定

通过基因工程方法将南瓜蛋白基因经街头(linker)与靶向egfr的双特异纳米抗体7d12-9g8基因连接并通过原核表达系统制备免疫毒素重组免疫毒素7d12-9g8/cus，用于测定其对egfr阳性的肿瘤细胞的杀伤作用。

1.重组双特异纳米抗体7d12-9g8表达载体的构建按照文献(laeremanst,etal.nanobodiesandpolypeptidesagainstegfrandicf-ir:u.s.patent2009/0252681a1[p].2009-10-8.)获得纳米抗体9g8的氨基酸序列(seq.idno7)，据此合成适合在大肠杆菌中表达的基因序列，与7d12基因通过重叠延伸pcr法经linker序列拼接，两端分别含有ndei/xhoi酶切位点的基因序列(seq.idno8)，经pcr扩增，用ndei和xhoi双酶切该基因及pet32a质粒后分别回收，并将两片段用t4dna连接酶连接，构建表达载体pet32a-7d12-9g8，其编码表达的7d12-9g8的氨基酸序列为seq.idno9(pet32a载体编码c端6个组氨酸)。

⒉重组免疫毒素7d12-9g8/cus表达载体的构建从本课题组前期构建的重组南瓜蛋白表达载体pet32a-cus中扩增cus基因，与7d12-9g8基因通过重叠延伸pcr法经linker序列拼接，两端分别含有ndei/xhoi酶切位点的基因序列(seq.idno10)，经pcr扩增，用ndei和xhoi双酶切该基因及pet32a质粒后分别回收，并将两片段用t4dna连接酶连接，连接产物转化进入大肠杆菌bl21(de3)，在含氨苄西林的lb平板上挑选克隆制备质粒，通过ndei/xhoi双酶切及pcr筛选出阳性克隆，并经测序鉴定。结果表明，重组免疫毒素7d12-cus基因拼接成功并构建了表达载体pet32a-7d12-9g8/cus，其编码表达的7d12-9g8/cus的氨基酸序列为seq.idno11(pet32a载体编码c端6个组氨酸)。

⒊重组免疫毒素7d12-9g8/cus及重组双特异纳米抗体7d12-9g8的表达及纯化按常规方法分别将上述两种表达载体(pet32a-7d12-9g8/cus和pet32a-7d12-9g8)转化到大肠杆菌bl21(de3)中，分别挑取阳性克隆，用lb培养基1l在37℃进行培养，至a600值为0.8时，加入iptg至终浓度为1mmol/l，于25℃震荡培养18h。离心收集菌体沉淀，pbs溶液洗涤2次后用平衡液(50mmtris,300mmnacl)20ml溶解沉淀，充分混匀并加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，超声破碎(冰浴，20min)2次，离心(10000rpm，20min)取上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤后缓慢加到ni-nta柱上，上样后用30ml平衡液洗涤柱子，用含15mm咪唑的平衡液30ml洗涤除杂蛋白，最后用含150mm咪唑的平衡液缓慢洗脱，用1.5ml的ep管分管收样(0.5-1ml/管)，将收集到的样品进行sds-page，把含目的蛋白的洗脱液收集到透析管中，透析除去咪唑后用0.22μm的微孔滤膜过滤分装保存，并通过bca法进行蛋白定量。并对所制备的重组免疫毒素进行westernblot及与肿瘤细胞结合活性的检测。结果表明，7d12-9g8/cus和7d12-9g8两种重组蛋白均已表达及纯化成功，两种转化菌每升细菌培养液分别可获得7d12-9g8/cus和7d12-9g8约为1mg和3mg。

4.重组免疫毒素7d12-9g8/cus体外抗肿瘤活性测定分别取对数生长期的人肿瘤细胞系：肝癌细胞hepg2(egfr阳性)、肺癌细胞a549(egfr阳性)、结肠癌细胞sw1116(egfr阳性)和sw620(egfr阴性)，接种于96孔培养板上，每孔接种量分别为为4000/100μl。培养24h后，实验组加不同浓度(2、0.2、0.02、0.002、0.0002、0.00002和0.000002μmol/l)的重组免疫毒素(7d12-9g8/cus)、南瓜蛋白(cus)、双特异纳米抗体(7d12-9g8)100μl，每个浓度做4个复孔；阴性对照组加营养液100μl，空白对照孔加营养液200μl，用于仪器调零。作用72h后，弃上清，每孔加预冷的10％的三氯乙酸100μl，4℃固定1h；倒掉固定液，小孔用去离子水洗3遍，甩干，空气干燥；每孔加srb液(sulforhodamineb，用1％醋酸配成0.4％溶液)50μl，在室温放置30分钟，用1％醋酸液洗4遍，空气干燥；用100ul10mmol/l非缓冲tris碱液(ph10.5)溶解，用酶标仪在570nm波长处测定每个小孔的吸光度值(a570)，各组取平均值，计算抑制率：抑制率＝(1－实验组a570/对照组a570)×100％。用spss12.0进行统计学分析，并计算ic50。实验重复一次。结果表明，相同的浓度梯度下，7d12-9g8/cus对egfr强阳性的肿瘤细胞系(hepg2、a549和sw1116)杀伤作用明显强于cus，而对egfr阴性的肿瘤细胞系(sw620)的杀伤作用与cus相近(稍弱)；而7d12-9g8在所用各浓度下对四中肿瘤细胞系基本无作用。7d12-9g8/cus和cus对肿瘤细胞作用72h的半数抑制浓度(ic50)见表2，cus对egfr阳性的肿瘤细胞系hepg2、a549和sw116的ic50分别为7d12-9g8/cus的90790倍、1390倍和257倍，表明双特异免疫毒素7d12-9g8/cus对egfr阳性肿瘤细胞杀伤活性明显强于cus，也强于免疫毒素7d12-cus。

表2重组免疫毒素7d12-9g8/cus对肿瘤细胞的ic50(srb法，72h)

*:与cus相比,p<0.05

实施例3：重组免疫毒素her2-scfv-cus的制备及其抗肿瘤活性测定

通过基因工程方法将南瓜蛋白基因经街头(linker)与靶向her2的单链抗体基因连接并通过原核表达系统制备免疫毒素her2-scfv-cus，分别用于测定其对her2阳性的肿瘤细胞的杀伤作用。

1.重组单链抗体her2-scfv表达载体pet32a-her2-scfv的构建克隆有linker连接的赫赛汀单抗可变区vh和vl基因的单链抗体的质粒ptt21-her2scfv购自弘业新创抗体技术股份有限公司，设计分别含有ndei/xhoi酶切位点的引物通过pcr法扩增her2-scfv基因，用ndei和xhoi双酶切该基因及pet32a质粒后分别回收，并将两片段用t4dna连接酶连接，构建表达载体pet32a-her2-scfv，her2-scfv基因序列为seq.idno12，其编码氨基酸序列为seq.idno13(pet32a载体编码c端6个组氨酸)。

⒉重组免疫毒素her2-scfv/cus表达载体pet32a-her2-scfv/cus的构建从本课题组前期构建的重组南瓜蛋白表达载体pet32a-cus中扩增cus基因，与her2scfv基因通过重叠延伸pcr法经linker序列拼接，成为两端分别含有ndei/xhoi酶切位点的her2-scfv/cus基因序列(seq.idno14)，经pcr扩增，用ndei和xhoi双酶切该基因及pet32a质粒后分别回收，并将两片段用t4dna连接酶连接，连接产物转化进入大肠杆菌bl21(de3)，在含氨苄西林的lb平板上挑选克隆制备质粒，通过ndei/xhoi双酶切及pcr筛选出阳性克隆，并经测序鉴定。结果表明，重组免疫毒素7d12-cus基因拼接成功并构建了表达载体pet32a-her2-scfv/cus，其编码氨基酸序列为seq.idno15(pet32a载体编码c端6个组氨酸)。

⒊重组免疫毒素her2-scfv/cus及单链抗体her2-scfv的表达及纯化按常规方法分别将上述两种表达质粒载体(pet32a-her2-scfv/cus、pet32a-her2-scfv)转化到大肠杆菌bl21(de3)中，分别挑取阳性克隆，用lb培养基1l在37℃进行培养，至a600值为0.8时，加入iptg至终浓度为1mmol/l，于25℃震荡培养18h。离心收集菌体沉淀，pbs溶液洗涤2次后用平衡液(50mmtris,300mmnacl)20ml溶解沉淀，充分混匀并加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml，超声破碎(冰浴，20min)2次，离心(10000rpm，20min)取上清，用0.45μm的微孔滤膜过滤后缓慢加到ni-nta柱上，上样后用30ml平衡液洗涤柱子，用含15mm咪唑的平衡液30ml洗涤除杂蛋白，最后用含150mm咪唑的平衡液缓慢洗脱，用1.5ml的ep管分管收样(0.5-1ml/管)，将收集到的样品进行sds-page，把含目的蛋白的洗脱液收集到透析管中，透析除去咪唑后用0.22μm的微孔滤膜过滤分装保存，并通过bca法进行蛋白定量。结果表明，her2-scfv/cus及her2-scfv两种重组蛋白均已表达及纯化成功，两种转化菌每升细菌培养液分别可获得her2-scfv/cus及her2-scfv蛋白约为2mg和4mg。

⒋重组免疫毒素her2-scfv/cus体外抗肿瘤活性测定分别取对数生长期的人肿瘤细胞系：乳腺癌sk-ov-3(her2阳性)和乳腺癌mda-mb-231(her2阴性)，接种于96孔培养板上，每孔接种量分别为4000/100μl。培养24h后，实验组加不同浓度(2、0.2、0.02、0.002、0.0002、0.00002和0.000002μmol/l)的重组免疫毒素(her2-scfv/cus)、南瓜蛋白(cus)、单链抗体(her2-scfv)100μl，每个浓度做4个复孔；阴性对照组加营养液100μl，空白对照孔加营养液200μl，用于仪器调零。作用72h后，弃上清，每孔加预冷的10％的三氯乙酸100μl，4℃固定1h；倒掉固定液，小孔用去离子水洗3遍，甩干，空气干燥；每孔加srb液(sulforhodamineb，用1％醋酸配成0.4％溶液)50μl，在室温放置30分钟，用1％醋酸液洗4遍，空气干燥；用100ul10mmol/l非缓冲tris碱液(ph10.5)溶解，用酶标仪在570nm波长处测定每个小孔的吸光度值(a570)，各组取平均值，计算抑制率：抑制率＝(1－实验组a570/对照组a570)×100％。用spss12.0进行统计学分析，并计算ic50。实验重复一次。结果表明，相同的浓度梯度下，免疫毒素her2-scfv/cus对her2强阳性的乳腺癌细胞系(sk-ov-3)杀伤作用明显强于cus，而对her2阴性的乳腺癌细胞系(mda-mb-231)的杀伤作用却弱于与cus相近；而her2-scfv在所用各浓度下对上述两种乳腺癌细胞系基本无作用。her2-scfv/cus和cus对这两种乳腺癌细胞作用72h的半数抑制浓度(ic50)见表1，cus对her2阳性的sk-ov-3细胞的ic50分别为her2-scfv/cus的658.9倍，表明免疫毒素her2-scfv/cus对her2阳性乳腺癌细胞的杀伤活性明显强于cus。

表3重组免疫毒素her2-scfv/cus对肿瘤细胞的ic50(srb法，72h)

*:与cus相比,p<0.05。

尽管本发明采用具体实施例及其替代方式对本发明进行示意和说明，但应当理解，只要不背离本发明的精神范围内的各种变化和修改均可实施。因此，应当理解除了受随附的权利要求及其等同条件的限制外，本发明不受任何意义上的限制。

序列表

<110>福建医科大学

<120>一种免疫毒素及其制备方法和应用

<150>2017102242988

<151>2017-04-07

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>244

<212>prt

<213>葫芦科植物南瓜属中国南瓜种(cucurbitamoschata)

<400>1

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