本发明属于兽用检测试剂领域，涉及一种供兽医临床使用抗生素药敏检测试剂盒。
背景技术
抗菌药对细菌性传染病的控制起到了非常重要的作用，但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，很多致病性细菌产生了耐药性，使得抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。
体外抗菌药物敏感性试验简称药敏试验(ast)，是指在体外测定药物抑菌或杀菌能力的试验。体外药物敏感试验是兽医临床合理有效使用抗生素、了解致病菌耐药动态不可缺少的试验手段。目前普遍使用的方法是美国国家临床实验室标准委员会(nccls)颁布的纸片扩散法和琼脂稀释法，虽然nccls法易掌握，其试验过程及结果判断也被标准化，但是其操作步骤繁琐，临床使用时耗时较长。几十年来一直有人对体外药敏试验法进行探索、研究、改良，希望能找到更加简便、经济、实用的方法，比如纸片扩散法(k-b法)、琼脂稀释法、常量肉汤稀释法、微量肉汤稀释法、e测定法、分析仪器测定法和氯化三苯基四氮唑(ttc)法等。但是这些方法都有一些缺点，比如操作步骤比较繁琐，耗时较长和无法一次对大量的抗生素的进行药敏试验等。在实际生产实践中，家畜发病往往较急，传染较快，往往来不及分离细菌做鉴定，首要的是以最快的速度找到对致病菌敏感的药物进行治疗，否则可能药敏实验还没有做完，家畜已大面积感染或死亡。所以开发出一种操作简便、耗时短、无需特殊仪器设备和贴近临床的实际的高通量药敏试剂盒势在必行。本发明的整个试验过程为液相反应，更符合生理环境，贴近生产实际；同时用户可以根据结果选择性价比高的药物进行治疗和预防，以减少用户的经济损失。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种供兽医临床使用的抗生素药敏检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供一种动物体外药物敏感检测方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种供兽医临床使用抗生素药敏检测试剂盒，包括独立包装的增菌培养基，药敏检测板，反应液；所述的增菌培养基选自加入1％的无菌犊牛血清和1‰的无菌nad的无菌1640培养基；所述的药敏检测板为包被若干种抗生素的反应板，反应板每个孔包被一种抗生素，抗生素的包被浓度为抗生素临床正常给药后的1-2倍最大血药浓度；所述的反应液为0.2％的刃天青无菌溶液。
所述的增菌培养基优选加入1％的无菌犊牛血清和1‰的无菌nad的无菌1640培养基。
所述的药敏检测板上抗生素的包被浓度优选抗生素临床正常给药后的最大血药浓度或两倍最大血药浓度。
所述的药敏检测板上抗生素的包被浓度进一步优选抗生素临床肌注或口服给药后的最大血药浓度或两倍最大血药浓度。
所述的反应板为96孔板或48孔板，优选96孔酶标板。
所述的抗生素包括但不限于氨苄西林钠、头孢噻呋、硫酸头孢喹肟、氯唑西林钠、盐酸土霉素、甲砜霉素、盐酸沙拉沙星、甲磺酸达氟沙星、磺胺嘧啶、盐酸大观霉素、磺胺氯吡嗪钠、氟甲喹、硫酸新霉素、替米考星、延胡索酸泰妙菌素、盐酸二氟沙星、磺胺二甲嘧啶、氟苯尼考、头孢曲松钠、阿莫西林钠、恩诺沙星、环丙沙星、盐酸多西环素、硫酸安普霉素、粘菌素、阿米卡星、磺胺间甲氧嘧啶、盐酸林可霉素、青霉素g钾、链霉素、土霉素、庆大霉素、氧氟沙星、泰万菌素中的多种。抗生素的种类可根据实际情况进行删减或增加。
以药物正常使用剂量(无论是肌注还是口服)，药物在血液中的cmax为基准，分别以2倍cmax和1倍cmax包被在96孔elisa板上，然后冷冻干燥制得药敏检测板，示意如表1。
表1药敏板包被示意图表
临床常见的35种抗生素的包被浓度，见表2。
表2猪临床常见的34种抗生素的包被浓度
一种动物体外药物敏感检测方法，使用所述的供兽医临床使用抗生素药敏检测试剂盒进行药物敏感度的测定。
所述的动物体外药物敏感检测方法，优选包括临床采样后将样品接种增菌培养基，37℃培养2-6h，以无色的培养基稍微变浑浊时结束培养；取菌液100μl/孔加入药敏检测板，37℃培养16h，加入50μl/孔的反应液0.2％的刃天青无菌溶液，混匀，37℃培养1.5h后观察结果，蓝色表示敏感，红色表示不敏感，颜色越接近于蓝色，药物越敏感。
所述的动物体外药物敏感检测方法，样品选自病料、粪便或血液；对于病料样品，使用无菌棉拭子采集病料，加入增菌培养基中；对于粪便样品，采集后先静置30min，取上清液50-100μl加入增菌培养基中；对于血液样品，静置30min后，取血清50-100μl加入增菌培养基中。
本发明所述的供兽医临床使用抗生素药敏检测试剂盒在体外检测细菌对抗生素敏感度中的应用。
有益效果：
本发明选择加入1％的无菌犊牛血清和1‰的无菌nad的无菌1640培养基作为增菌培养基能够适应大多数细菌快速生长；较之lb和tsb培养基细菌速度更快，更易于观察增菌，减少了由于lb和tsb培养基的颜色对结果造成的影响。
另一方面，本发明以药物正常剂量使用后的最大血药浓度(cmax)包被elisa板，分为1倍cmax和2倍cmax(考虑到临床上使用抗生素往往会加倍使用)，贴近兽医临床实际。
利用本发明试剂盒和方法进行药敏试验，出结果的时间短，24h内可以获得结果(需要细菌分离的除外)；一次检测的药物较多，一块板子最多可以检测47种抗生素；试剂盒易于操作，不需要特殊仪器和设备；结果直观：蓝色表示敏感，红色表示不敏感，颜色越接近于蓝色，药物越敏感。
利用本发明还可以根据客户的需求进行特别的定制。
附图说明
图11640快速增菌培养基、lb和tsb培养基对放线杆菌增菌效果的影响
图2各种抗生素对副猪嗜血杆菌的敏感性研究
备注：各孔的药物名称和浓度,孔的编号纵向为a-h,横向为1-9(下同)
a1氨苄西林钠(14μg/ml)b1氨苄西林钠(7μg/ml)
c1头孢噻呋(24μg/ml)d1头孢噻呋(12μg/ml)
e1硫酸头孢喹肟(4μg/ml)f1硫酸头孢喹肟(2μg/ml)
g1氯唑西林钠(24μg/ml)h1氯唑西林钠(12μg/ml)
a2盐酸土霉素(14μg/ml)b2盐酸土霉素(7μg/ml)
c2甲砜霉素(8μg/ml)d2甲砜霉素(4μg/ml)
e2盐酸沙拉沙星(2μg/ml)f2盐酸沙拉沙星(1μg/ml)
g2甲磺酸达氟沙星(1μg/ml)h2甲磺酸达氟沙星(0.5μg/ml)
a3磺胺嘧啶(50μg/ml)b3磺胺嘧啶(25μg/ml)
c3盐酸大观霉素(200μg/ml)d3盐酸大观霉素(100μg/ml)
e3磺胺氯吡嗪钠(100μg/ml)f3磺胺氯吡嗪钠(50μg/ml)
g3氟甲喹(10μg/ml)h3氟甲喹(5μg/ml)
a4硫酸新霉素(16μg/ml)硫酸新霉素b4(8μg/ml)
c4替米考星(50μg/ml)d4替米考星(25μg/ml)
e4延胡索酸泰妙菌素(10μg/ml)f4延胡索酸泰妙菌素(5μg/ml)
g4盐酸二氟沙星(4μg/ml)h4盐酸二氟沙星(2μg/ml)
a5磺胺二甲嘧啶(100μg/ml)b5磺胺二甲嘧啶(50μg/ml)
c5氟苯尼考(10μg/ml)氟苯尼考d5(5μg/ml)
e5头孢曲松(50μg/ml)f5头孢曲松(25μg/ml)
g5阿莫西林钠(30μg/ml)h5阿莫西林钠(15μg/ml)
a6恩诺沙星(1μg/ml)b6恩诺沙星(0.5μg/ml)
c6环丙沙星(2μg/ml)d6环丙沙星(1μg/ml)
e6盐酸多西环素(4μg/ml)f6盐酸多西环素(2μg/ml)
g6硫酸安普霉素(70μg/ml)h6硫酸安普霉素(35μg/ml)
a7粘菌素(4μg/ml)b7粘菌素(2μg/ml)
c7阿米卡星(40μg/ml)d7阿米卡星(20μg/ml)
e7磺胺间甲氧嘧啶(30μg/ml)f7磺胺间甲氧嘧啶(15μg/ml)
g7盐酸林可霉素(10μg/ml)h7盐酸林可霉素(5μg/ml)
a8青霉素g钾(14μg/ml)b8青霉素g钾(7μg/ml)
c8链霉素(2μg/ml)d8链霉素(1μg/ml)
e8土霉素(2μg/ml)f8土霉素(1μg/ml)
g8庆大霉素(10μg/ml)h8庆大霉素(5μg/ml)
a9氧氟沙星(10μg/ml)b9氧氟沙星(5μg/ml)
c9泰万菌素(4μg/ml)d9泰万菌素(2μg/ml)
e9空白f9空白
图3各种抗生素对放线杆菌的敏感性研究
备注：各孔的药物名称和浓度
a1氨苄西林钠(14μg/ml)b1氨苄西林钠(7μg/ml)
c1头孢噻呋(24μg/ml)d1头孢噻呋(12μg/ml)
e1硫酸头孢喹肟(4μg/ml)f1硫酸头孢喹肟(2μg/ml)
g1氯唑西林钠(24μg/ml)h1氯唑西林钠(12μg/ml)
a2盐酸土霉素(14μg/ml)b2盐酸土霉素(7μg/ml)
c2甲砜霉素(8μg/ml)d2甲砜霉素(4μg/ml)
e2盐酸沙拉沙星(2μg/ml)f2盐酸沙拉沙星(1μg/ml)
g2甲磺酸达氟沙星(1μg/ml)h2甲磺酸达氟沙星(0.5μg/ml)
a3磺胺嘧啶(50μg/ml)b3磺胺嘧啶(25μg/ml)
c3盐酸大观霉素(200μg/ml)d3盐酸大观霉素(100μg/ml)
e3磺胺氯吡嗪钠(100μg/ml)f3磺胺氯吡嗪钠(50μg/ml)
g3氟甲喹(10μg/ml)h3氟甲喹(5μg/ml)
a4硫酸新霉素(16μg/ml)硫酸新霉素b4(8μg/ml)
c4替米考星(50μg/ml)d4替米考星(25μg/ml)
e4延胡索酸泰妙菌素(10μg/ml)f4延胡索酸泰妙菌素(5μg/ml)
g4盐酸二氟沙星(4μg/ml)h4盐酸二氟沙星(2μg/ml)
a5磺胺二甲嘧啶(100μg/ml)b5磺胺二甲嘧啶(50μg/ml)
c5氟苯尼考(10μg/ml)氟苯尼考d5(5μg/ml)
e5头孢曲松(50μg/ml)f5头孢曲松(25μg/ml)
g5阿莫西林钠(30μg/ml)h5阿莫西林钠(15μg/ml)
a6恩诺沙星(1μg/ml)b6恩诺沙星(0.5μg/ml)
c6环丙沙星(2μg/ml)d6环丙沙星(1μg/ml)
e6盐酸多西环素(4μg/ml)f6盐酸多西环素(2μg/ml)
g6硫酸安普霉素(70μg/ml)h6硫酸安普霉素(35μg/ml)
a7粘菌素(4μg/ml)b7粘菌素(2μg/ml)
c7阿米卡星(40μg/ml)d7阿米卡星(20μg/ml)
e7磺胺间甲氧嘧啶(30μg/ml)f7磺胺间甲氧嘧啶(15μg/ml)
g7盐酸林可霉素(10μg/ml)h7盐酸林可霉素(5μg/ml)
a8青霉素g钾(14μg/ml)b8青霉素g钾(7μg/ml)
c8链霉素(2μg/ml)d8链霉素(1μg/ml)
e8土霉素(2μg/ml)f8土霉素(1μg/ml)
g8庆大霉素(10μg/ml)h8庆大霉素(5μg/ml)
a9氧氟沙星(10μg/ml)b9氧氟沙星(5μg/ml)
c9泰万菌素(4μg/ml)d9泰万菌素(2μg/ml)
e9空白f9空白
图4各种抗生素对大肠杆菌的敏感性研究
备注：各孔的药物名称和浓度
a1氨苄西林钠(14μg/ml)b1氨苄西林钠(7μg/ml)
c1头孢噻呋(24μg/ml)d1头孢噻呋(12μg/ml)
e1硫酸头孢喹肟(4μg/ml)f1硫酸头孢喹肟(2μg/ml)
g1氯唑西林钠(24μg/ml)h1氯唑西林钠(12μg/ml)
a2盐酸土霉素(14μg/ml)b2盐酸土霉素(7μg/ml)
c2甲砜霉素(8μg/ml)d2甲砜霉素(4μg/ml)
e2盐酸沙拉沙星(2μg/ml)f2盐酸沙拉沙星(1μg/ml)
g2甲磺酸达氟沙星(1μg/ml)h2甲磺酸达氟沙星(0.5μg/ml)
a3磺胺嘧啶(50μg/ml)b3磺胺嘧啶(25μg/ml)
c3盐酸大观霉素(200μg/ml)d3盐酸大观霉素(100μg/ml)
e3磺胺氯吡嗪钠(100μg/ml)f3磺胺氯吡嗪钠(50μg/ml)
g3氟甲喹(10μg/ml)h3氟甲喹(5μg/ml)
a4硫酸新霉素(16μg/ml)硫酸新霉素b4(8μg/ml)
c4替米考星(50μg/ml)d4替米考星(25μg/ml)
e4延胡索酸泰妙菌素(10μg/ml)f4延胡索酸泰妙菌素(5μg/ml)
g4盐酸二氟沙星(4μg/ml)h4盐酸二氟沙星(2μg/ml)
a5磺胺二甲嘧啶(100μg/ml)b5磺胺二甲嘧啶(50μg/ml)
c5氟苯尼考(10μg/ml)氟苯尼考d5(5μg/ml)
e5头孢曲松(50μg/ml)f5头孢曲松(25μg/ml)
g5阿莫西林钠(30μg/ml)h5阿莫西林钠(15μg/ml)
a6恩诺沙星(1μg/ml)b6恩诺沙星(0.5μg/ml)
c6环丙沙星(2μg/ml)d6环丙沙星(1μg/ml)
e6盐酸多西环素(4μg/ml)f6盐酸多西环素(2μg/ml)
g6硫酸安普霉素(70μg/ml)h6硫酸安普霉素(35μg/ml)
a7粘菌素(4μg/ml)b7粘菌素(2μg/ml)
c7阿米卡星(40μg/ml)d7阿米卡星(20μg/ml)
e7磺胺间甲氧嘧啶(30μg/ml)f7磺胺间甲氧嘧啶(15μg/ml)
g7盐酸林可霉素(10μg/ml)h7盐酸林可霉素(5μg/ml)
a8青霉素g钾(14μg/ml)b8青霉素g钾(7μg/ml)
c8链霉素(2μg/ml)d8链霉素(1μg/ml)
e8土霉素(2μg/ml)f8土霉素(1μg/ml)
g8庆大霉素(10μg/ml)h8庆大霉素(5μg/ml)
a9氧氟沙星(10μg/ml)b9氧氟沙星(5μg/ml)
c9泰万菌素(4μg/ml)d9泰万菌素(2μg/ml)
e9空白f9空白
图5app培养3h后的有0.5号麦氏浊度比较
备注：1为0.5号麦氏浊度管；2为app；3为空白培养基
具体实施方式
实施例1
分别以灭菌后1640培养基、lb和tsb培养基为基础，加入1％的无菌犊牛血清和1‰的无菌nad。分别接种临床常见大肠杆菌，副猪嗜血杆菌(hps)和放线杆菌(app)等为研究对象，每隔1h测定其od600吸光度值，每只试管测3次，取平均值绘制其生长曲线，筛选出适应大多数细菌快速生长的培养基。如图1所示，副猪嗜血杆菌在以1640为基础的快速增菌培养基上增菌速度更快，更易于观察增菌，同时减少了由于lb和tsb培养基的颜色对结果造成的影响。猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌具有相同的趋势。对于大肠杆菌来说以1640为基础的快速增菌培养基跟lb培养基，两者之间没有差异。
实施例2
以猪肌注给药正常使用剂量后，药物在血液中的cmax为基准，分别以2倍cmax和1倍cmax包被在96孔elisa板上，然后冷冻干燥制得药敏检测板。
以大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌为对象，利用本发明试剂盒检测大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌的抗生素敏感性。大肠杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌和副猪嗜血杆菌分别在以1640为基础的快速增菌培养基上培养1h，3h和4小时，然后取100μl(2滴)加到药敏板上，37℃培养16h后，每孔加入0.2％的刃天青无菌溶液50μl(1滴)，37℃培养1.5h后读取结果。各种抗生素对hps，app和大肠杆菌的药敏结果如图2、图3和图4所示；其中蓝色为完全抑菌，红色为不抑菌。结果成立的条件为：阴性对照为红色。参照纸片扩散法，比较两种方法的得出结果的一致性。通过比较药敏纸片法和快速药敏板的敏感性结果，两者的相符率为100％。
实施例3
a、使用无菌棉拭子采集病料(为了缩短增菌的培养时间，尽量多采集)，加入增菌培养基中，37℃培养2-6h，以无色的培养基稍微变浑浊时(约0.5号麦氏浊度，图5)，进行下一步操作；对于粪便样品，采集后先静置30min，取上清液50-100μl(1-2滴)加入增菌培养基中；对于血液样品，静置30min后，取血清50-100μl(1-2滴)加入增菌培养基中。
b、在包被好的药敏板的每孔中加入培养好的菌液100μl(2滴)，37℃培养16h；
c、取出药敏板，每孔加入0.2％的刃天青无菌溶液50μl(1滴)，37℃培养1.5h后读取结果；
d、药敏结果判定：蓝色为完全抑菌，红色为不抑菌。结果成立的条件为：阴性对照为红色。
e、结果如图2-图4，表明24种药物对所选的大肠杆菌敏感，6种药物不敏感，4种药物在正常使用剂量下不敏感，在加倍剂量后敏感；15种药物对所选的app敏感，11种药物不敏感，8种药物在正常使用剂量下不敏感，在加倍剂量后敏感；15种药物对所选的hps敏感，11种药物不敏感，8种药物在正常使用剂量下不敏感，在加倍剂量后敏感。