本申请属于食品病菌检测领域，具体涉及一种食品中铜绿假单胞菌的快速检测和估数方法。
背景技术
铜绿假单胞菌原称绿脓杆菌，在自然界分布广泛，为土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在。本菌是一种常见的条件致病菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌。菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列；菌体的一端有单鞭毛，在暗视野显微镜或相差显微镜下观察可见细菌运动活泼。
铜绿假单胞菌感染在医院感染中相当普遍，频频有报道。作为临床检验的主要病原菌，是伤口感染常见的一种细菌。虽然对健康人群致病力较弱，但当人体的正常防御机制改变或损伤时，如烧烫伤病人、免疫功能较低的病人极易被感染。日常食品检测中，铜绿假单胞菌虽然不作为食品微生物检验的常规指标项目，但铜绿假单胞菌已被确认为食源性和水源性致病菌。
目前，我国常规检测方法大多要经过前增菌、选择性增菌、选择性培养、生化鉴定、血清学反应等过程。这些实验操作繁琐，需耗时5-6d，检出率低，给出入境检验检疫、食品卫生监督等带来困难，不但影响经济发展，而且不利于及时诊断和控制流行病的传染，不能满足食品中病原菌快速检测的现实需要。另外，传统培养基的选择效果不明显，可疑菌落不易识别，当有其他的菌群存在时会影响铜绿假单胞菌的检出，给检测技术人员带来极大的工作量与不确定性。
近年来，分子生物学的检测技术已被广泛应用，使铜绿假单胞菌的快速检测有了很大发展。但是这些技术需要的设备费用较大、技术要求高、操作复杂，在基层检测机构不易推广。而显色培养基因为将微生物的分离与鉴定合二为一，具有省时省力、操作简便、敏感性和特异性都较高的优点，特别是能与常规检测方法较好地接轨而越来越受到国内外的关注。显色培养基是根据酶的特征设计的对微生物进行快速检测的一种分离培养基，基本原理是：在分离培养基中加入检测某些菌种的特异性酶底物，该底物为人工合成，由产色基团和微生物可代谢物质组成，通常为无色，但在特异性酶作用下游离出发色基团并显示一定颜色，直接观察菌落颜色即可对菌种做出初步鉴定，具有快速、简便和经济的特点。而现有的针对铜绿假单胞菌的显色培养基，检测结果不够准确，现在急需一种检测结果准确、检测效率高的铜绿假单胞菌的显色培养基。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用显色培养基对食品中的铜绿假单胞菌快速检测和估数的方法，检测结果准确、检测效率高，同时还能对食品中的铜绿假单胞菌进行估数，初步确定食品中铜绿假单胞菌的数量级。
本发明采用的技术方案如下：
一种食品中铜绿假单胞菌的快速检测和估数方法，包括以下步骤：
(1)、配置牛肉膏蛋白胨培养基：取新鲜牛心350g，用刀剁成肉末后，加入700ml蒸馏水、2.5g牛肉膏、3.5g蛋白胨、1.5g氯化钠、5.5g琼脂，用10％盐酸调整ph到8.0；并于121℃灭菌30min，冷却至常温。
(2)、预增菌处理：称量待测样品10g至含牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm下振荡20min，于37℃培养20h。
(3)、第一次冷处理：将培养过的样品混合物倒入已灭菌的培养皿中，放入4℃冰箱，冷却3h后缓慢升至室温；
(4)、配置增菌剂、增菌：增菌剂配方为：按重量份计，2.5％酵母粉、2.5％氯化钠、0.6％亚碲酸钾、0.8％乙酰胆碱，其余为蒸馏水；增菌剂ph为9.2，使用前需121℃灭菌25min；
将经过第一次冷处理的样品混合物加入到生理盐水中，制成样品质量浓度为20％的样品匀液；按1∶200的质量比将增菌剂溶于蒸馏水中，得增菌液；将样品匀液与增菌液按1∶4.5的体积比混匀，37℃震荡培养8-9h，得样品增菌液；
(5)、热处理：将样品增菌液倒入已灭菌的培养皿中，液面高度为1cm，先30℃培养1h，然后35℃培养1.5h，40℃培养1.5h，45℃培养0.5h，50℃培养1h；
(6)、第二次冷处理：将热处理后的样品增菌液直接放入4℃冰箱，冷却3h后取出，缓慢升至室温备用。
(7)、配置显色培养基：显色培养基各组分的重量份为：胰蛋白胨8份，酵母提取物3份，硫代硫酸钠0.5份，环丝氨酸0.8份，5-溴-4-氯-3-吲哚-丁酸盐0.2份，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷0.08份，磷酸酯二钠盐0.06～0.1份，乙酰胆碱0.05份，乙酸乙酯0.025份，去离子水100-500份，最终ph为7.9。
(8)、建立铜绿假单胞菌显色时间表：取步骤(7)中的显色培养基，加入铜绿假单胞菌，配制成铜绿假单胞菌浓度梯度范围为104-108cfu/ml的显色反应液，密封后培养并进行显色反应，铜绿假单胞菌置于上述显色培养基中显示红色，根据不同浓度的铜绿假单胞菌显色反应液完全显色为红色的显示时间，建立显色时间表。
(9)、铜绿假单胞菌的培养显色：取步骤(6)中冷处理后备用的样品，置于步骤(7)的快速显色培养基中进行培养并进行显色反应；在显色反应过程中观察样品，其中样品颜色转变为红色的是阳性样品，样品颜色不变的是阴性样品；记录阳性样品完全变为红色的时间，根据步骤(8)的显色时间表，初步确定铜绿假单胞菌的数量级。
本发明的技术效果是：克服了现有技术的不足，提供了一种检测结果准确、检测效率高的铜绿假单胞菌检测方法。采用了专门的增菌剂，有效提高了增菌效果；通过对样品进行预增菌、冷处理、增菌、热处理、冷处理等操作，大大提高了样品中铜绿假单胞菌的被测出率；采用了专门的显色培养基，提高了铜绿假单胞菌显色效果，从而提高了检测结果的准确度；在检测铜绿假单胞菌的同时，还能对其进行估数，初步确定食品中铜绿假单胞菌的数量级。
具体实施方式
一种食品中铜绿假单胞菌的快速检测和估数方法，包括以下步骤：
(1)、配置牛肉膏蛋白胨培养基：取新鲜牛心350g，用刀剁成肉末后，加入700ml蒸馏水、2.5g牛肉膏、3.5g蛋白胨、1.5g氯化钠、5.5g琼脂，用10％盐酸调整ph到8.0；并于121℃灭菌30min，冷却至常温。
(2)、预增菌处理：称量待测样品10g至含牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶，并及时盖上盖子，150rpm下振荡20min，于37℃培养20h。
(3)、第一次冷处理：将培养过的样品混合物倒入已灭菌的培养皿中，放入4℃冰箱，冷却3h后缓慢升至室温；
(4)、配置增菌剂、增菌：增菌剂配方为：按重量份计，2.5％酵母粉、2.5％氯化钠、0.6％亚碲酸钾、0.8％乙酰胆碱，其余为蒸馏水；增菌剂ph为9.2，使用前需121℃灭菌25min；
将经过第一次冷处理的样品混合物加入到生理盐水中，制成样品质量浓度为20％的样品匀液；按1∶200的质量比将增菌剂溶于蒸馏水中，得增菌液；将样品匀液与增菌液按1∶4.5的体积比混匀，37℃震荡培养8-9h，得样品增菌液；
(5)、热处理：将样品增菌液倒入已灭菌的培养皿中，液面高度为1cm，先30℃培养1h，然后35℃培养1.5h，40℃培养1.5h，45℃培养0.5h，50℃培养1h；
(6)、第二次冷处理：将热处理后的样品增菌液直接放入4℃冰箱，冷却3h后取出，缓慢升至室温备用。
(7)、配置显色培养基：显色培养基各组分的重量份为：胰蛋白胨8份，酵母提取物3份，硫代硫酸钠0.5份，环丝氨酸0.8份，5-溴-4-氯-3-吲哚-丁酸盐0.2份，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-葡萄糖苷0.08份，磷酸酯二钠盐0.06～0.1份，乙酰胆碱0.05份，乙酸乙酯0.025份，去离子水100-500份，最终ph为7.9。
(8)、建立铜绿假单胞菌显色时间表：取步骤(7)中的显色培养基，加入铜绿假单胞菌，配制成铜绿假单胞菌浓度梯度范围为104-108cfu/ml的显色反应液，密封后培养并进行显色反应，铜绿假单胞菌置于上述显色培养基中显示红色，根据不同浓度的铜绿假单胞菌显色反应液完全显色为红色的显示时间，建立显色时间表。
(9)、铜绿假单胞菌的培养显色：取步骤(6)中冷处理后备用的样品，置于步骤(7)的快速显色培养基中进行培养并进行显色反应；在显色反应过程中观察样品，其中样品颜色转变为红色的是阳性样品，样品颜色不变的是阴性样品；记录阳性样品完全变为红色的时间，根据步骤(8)的显色时间表，初步确定铜绿假单胞菌的数量级。