本发明属于分子生物技术和分子标记辅助选择技术领域，特别涉及一种影响杜洛克种猪日增重性状的分子标记及其应用。
背景技术
随着猪肉消费量的提高，猪的生长性能越来越受到人们的关注。日增重作为衡量猪生长性能的重要指标，一直是种猪遗传改良研究中的重点。然而，日增重作为中等遗传力性状，传统的仅仅单纯的对表型进行选择的选育方法如人为的将日增重少的个体本身进行淘汰或者尽量不选择将其同胞和半同胞留种，实际收效甚微。目前，全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy,gwas)已经逐步在复杂性状的遗传改良方面显示出独特的优势。如提高奶牛产奶量等。相对于候选基因法和qtl定位，gwas可以更精准的定位和识别与性状高度关联的snp位点，且不易受环境影响、性别、年龄影响，因此能进行早期选择，进而能起到缩短世代间隔、提高选选种效率的目的。因此如能利用gwas技术改良种猪的日增重性状，将具备广阔的应用前景。
杜洛克猪作为优秀外来杂交配套系杜长大三元杂交猪的终端父本，由于其具有增重快，饲料报酬高，胴体品质好、眼肌面积大、瘦肉率高等优点而备受养殖生产者青睐。因此，对杜洛克猪的日增重性状进行改良，可以有效地缩短商品猪的育肥时间从而节约养殖成本。
此外，不少研究均表明，日增重与部分生长性状如瘦肉率、背膘厚之间有中等程度的表型相关和遗传相关，日增重的遗传规律改良对猪生长性能和生产效率的提高同样具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于提供一种影响猪日增重性状的分子标记，所述分子标记的核苷酸序列如seqidno：1所示，其中序列中的m是t或a，导致猪日增重性状的不同。
所述分子标记的snp位点对应于国际猪参考基因组10.2版本6号染色体上第79026669bp处的a>t突变。
本发明的另一目的在于提供一种用于检测上述影响猪日增重性状的分子标记的引物对，所述引物对的核酸序列如下所示：
seqidno：2引物p001-f：5’-ggacttgtgccatctaaa-3’；
seqidno：3引物p002-r：5’-tacctgcttctgagtaatgt-3’。
本发明的另一目的还在于提供一种用于检测上述分子标记的试剂盒，该试剂盒包括如上所述的seqidno：2和seqidno：3所示的引物对。
本发明的另一目的还在于提供上述的分子标记/引物对/试剂盒在鉴定影响猪日增重性状、或猪的日增重遗传育种中，或提高猪日增重中，或猪分子标记辅助育种中的应用。
本发明的另一目的在于提供上述的分子标记在筛选高日增重的猪品种的方法，具体为，检测猪6号染色体上seqidno：1所述的分子标记，所述分子标记的5’端第305位单核苷酸是a还是t，淘汰t保留a。
作为优选的实施方式，该方法采用上述的引物对或试剂盒进行检测。
本发明的再一目的在于提供一种猪的遗传改良的方法，所述方法包括：确定种猪核心群中的种猪的上述的影响猪日增重的分子标记的位点，并根据所述分子标记做出相应的选择：在所述种猪核心群中选择国际猪参考基因组10.2版本6号染色体上第79026669位点为aa基因型的种猪个体，淘汰在第79026669bp处为tt和ta基因型的种猪个体，以逐代提高该位点的等位基因a的频率，从而提高后代猪的日增重。
具体地，本发明的猪的遗传改良的方法是通过以下步骤得以实现：
(1)提取待测猪的基因组dna；
(2)采用上述的引物对，将所述待测猪的基因组dna进行pcr扩增，以便获得pcr扩增产物；
(3)对所述pcr扩增产物进行测序，以便获得测序结果；
(4)基于所述测序结果，确定所述待测猪的如上所述的snp分子标记的基因型，选育该位点的aa型，淘汰该位点的tt型和ta型个体，以逐代提高该位点的纯合基因型aa型的频率，从而提高日增重。
本发明中，所述的种猪包括杜洛克及其合成系。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1)本发明研究并确定影响日增重相关的分子标记，提供一种用于鉴定影响猪日增重性状分子标记的引物对，最终建立高效准确的分子标记辅助育种技术，将其应用于种猪日增重性状遗传改良中，从而提高后代猪的日增重，进而提高猪的生长性能，提高企业利润，增加核心竞争力。
2)本发明通过优选该分子标记的优势等位基因，通过该分子标记，本发明将tt、ta型个体全部选育成aa型个体，则每只猪平均日增重可以增加3.61％-8.01％。在提高繁殖性能方面具有显著的优势。
附图说明
图1为杜洛克猪在6号染色体上关于日增重性状的全基因组关联分析(gwas)曼哈顿图；其中：横坐标表示猪的染色体编号；纵坐标表示-logp值。
图2为不同基因型猪的日增重。
具体实施方式
下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明的上述发明目的具体是这样实现的：
实验猪群：本实验一共使用了2312头纯种美系杜洛克。
实施例1为具体解释得到本发明中日增重性能的发明过程。
通过osborne系统测定猪在体重达30kg时的日龄并记录为day1，记录猪体重达100kg时的日龄并记录为day2。日增重的计算公式为：70/(day2-day1)。上述实验在广东温氏食品集团股份有限公司的下属猪场进行，在测定阶段每栏圈养10-12头猪(每头猪占用面积2平方米)自由采食饮水，并按统一饲养标准，统一饲喂日粮。
实施例2为具体解释得到本发明中基因标记的发明过程。
(1)杜洛克猪耳样组织dna的提取方法参照标注苯酚-氯仿法提取全基因组dna。用nanodrop-nd1000分光光度计对纯种杜洛克群体的dna进行质量检测和浓度测定。a260/280比值在1.8-2.0，a260/230比值在1.7-1.9判定为合格。最后将合格的dna样品统一稀释成50纳克/微升。再将6μl已提取好的待测dna样品与2μlloadingbuffer混合，上样到1％的琼脂糖凝胶中，150v电压下电泳25min，在紫外分光光度仪和凝胶成像设备下观察并拍照，观察dna的完整性。
(2)猪全基因组50ksnp基因型检测:geneseekgenomicprofilerporcine50ksnp分型平台，采用illuminainfinium的使用说明和标准流程进行芯片杂交与结果扫描。最后通过genomestudio软件读取基因型数据。用plinkv1.07对获得的基因型数据进行质量控制，此等位基因频率(mimorallelfrequency，maf)<0.01％或偏离哈代温伯格平衡(hardy-weinbergequilibrium，hwe)p≤10-6的snp标记，排除检出率<90％，家系孟德尔错误率高于0.1的个体；质控剩余的42233个snp标记和2312个样本用于后续数据分析。
(3)全基因组关联(gwas)分析：使用r软件中的genabel软件包对杜洛克日增重进行gwas分析，模型为：y＝1u+xb+sc+za+α。其中，y为所测得的表型值及(平均日增重值)，u为总体平均值，b为性别和固定效应值，c为其余的微效应，c—n(0，бc2)，α为随机加性遗传效应向量，且α～n(0，бα2)(g为个体间的分子血缘相关矩阵，бα2为加性遗传方差)，e为残差，x、s和z是对固定效应和随机效益的关联矩阵，场年季(herd-year-season)效应包括在批次效应中。采用bonferroni法确定全基因组关联分析得显著性阈值，基因组水平的显著阈值为0.05除以有效snp位点数量，即0.05/42233＝1.1e-7；染色体水平显著阈值为1除以有效snp位点数量，即1/42233＝1.70e-5。gwas分析结果如图1所示。从图1可知，在杜洛克及其合成系中，在3号染色体中存在显著影响日增重性状的位点，最强关联的snp为g.305a>t(p＝3.61e-06)。
(4)不同基因型与日增重表型的关联性分析：根据表1可知，分子标记的snp位点g.305a>t与日增重性状极显著相关(p<0.001)，说明此分子标记显著影响猪的日增重性状，可以通过对猪的此snp位点的辅助选择，从而提高该群体日增重，进而加快育种进程。根据图2可知，aa型比tt和ta型的平均日增重高，说明纯合子tt对平均日增重是最不利的。通过表2进一步得知，纯合子aa与tt基因型显著差异,说明纯合子tt对日增重最不利。日增重是生长性状的重要指标，日增重高说明猪的生长性能好。因此，tt基因型的猪的生长性能是最差的，我们在进行育种的过程中需要淘汰tt和ta型的种猪，保留aa型的种猪，以逐代提高该位点的等位基因a的频率。
表1分子标记的snp位点g.305a>t与日增重的相关性
实施例3具体解释发明检测snp标记的发明过程。
(1)引物设计
通过ensembl网站(http://asia.ensembl.org/index.html)下载猪的6号染色体上seqidno.1的dna序列。并利用引物设计软件primerpremier6.0设计引物。设计的引物的dna序列如下所示：
seqidno：2引物p001-f：5’-ggacttgtgccatctaaa-3’；
seqidno：3引物p002-r：5’-tacctgcttctgagtaatgt-3’。
(2)pcr扩增的体系与条件设置
配置10μl体系，其中dna样品1μl，上游引物0.3μl，下游引物0.3μl，pcrmix5μl，ddh2o3.4μl，pcr条件为94℃预变性2min，94℃变性15s，54.3℃退火20s，72℃延伸30s，共35个循环，最后延伸为72℃10min。
(3)dna序列测序鉴定：序列测序在深圳华大基因科技有限公司进行，基因片段测正反两个反应。将所测得的序列与ncbi基因组序列对比，得出对应snp位点的突变。
测序结果如下所示：
seqidno：1
注：序列表中标注的m为突变位点，用标有下划线显示(括号中为突变碱基，为等位基因突变)，在该序列的首尾加粗显示为引物序列。
实施例4分子标记的snp位点g.305a>t效应分析。
本发明提供一个能显著增加杜洛克种猪及其合成系的日增重snp标记，使用该snp进行标记辅助选择，能够极大地增加杜洛克种猪及其合成系的日增重育种进程。本发明的影响猪日增重性状的分子标记的tt型个体全部选育成aa型个体，则每头猪平均日增重可以提高70g，一个规模化万头猪场则可以在70日内增加猪肉49t，由此可见优秀的日增重性能为养猪产业提供收益的潜力是巨大的。本snp标记个体中，tt型个体与aa型个体之间的日增重性能存在显著差异(p<0.01)，通过优选杜洛克及其合成系该snp的优势等位基因(a)，可最终实现提高商品猪的经济效益的目的。
述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>华南农业大学
广东温氏食品集团股份有限公司
<120>一种影响猪日增重性状的snp标记及其应用
<141>2018-05-30
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>438
<212>dna
<213>swine
<400>1
ggacttgtgccatctaaaaacattccctactttgttaaattatttactgttgttacactc60
atttaaaaacatacagctaaagcattgactttccttgagagccttgggaaaaaattaaat120
atacactcaaggctaaatataccacatccaaatttaattcagtgatcaaatgcttccaac180
taactattttttttatgttcaaaggaagaaaaaaatgatcctatacaataacagtctctg240
ttggcacataaaagttttaacaaggcaaagttaaggtctatttcaaaacagaaacatttt300
gcttmggaatgacaactgttctactgaaggcctcagcttcttcatgaccagaagacaaaa360
ctaaaacattcttttcttgatccaggactaggaacagttagtccctagcattgctaatac420
attactcagaagcaggta438
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>2
ggacttgtgccatctaaa18
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>artificialsequence
<400>3
tacctgcttctgagtaatgt20