本发明属于比色探针技术领域，具体涉及一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针及其制备和应用。
背景技术
葡萄糖是细胞代谢的主要碳源和能量来源，在细胞的自然生长过程中起着至关重要的作用，血液中的葡萄糖水平与糖尿病或低血糖等疾病密切相关。而在过去的几十年里，糖尿病已经成为最大的公共健康威胁之一。因此，监测血糖含量对于预防和治疗糖尿病或其他相关疾病具有重要意义。
目前，人们已经报道了许多葡萄糖检测方法，比如荧光传感方法、比色传感方法、化学发光传感方法和高效液相色谱法等。在这些分析方法中，比色法引起了人们的广泛关注，除了准确、易操作、低成本等特点，比色法还可以通过肉眼观察颜色变化来分析待测物，这样需要更少的劳力，甚至不需要检测设备。但是目前的比色探针大都是一次性消耗品，具有循环可重复利用能力的葡萄糖可逆比色探针还没有，不利于可持续发展。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针及其制备和应用，该可逆比色探针可以实现重复使用。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针，结构式如下所示：
基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针的制备方法，步骤如下：1）取原料孔雀石绿和亚硫酸氢盐；
2）将孔雀石绿和亚硫酸氢盐加入磷酸盐缓冲液（浓度10mmol/lpbs）中，混合后孔雀石绿浓度为20µm，亚硫酸氢盐的浓度为25µm，室温下反应3min，得到基于孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的可逆比色探针溶液。
所述孔雀石绿与亚硫酸氢根的物质的量比为1：（1-1.25）。
所述亚硫酸氢盐为亚硫酸氢钠、亚硫酸氢钾或亚硫酸氢铵。
可逆比色探针在检测样品中葡萄糖方面的应用。
具体应用时，先将待测样品与葡萄糖氧化酶混合孵育（孵育在37℃下进行30min）得到反应溶液，然后将反应溶液加入可逆比色探针溶液中，然后分别测试反应后的颜色和紫外可见光谱变化。
实验发现：随着待测样品中葡萄糖含量的增多，将反应溶液加入可逆比色探针溶液中后逐渐从无色变成蓝色，紫外可见光谱的变化为：618nm处的吸光度随着葡萄糖含量的增多而增大。
本发明以孔雀石绿与亚硫酸氢根发生1,4-加成反应得到的加成产物为比色探针，研究发现，葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下能够产生双氧水h2o2，而h2o2能够氧化孔雀石绿与亚硫酸氢根的加成反应产物使该产物重新变回蓝色的孔雀石绿，如果将待测样品与葡萄糖氧化酶混合孵育后的反应溶液加入探针溶液中探针溶液由无色变为蓝色，说明加成反应产物变回孔雀石绿，此时表明反应溶液中含有葡萄糖经葡萄糖氧化酶催化后的h2o2，进一步说明待测样品中含有葡萄糖，如此就可以根据h2o2引起的从无色到蓝色的颜色变化或者相对应的紫外可见吸收光谱变化来间接检测葡萄糖。本发明的比色探针在检测过葡萄糖之后，还可继续向探针溶液中加入充分的亚硫酸氢根，将探针反应后的产物孔雀石绿重新变回孔雀石绿与亚硫酸氢根的加成产物，从而实现探针的多次重复使用。
本发明具有以下有益效果：1）本发明所采用的原料孔雀石绿、亚硫酸氢盐廉价易得，成本不高；2）本发明的可逆比色探针在制备时方法简便，能够便捷地检测溶液和人血清中的葡萄糖，选择性好、灵敏度高、最低检测限为70nm；3）本发明中探针在检测过葡萄糖后，还可以通过加入亚硫酸氢根反应后继续再次检测葡萄糖，这个过程中只消耗了微量的、非常便宜的亚硫酸氢盐，大大降低了成本；4）本发明比色探针灵敏度高、选择性好、简单便捷，而且可以重复使用，有望在生物医学领域推广使用。
附图说明
图1是孔雀石绿的高分辨质谱图。
图2是孔雀石绿和亚硫酸氢根反应后的高分辨质谱图。
图3是孔雀石绿和亚硫酸氢根反应后，继续加入过氧化氢反应后的高分辨质谱图。
图4是探针溶液中加入不同浓度葡萄糖（0-1000µm）与葡萄糖氧化酶的反应溶液后的紫外可见光谱图和颜色变化照片（1.5ml最终混合溶液中含有葡萄糖的浓度为0-1000µm）。
图5是618nm处的相对吸光度（a/a0）与葡萄糖浓度的线性关系图，其中a和a0分别代表存在不同浓度葡萄糖和不存在葡萄糖时含有探针的pbs缓冲体系在618nm处的吸光度。
图6是血清中潜在干扰物与葡萄糖共存时含有探针的pbs缓冲体系的相对吸光度，插图从左到右分别对应横坐标从左到右的干扰物质与葡萄糖共存时的体系颜色照片。
图7是含有探针溶液的pbs缓冲体系及其加入其他糖类干扰物质（半乳糖、蔗糖、麦芽糖）和葡萄糖后的相对吸光度，插图从左到右分别对应不含糖和含半乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖时体系颜色照片（1.5ml最终混合溶液中半乳糖、蔗糖、麦芽糖的浓度均为1200µm，葡萄糖的浓度为120µm）。
图8是探针的可逆循环能力考察结果图，插图对应可逆循环实验样品的颜色变化图。
图9是实施例1孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的1hnmr图谱。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：
在1.5ml的离心管中加入300μl50mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs，ph6.8），继续加入150μl200μm的孔雀石绿和30μl1.25mm的亚硫酸氢钠形成混合液，用超纯水将总体积补充为1.5ml，混合液中含10mm磷酸盐缓冲溶液、20μm孔雀石绿和25μmnahso3，混合液反应3分钟即可得到含有
hrms（esi）：[m+h]+（孔雀石绿c23h25n2+）calcd329.2012,found329.2018;[m-h]+（孔雀石绿与亚硫酸氢根反应得到的探针c23h26n2+o3s）calcd409.1664,found409.1595；[m+h]+（探针被过氧化氢氧化重新得到的孔雀石绿c23h25n2+）calcd329.2012,found329.2017。
1、探针的可逆反应机理探讨
通过孔雀石绿加入hso3−以及接着添加h2o2后发生的高分辨质谱变化验证了探针的可逆反应机理。如图1所示，测得孔雀石绿的质谱数据为329.2018，对应孔雀石绿的分子量329.2012。孔雀石绿加入hso3−完全反应后，质谱图上出现负离子峰质谱数据409.1595（图2），这与预期加成反应形成的加成产物的分子量410.1664（409.1664）相吻合；加成产物加入h2o2并充分反应后测得质谱数据329.2017（图3），与孔雀石绿的分子量相一致，进一步说明加成产物被h2o2重新氧化成孔雀石绿。因此，通过上述实验结果和分析，结合紫外可见吸收光谱数据，能够确定孔雀石绿与hso3−和h2o2发生了还原氧化可逆反应，即hso3−与孔雀石绿的c=c双键发生亲核加成反应生成加成产物，并且加成产物能被h2o2氧化成原来的孔雀石绿。这些结果表明探针即孔雀石绿与hso3−的加成产物在与h2o2发生反应后，还能通过加入hso3−继续与h2o2反应。
2、探针溶液的颜色和紫外可见光谱随加入的葡萄糖浓度的变化
首先使40μlpbs缓冲溶液（50mm，ph6.8）、20μl葡萄糖氧化酶（10mg/ml）和140μl不同浓度（0、1.07、5.36、10.71、53.57、107.14、214.29、428.57、642.86、857.14、1071.43、1500μm）的葡萄糖混合均匀，然后将混合溶液于37°c孵育30分钟来产生不同浓度的h2o2，此时得到溶液a。
将不同浓度的溶液a加入实施例1得到溶液b中反应20分钟，再用超纯水将总体积补充为1.5ml并混合均匀后测定和记录其紫外可见吸收光谱和相应溶液的颜色变化图。结果如图4-5所示，图中1-12编号分别代表0、0.1、0.5、1、5、10、20、40、60、80、100、140μm浓度的葡萄糖，随着葡萄糖浓度的增加，溶液逐渐从无色变成蓝色；紫外可见光谱的变化为：618nm处的吸光度随着葡萄糖含量的增多而增大。对相对吸光度与葡萄糖的浓度进行线性拟合，发现探针溶液中的葡萄糖的浓度范围为0.1-140µm时，相对吸光度与浓度呈现很好的线性关系，检测限为70nm，具有很高的灵敏度，远低于空腹时的血糖含量（3.89-6.11mm），可以应用于生命样本中葡萄糖的检测。
3、不同干扰物质对探针的影响
首先使40μlpbs缓冲溶液（50mm，ph6.8）、20μl葡萄糖氧化酶（10mg/ml）和140μl1.29mm葡萄糖混合均匀，然后将混合溶液于37°c孵育30分钟得到溶液c。接着向实施例1制得的溶液b中加入溶液c和血清中潜在的各种干扰物（血清中潜在干扰物的浓度为1%人血清中含有对应干扰物质的浓度）反应20分钟，在将总体积补充为1.5ml并混合均匀后测定和记录其紫外可见吸收光谱和颜色变化。结果如图6所示，图6中a-u分别代表图中横坐标从左至右的样本，实验结果表明其他干扰物只引起了几乎可以忽略的影响。接着考察了本发明区分葡萄糖与其类似物的能力，图7中v-z分别代表图中横坐标中从左至右的样本，图7表明含量为葡萄糖浓度10倍的其他常见糖（半乳糖、蔗糖和麦芽糖）产生的信号响应远远低于葡萄糖，甚至几乎与背景信号一样低。综上所述，本发明方法对葡萄糖具有很高的特异性，其抗干扰能力很强。
4、探针的可逆循环能力考察
在10ml的离心管中加入300μl50mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs，ph6.8）和778μl超纯水，继续加入150μl200μm的孔雀石绿和72μl1.25mm的亚硫酸氢钠反应3分钟形成混合液d，并测量其紫外可见吸收光谱和记录其颜色变化图。接着使40μlpbs缓冲溶液（50mm，ph6.8）、20μl葡萄糖氧化酶（10mg/ml）和140μl2.14mm的葡萄糖混合均匀，然后将混合溶液于37°c孵育30分钟产生h2o2，此时得到溶液e。将溶液e加入溶液d中反应20分钟得到1.5ml溶液f，随后测定和记录其紫外可见吸收光谱和相应溶液的颜色变化图。再向溶液f中加入300μl50mm的磷酸盐缓冲溶液（pbs，ph6.8）、72μl1.25mm的亚硫酸氢钠和928μl超纯水反应3分钟形成混合液g，并测量其紫外可见吸收光谱和记录其颜色变化图。接着制备上述溶液e。将溶液e加入溶液g中反应20分钟得到3ml溶液h，随后测定和记录其紫外可见吸收光谱和相应溶液的颜色变化图。如此类推制备溶液i、j、k、l、m、n。记录它们吸收峰在618nm处的吸光度，另外用相机记录每次循环时的颜色变化照片。结果如图8所示，探针在被葡萄糖氧化产生的h2o2和hso3−重复氧化还原5次后，其紫外可见吸收只有微小的减弱，插图显示溶液颜色也只有微弱的褪色，这说明探针具有很好的可逆性，而且经过多次氧化还原后仍然保留对葡萄糖氧化产生的h2o2的反应活性和良好的光谱性质。因此，本发明中的探针能够被重复利用以检测h2o2和葡萄糖，这样大大降低了成本，有利于本发明方法的进一步推广，在生物和医学领域具有重要的应用价值。
5、探针在检测人血清中葡萄糖的应用能力考察
首先使40μlpbs缓冲溶液（50mm，ph6.8）、20μl葡萄糖氧化酶（10mg/ml）、15μl人血清样品和125μl葡萄糖（0、60、120、240μm）混合均匀，然后将混合溶液于37°c孵育30分钟得到溶液d。接着向实施例1制得的溶液b中加入溶液d反应20分钟，在用超纯水将总体积补充为1.5ml并混合均匀后测定和记录其紫外可见吸收光谱和颜色变化。加标回收实验结果如表1所示，回收实验的回收率在92.8%和108.9%之间，相对标准偏差低于5.36%，表明了该方法的稳定、准确和可靠。另外考虑到血清样品的稀释倍数，比色法检测得到的3个实际血清样品中葡萄糖的含量为4.523mm,4.998mm和4.384mm，与文献报道的血糖水平基本相符，这些结果充分证明了本发明的实际应用能力，为复杂生物样本中葡萄糖的检测提供了一种新选择。
表1使用比色法检测1%人血清中葡萄糖的分析结果
6、图9是孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的1hnmr图谱，1hnmr（400mhz,dmso-d6）δ7.34(t,j=4hz,2h),7.24(s,3h),7.15(d,j=8.8hz,4h),6.67(d,j=9.2hz,4h),4.26(s,12h)；验证了孔雀石绿与亚硫酸氢根加成产物的结构即为所示结构式。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其他修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。