本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种人源性细胞穿膜肽及其制备方法、应用。
背景技术：
由于细胞膜的屏障作用，多种具有治疗功效的蛋白质、多肽和寡聚核苷酸难以进入细胞发挥药效。因而如何把有生物活性的物质直接从细胞外导入细胞内，是一个很有意义的研究课题。近年来，一些具有细胞膜穿透能力的小分子多肽(其长度一般不超过30个氨基酸)相继被发现，可有效携带比其分子质量大100倍的外源性疏水大分子进入细胞，并对宿主细胞没有显著毒副作用。这些具有细胞穿透功能的多肽，被称为细胞穿膜肽(cellpenetratingpeptide，cpps)。
细胞穿膜肽(cellpenetratingpeptide，cpps)是一类能够穿膜的小分子多肽，如tat，transportan，hiv-1等，能作为一个载体高效运送多种不同大小和性质的生物活性物质(包括蛋白、多肽、核酸分子、脂质体、小分子有机化合物等)进入几乎所有的哺乳动物细胞，并对宿主细胞没有显著毒副作用。cpps的种类繁多，其分类依据有物理化学特性、来源、摄入机制、生物医学应用等，目前尚没有统一的定论。根据其物理化学特性，cpps可以分为三种类型：阳离子型、两亲型和疏水型，其中以阳离子型和两亲型cpps为主，约占85％，而疏水型cpps仅占15％。
阳离子穿膜肽是一类富含正电荷的穿膜肽，tat是第一条被发现的穿膜肽，属于典型的阳离子穿膜肽。在生物体内，蛋白质带正电荷的区域能够帮助蛋白质跨膜或者锚定在细胞表面，从而帮助蛋白质更好地与细胞表面的多糖或者受体结合。
技术实现要素：
针对上述现有技术中的缺陷，本发明提供了一种人源性细胞穿膜肽及其制备方法、应用，且所述细胞穿膜肽安全，穿膜效果显著。
本发明为解决上述技术问题所提供的技术方案如下：
一方面，提供了一种细胞穿膜肽，其所述细胞穿膜肽包括第一序列
rrrrrkqarrprrrrar，或包含第二序列rssrrrrrrrrrkqrkvkr。
另一方面，还提供了一种上述细胞穿膜肽的制备方法，其包括如下步骤：
s1、提供树脂，且将所述树脂在第一溶剂中浸泡至所述树脂溶胀；
s2、将缩合剂、精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、脯氨酸或缩合剂、精氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸溶于第二溶剂中，形成混合物；
s3、在所述混合物加入溶胀的树脂中形成反应体系，反应时间为1-4h；
s4、去除反应后所述反应体系中的溶液，对残留物洗涤1-5次，气体鼓动，抽干；
s5、在所述残留物中加入脱帽液，气体鼓动，抽干；
s6、去除经由步骤s5后的反应体系中的溶液，洗涤1-10次，气体鼓动，抽干，由此获得合成的多肽链；
s7、在所述多肽链中加入切割液，在4-30℃下搅拌1-4h，过滤得滤液，且洗涤所述滤液；
s8、对经洗涤过的滤液进行萃取，离心得到细胞穿膜肽粗品；
以及s9、对所述细胞穿膜肽粗品进行鉴定和纯化。
优选的，所述树脂包括fmoc-wang树脂。
优选的，在步骤s2中，所述缩合剂包括苯并三唑鎓盐型缩合剂；在步骤s1中，所述第一溶剂包括：二氯甲烷、二甲基甲酰胺、二氯甲烷及四氢呋喃中的一种或几种；在步骤s5中，所述脱帽液包括：二甲基甲酰胺溶液，以及溶解于二甲基甲酰胺溶液中的6％w/v的哌嗪和0.1mhobt；在步骤s7中，所述切割液包括：以重量百分数计，95％的tfa、2％的tis以及3％的h2o。
优选的，所述苯并三唑鎓盐型缩合剂包括o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸盐中的一种或几种。
优选的，每种氨基酸与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1)；所述缩合剂与所述树脂的投料摩尔量比例为(1:1)-(10:1)。
优选的，所述步骤s8中，所述萃取包括：在经洗涤过的滤液中加入无水乙醚，放置1-4h；且所述无水乙醚与滤液的体积比为(5:1)-(60:1)。
另一方面，还提供一种上述细胞穿膜肽的应用方法，所述细胞穿膜肽用于在c端或n端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。
优选的，携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括：所述细胞穿膜肽与质粒dna结合以用于介导质粒dna。
优选的，所述细胞穿膜肽与质粒dna结合以用于介导质粒dna的过程包括如下步骤：
s1、将质粒dna与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中；
s2、调整所述质粒dna与所述细胞穿膜肽两者间的n/p比为0-80；
s3、培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒dna和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；
以及s4、4-6h后去掉培养基，添加含有10-15％fcs的培养基，静置1-4h。
本发明技术方案所带来的效果：
本发明的人源性细胞穿膜肽穿膜效果显著，穿膜效率高；且免疫原性低，安全低毒；制备方法操作简单且便于进行质量管控。
附图说明
图1a为本发明的细胞穿膜肽spock2与质粒dna结合后最优n/p比的实验结果图。
图1b为本发明的细胞穿膜肽tspyl2与质粒dna结合后最优n/p比的实验结果图。
图2a为本发明的细胞穿膜肽spock2用于bhk21细胞转染结果示意图。
图2b为本发明的细胞穿膜肽tspyl2用于bhk21细胞转染结果示意图。
图3a为本发明的细胞穿膜肽spock2用于b16细胞转染结果示意图。
图3b为本发明的细胞穿膜肽tspyl2用于b16细胞转染结果示意图。
图4a为本发明的细胞穿膜肽spock2用于bhk21及b16转染得到的荧光值。
图4b为本发明的细胞穿膜肽tspyl2用于bhk21及b16转染得到的荧光值。
图5a为本发明的细胞穿膜肽spock2用于bhk21mtt结果示意图。
图5b为本发明的细胞穿膜肽tspyl2用于bhk21mtt结果示意图。
图6a为本发明的细胞穿膜肽spock2用于b16mtt结果示意图。
图6b为本发明的细胞穿膜肽tspyl2用于b16mtt结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一：
通过对人类蛋白质数据库进行检索，发明人发现人类的spock2蛋白(sparc/osteonectin，cwcv，andkazal-likedomainsproteoglycan2)的c端与细胞膜紧密结合，有多个多糖黏着位点，以及发现人类的类y染色体编码睾丸特异蛋白基因2(testis-specificproteinyencoded-like,tspyl2)编码一类具有参与核小体装配,维持细胞活力状态功能的蛋白具有此功能，该蛋白需要与dna结合发挥功能。
进一步分析发现，spock2蛋白c端的一段长17个氨基酸的短肽(rrrrrkqarrprrrrar)富含精氨酸，具有很强的正电荷，推测这段短肽可能是一个新型的人源性穿膜肽，具有自主穿膜功能，由此提供了本实施例中的人源性细胞穿膜肽(简称spock2)，其包括如下所述的第一序列：rrrrrkqarrprrrrar，其氨基酸序列如序列表所示；其中，所述r选自精氨酸残基，所述k选自赖氨酸残基，所述q选自谷氨酰胺残基，所述a选自丙氨酸残基，所述p选自脯氨酸残基。
同时，还发现tspyl2蛋白的一段长19个氨基酸的短肽(rssrrrrrrrrrkqrkvkr)富含精氨酸，具有很强的正电荷，推测这段短肽可能是一个新型的人源性穿膜肽，具有自主穿膜功能。由此提供了本实施例中的人源性细胞穿膜肽(简称tspyl2)，其包括如下所述的第二序列：rssrrrrrrrrrkqrkvkr，其氨基酸序列如序列表所示；其中，所述r选自精氨酸残基，所述s选自丝氨酸残基，所述k选自赖氨酸残基，所述q选自谷氨酰胺残基，所述v选自缬氨酸残基。
进一步的，上述细胞穿膜肽的制备方法包括如下步骤：
s1、称取树脂(如fmoc-wang树脂)，倒入反应器中，加入第一溶剂(包括二氯甲烷(dcm)、二甲基甲酰胺(dmf)及四氢呋喃(thf)中的一种或几种)浸泡，直至所述树脂在第一溶剂中浸泡至所述树脂溶胀，再向反应器中加入适量脱保护溶液，通氮气鼓动0.5-2小时(优选为1.5h)，抽干，再向反应器中加入适量dmf，通氮气鼓动，抽干；重复上述加脱保护液、通氮气鼓动、抽干以及加适量dmf、通氮气鼓动、抽干的操作1-10次(优选为5次)；
s2、称取氨基酸以及缩合剂，需要说明的是，若制备的是spock2，则称取的是精氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、脯氨酸，若制备的是tspyl2，则称取的是精氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸；
且每种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的1倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的3倍；优选的，所述缩合剂包括苯并三唑鎓盐型缩合剂，且所述苯并三唑鎓盐型缩合剂包括o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)、o-苯并三氮唑-n,n,n',n'-四甲基脲四氟硼酸盐(tbtu)中的一种或几种；再将氨基酸、缩合剂溶于盛装于反应器内的第二溶剂(包括dmf、dcm、thf中的一种或几种)中，形成混合物；
s3、在所述混合物加入溶胀的树脂中形成反应体系，反应时间为1-4h(优选为3h)，茚三酮法检测直至不显色时停止反应；
s4、抽干去除反应后所述反应体系中的溶液，加适量dmf对残留物洗涤1-5次(优选为3次)，通氮气鼓动，抽干；
s5、在所述残留物中加入脱帽液，通氮气鼓动1-3h(优选为2h)，抽干，直至茚三酮法检测呈阳性；优选的，所述脱帽液包括：dfm溶液，以及溶解于所述二甲基甲酰胺(dfm)溶液中的6％w/v的哌嗪和0.1mhobt；
s6、抽干去除经由步骤s5后的反应体系中的溶液，加适量dmf洗涤1-10次，通氮气鼓动，抽干，由此获得含arg-arg-arg-arg-arg-lys-gln-ala-arg-arg-pro-arg-arg-arg-arg-ala-arg(spock2)或arg-ser-ser-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-arg-lys-gln-arg-lys-val-lys-arg(tspyl2)的多肽链；
s7、将干燥后的树脂装入合适的离心管中，在所述多肽链中加入切割液，在4-30℃(优选为18℃)下恒温机械搅拌1-4h(优选为3h)，过滤得滤液，且用tfa洗涤所述滤液；所述切割液包括：以重量百分数计，95％的tfa、2％的tis以及3％的h2o；
s8、过滤所述滤液，将滤液全部收集到烧瓶中；对经洗涤过的滤液进行萃取，高速离心得到细胞穿膜肽粗品；所述萃取包括：在经洗涤过的滤液中加入无水乙醚，放置1-4h(优选为3h)；且所述无水乙醚与滤液的体积比为(5:1)-(60:1)(优选为30:1)；
以及s9、运用hplc/ms或超滤法或高效毛细管电泳法进行多肽的鉴定和纯化，最终得到所需多肽。
此外，本实施例还提供一种上述细胞穿膜肽的应用方法，具体的，所述细胞穿膜肽用于在c端或n端共价或非共价连接标记物或载物分子，并携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞。本实施例中，所述标记物选自荧光素、生物素以及亲和基团中的一种或几种；所述载物分子选自糖类、多肽、蛋白、药物分子前体、纳米粒子及纳米微球中的一种或几种。
其中，携带所述标记物或载物分子穿过细胞膜进入细胞的过程包括：所述细胞穿膜肽与质粒dna结合以用于介导质粒dna；本实施例中，所述质粒选自pegfp或pdsred。
具体的，所述细胞穿膜肽与质粒dna结合以用于介导质粒dna的过程包括如下步骤：
s1、将质粒dna与所述细胞穿膜肽各自混合于磷酸盐缓冲液中；
s2、调整所述质粒dna与所述细胞穿膜肽两者间的n/p(即nh+3/po-4)比为0-80；优选的，调整两者间n/p比分别为0、1、3、5、10、20、40、80；
将上述调整好n/p比的质粒dna与所述细胞穿膜肽混合液进行琼脂糖电泳实验，确定最优n/p比，结果如图1a所示，对于spock2而言，其n/p在10左右时，质粒dna与细胞穿膜肽结合较好，因此，上述两者间n/p比可进一步优选为10；如图1b所示，对于tspyl2而言，其n/p在5左右时，质粒dna与细胞穿膜肽结合较好，因此，上述两者间n/p比可进一步优选为5；
s3、培养过夜的细胞，用无血清的培养基洗涤，将含有所述质粒dna和细胞穿膜肽的磷酸盐缓冲液加入到培养基中；
以及s4、4-6h(优选为5h)后去掉培养基，添加含有10-15％fcs(即胎牛血清)的培养基，静置1-4h(优选为3h)。
实施例二：
本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤s2中，每种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的5倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。
实施例三：
本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤s2中，每种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的1倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。
实施例四：
本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤s2中，每种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的5倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的1倍。
实施例五：
本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤s2中，每种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的10倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的10倍。
实施例六：
本实施例与实施例一的不同之处仅在于，细胞穿膜肽的制备方法的步骤s2中，种氨基酸的摩尔量均为所述树脂摩尔量的7倍，所述缩合剂的摩尔量为所述树脂摩尔量的5倍。
如下分别示出了本发明的细胞穿膜肽spock2、tspyl2与质粒dna结合后的穿膜效果实验过程，其具体包括如下步骤：
(1)实验组为本发明的细胞穿膜肽，将本发明的细胞穿膜肽spock2和pegfp(或pdsred)按0、10、20、40、80的n/p比混合，或将细胞穿膜肽tspyl2和pegfp(或pdsred)按0、5、10、20、40、80的n/p比混合；
室温或者37℃孵育半个小时或一个小时；对照组为穿膜肽tat，对应的，其同样分别与pegfp(或pdsred)按0、10、20、40、80或0、5、10、20、40、80的n/p比混合，孵育时间以及温度条件与实验组相同；
(2)培养细胞(分别为bhk21和b16细胞系)过夜，用没有血清的培养基洗两次；实验组中，在细胞中加入质粒dna和细胞穿膜肽spock2/tspyl2，形成实验组混合物，再取所述实验组混合物500μl加入到培养基中；
(3)6小时后去掉原培养基，添加含有10％胎牛血清的新鲜培养基；
(4)1-4小时后显微镜观察；如图2a-2b所示，在bhk21细胞系中，本发明的细胞穿膜肽spock2/tspyl2与质粒dna在n/p比为10的条件下结合时，其已能将质粒dna带入胞内，在n/p比为10时，其穿膜效率即可超过tat的穿膜效率，且在n/p比为80时，其穿膜效率最高，远高于tat的穿膜效率；
类似的，如图3a-3b所示，在b16细胞系中，本发明的细胞穿膜肽spock2与质粒dna在n/p比为10、tspyl2与质粒dna在n/p比为5的条件下结合时，其均已能将质粒dna带入胞内；在n/p比为40时，细胞穿膜肽spock2的穿膜效率最高；在n/p比为20时，细胞穿膜肽tspyl2穿膜效率最高，且在上述两个n/p下，spock2/tspyl2的穿膜效率均远高于tat的穿膜效率。
(5)bhk21或b16细胞系细胞经上述处理4h后经酶标仪检测，得到荧光定量结果，如图4a-4b所示，在bhk21及b16细胞系中，本发明的细胞穿膜肽spock2/tspyl2在各个浓度值上，其荧光强度均强于tat的荧光强度，且均在20μm时，荧光强度最强。
如下示出了本发明的细胞穿膜肽spock2/tspyl2细胞毒性实验过程，其具体包括如下步骤：
(1)取对数生长期培养细胞bhk21和b16，以每孔1×104个细胞接种于96孔板，37℃下于5％二氧化碳培养箱中培养24小时，使细胞贴壁；
(2)达到对数生长期时换成无血清的培养液，继续培养1小时；
(3)配置不同浓度的细胞穿膜肽spock2/tspyl2，同时设置三个阴性对照孔及阳性对照孔(tat)，阳性对照孔(tat)按照说明书操作进行实验；37℃下于5％二氧化碳培养箱培养1-24h；
(4)孵育时间结束后，每孔均加入pbs洗涤；
(5)贴壁细胞每孔加入20μlmtt(0.5％)，继续孵育4-6h之后弃掉培养液，每孔加入150μldmso(二甲基亚砜)，震荡10min；
(6)比色：选择490nm或570nm波长，在酶标仪免疫检测仪上测定光吸收值，处理数据得到细胞存活率；结果如图5a-5b所示，对于bhk21细胞系，本发明细胞穿膜肽spock2/tspyl2在0-16μmol/l的浓度范围内，细胞存活率与阳性对照组无明显差别；
如图6a-6b所示，对于b16细胞系，本发明细胞穿膜肽spock2/tspyl2在0-16μmol/l的浓度范围内，细胞存活率与阳性对照组无明显差别；上述实验结果证明本发明涉及的细胞穿膜肽安全低毒，其毒性与tat无差别，且各浓度的毒性变化不大，无浓度依赖性。
综上所述，本发明的细胞穿膜肽spock2/tspyl2具有如下优点：分子量小，氨基酸残基个数少，穿膜效果显著，效率明显高于穿膜肽tat；免疫原性低，安全低毒，毒性与tat无差别；可由固相合成方法而得，所述合成方法既可以在实验室水平也可在工业水平进行，操作简单且便于质量管控。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。