专利名称：猪日增重tef－1基因及其在猪分子标记辅助选择中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及猪日增重TEF-1基因的克隆及其在猪分子标记辅助选择中的应用。
背景技术：
猪肉是我国城乡居民动物性蛋白的主要来源，我国猪肉产量和生猪饲养量居世界第一，养猪业的发展在我国具有极其重要的理论和实践意义。近年来，猪肉一直占肉类总产的65％左右。尤其随着我国经济体制的改革，农民商品意识逐步增强，养猪业正由传统家庭副业向专业化、规模化、集约化、工厂化方向迅速发展。因此，加快遗传育种学的发展用于支持养猪业有着极为重要的作用。
以前，猪的育种目标简单，主要是提高生长率和降低背膘厚，随着育种工作的进展，育种目标变得复杂，包括1，提高育肥猪的生长速度和饲料利用率，主选日增重。2，提高瘦肉率和肉质。3，提高繁殖率和育成率。
随着人们对肉品需要量的增加，畜牧业必须缩短家畜饲养期，也就是提高猪的生长速度，对日增重进行选育，更多的为人们提供肉食产品。生长性状属于数量性状，由多基因控制、并存在主基因(major gene)效应。分子生物学技术的发展，使人们可以在DNA水平寻找控制生长性状的主基因或与其紧密连锁的分子标记，在育种过程中用于标记辅助选择(marker assistedselection，MAS)，以便提高选择进展，更好地改善猪生长性状，满足人们的需要，同时获得较大的经济效益。
通过候选基因法，已经找到了一些影响猪的生长速度的基因。位于猪12号染色体上的生长激素基因(Growth Hormon，GH)编码一种由猪脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的单一肽链蛋白质类激素，经过证实GH具有促生长作用，因此称之为生长激素。GH是调控动物生长发育的核心，是一种具有广泛生理功能的生长调节素，对动物的组织细胞生长与物质代谢具有极其广泛的调节作用。猪生长激素可促进蛋白质合成和脂肪动用，显著提高猪的生长速度、饲料报酬和瘦肉率，具有明显的经济效益和社会效益(邢晋玮，2001；熊文中，1998)。
位于猪2号染色体上的胰岛素样生长因子(IGF2)是一类小分子单链多肽(相对分子质量7471，67个氨基酸残基)对胚胎的生长有重要作用，Owens P C等进一步研究表明IGF2是一类多功能细胞增殖调控因子(The relationship between endogenous insulin-like growth factors andgrowth of pigs.Anim Sci，1999，77(8)2098-2103).刘鑫等对其Nci I酶切位点进行检测，结果表明在杜洛克、长白、大白中，AA基因型比BB基因型生长速率快，生长性能指数高4.06％～8.31％。
此外，猪胰岛素样生长因子(IGF-1)，PIT1基因，肥胖基因(LEP)等均被认为与猪的生长速度有关。尽管猪日增重侯选基因的研究取得了一些重要进展，但仍然存在不足，表现在猪的重要经济性状通常是数量性状，涉及到的生理生化过程相当复杂，即使同一个数量性状，它也受多个基因的调控，尽管已揭述其1-2个受控基因，寻找具有重要生理功能基因的方法不够全面，检测基因的数量有限，效率不高，需要创新，仍有其它具有大效应的新基因有待发现，所以进一步寻找与猪重要经济性状相关新基因的工作迫在眉睫。
TEF-1是转录因子TEAD家族中的一员，具有TEA DNA结合结构域，TEF-1定位于猪2p14-2p17。S.S.Lee等研究了猪2号染色体上影响猪日增重的一个QTL，连锁分析表明TEF-1位于此QTL上。TEF-1在早期就有表达，在小鼠原肠形成前期6.5天就在胎盘外层表达，8.5天就在整个胚胎表达，从10.5天开始，就在发育中的心肌和骨骼肌前体细胞中表达(Patrick Jacquemin等，A Novel Family of Developmentally Regulated Mammalian Transcription Factors Containing theTEA/ATTS DNA Binding Domain，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.271，No.36，Issue of September 6，pp.21775-21785，1996)。TEF-1几乎出现在所有的组织，特别是肾脏，肌肉，肺和心脏，表达量较高。TEF-1基因的突变小鼠由于心脏形成缺陷导致胚胎11至12天死亡(Z Chen等Transcriptional enhancer factor 1 disruption by a retroviral gene trap leadsto heart defects and embryonic lethality in mice.Genes&Development.8，2293-2301)，表明TEF-1基因对肌肉的发育起着比较重要的作用。
TEF-1转录因子在肌肉特异基因的表达中起着比较重要的作用，TEF-1的TEA结构域能不但能与肌肉特异基因的M-CAT元件作用，还能与其他因子的MADS结构域作用调节其他的肌肉基因的表达。TEF1的TEA结构域的第二、三a螺旋在体内和体外都能与SRF转录因子C末端的MADS结构域结合，形成稳定的复合体，调节骨骼肌a-actin基因启动子，还能与MEF2MADS因子作用，控制依靠MEF2的肌肉特异基因的表达。TEF-1与bHLHZ Max蛋白相互作用，结合到a-MHC(Myosin heavy-chain)基因的EM(E-box-M-CAT)motif正调控基因的表达。a-TM(tropomyosin)基因的表达需要TEF1因子的参与。TEF-1激活-myosin heavy chain基因富含A/T元件的启动子，表明TEF-1蛋白除了具有结合MCAT元件的结合作用，很可能通过结合富含A/T元件和MEF2元件调节骨骼肌、心肌和平滑肌的基因网络。通过以上资料我们可以得出TEF-1基因是一个重要的肌肉生长发育相关基因。因此将该基因运用在分子辅助标记选择中具有重要的意义。但是到目前为止，国内外对猪TEF-1基因的研究还是空白。研究突变位点在群体中的多态性，并进行性状关联分析是研究基因功能的一个非常有力的手段。所以申请人对这个基因的部分的cDNA序列进行了多态研究和关联分析，以期能够发现它的功能。
发明内容
本发明的目的在于克隆猪日增重基因TEF-1，寻找TEF-1基因的突变位点以及作为猪日增重基因多态性的检测方法，为猪的标记辅助育种提供一种有用的分子标记。
本发明是这样实现的一种猪日增重基因TEF-1，它的部分cDNA序列如序列表SEQI D NO1所述，该基因存在选择性剪接，有两个剪接体，长的转录本含1654bp，包含1308bp的开放阅读框，短的转录本为1591bp，缺少一个63bp的外显子，包含1245bp的开放阅读框，两个转录本都包含246bp的5’非翻译区和100bp的3’非翻译区，其中所获TEF-1基因cDNA序列中5’非翻译区的第93个碱基位点突变。
所获得的TEF-1基因cDNA序列中有1个如序列表SEQ ID NO1所示的第93bp处有一个A93-G93的碱基突变，导致BshN I-RFLP多态性。
一种筛选适用于猪日增重的分子标记方法，按照以下步骤用人TEF-1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得相似性85％以上的表达序列标签(EST)；然后拼接猪EST-重叠群；根据EST-重叠群设计引物，引物用于PCR扩增，对获得的PCR产物纯化、克隆和测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO1所述的DNA序列。
本申请人应用上述PCR-RFLP方法对猪TEF-1基因5’非翻译区的第93个碱基突变进行了检测。
以下对本发明作进一步的描述1、TEF-1基因的部分cDNA序列的克隆(1)引物设计用人TEF-1基因cDNA(GenBank收录号NM_021961)为信息探针，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank猪EST数据库中做同源序列筛选，获得一系列相似性为85％以上的ESTs(片段长度大于100bp)，将这些ESTs的收录号在NCBI中用ENTREZ(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Web/Search/index.html)查询相应序列，然后用DNAStar中的SeqMan程序构建猪EST-重叠群。根据EST拼接序列设计引物，序列如下表1用于TEF-1基因cDNA克隆的引物序列设计
(2)PCR产物的纯化、克隆和测序PCR产物的纯化在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5mLEpendorff管中，然后用PCR产物纯化试剂盒(购自Promega公司)纯化PCR产物，按照试剂盒说明书操作，具体步骤是每100mg的凝胶中300μL的S1液，于65℃温育10min至凝胶完全融化，将S1/DNA混合物转入回收柱，9200g离心30s，使浆液通过Minicolumn挤出。将下面管子中的废液倒掉，再加入500μL的W1液至管中，9200g离心15s，倒掉管中的废液。再加入500μL的W1液，静置1min，9200g离心30s，取下Minicolumn装入1.5ml Ependorff管中，加入25μL的灭菌水或者TE液，静置1min之后，9200g离心1min，以洗脱DNA存于Ependorff管。
连接反应将纯化PCR产物与pGEM-T载体(购自Promega公司)连接，连接反应总体积是5μl，其中包括2.5μl 2×buffer，0.5μl的T载体，0.5μl的纯化PCR产物，0.5μl的T4连接酶，最后加入1μl灭菌水置4℃水浴过夜。
感受态细胞的制备从37℃培养了16-20h的新鲜平板上挑取一个DH5α单菌落接种于2ml LB中，于37℃振荡培养3h，转接1ml菌液于含有30ml LB的盐水瓶中，继续在37℃振荡培养约4h，待OD600达到0.3-0.4时将盐水瓶从摇床取出置冰浴冷却10-15min，然后将菌液转入离心管中于4℃ 4,000g离心10min以收集细胞，将离心管倒置以弃净培养液，用10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，冰浴30min，重复4℃ 4,000g离心10min一次，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬沉淀，置4℃保存备用。
转化无菌状态下取100-120μl感受态细胞于1.5ml Ependorff管中，将5μl的连接产物加入混匀，在冰上放置30min，42℃热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3-4min，加入400μl无抗生素的LB液体培养基，37℃振荡培养45min。取100μl涂布于已提前4h涂布了IPTG(Isopropylthio-β-D-galactoside，异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)和X-gal的琼脂平板上，37℃平放1h后倒置培养。
(3)DNA序列同源性检索鉴定通过美国国家生物技术信息中心(NCBI，National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov)网站的BLAST(Basic Local Alignment SearchTool)软件，将测序后获得的DNA序列与GenBank数据库中公布的已知生理功能基因进行序列同源性比较，以鉴定和获得该DNA序列的功能信息。
(4)物理定位(1)用于物理定位的引物序列是TEF-1MF5′CACACTCTCCATGATCCAAC3′TEF-1MR5′TCACGGTTCACCCTTCTG3′该引物扩增片段长度为234bp。
(2)用于物理定位的实验材料用猪×啮齿类体细胞杂种板(Pig×rodent somatic cell hybrid panel，SCHP)进行染色体区域定位，用美国Minnesota大学共同构建的猪辐射杂种板(INRA-Minnesota porcineradiation hybrid panel，IMpRH)进行染色体精确定位，上述两套体细胞杂种板均由由法国Martin Yerle博士(Laboratoire de Génétique Cellulaire，INRA，Castanet-Tolosan，France)惠赠。
其中SCHP包括27个体细胞杂种细胞系，1-19号是猪×仓鼠体细胞杂种细胞系，20-27号是猪×小鼠体细胞杂种细胞系，并以仓鼠、小鼠和猪基因组DNA作为阳性对照。经细胞遗传学鉴定该杂种板保留了猪的除Y染色体外的全部18条常染色体以及X染色体，其中含有127个非重叠的染色体区域，各细胞系中所包含的猪染色体及染色体片段信息可从万维网(http://www:toulouse:inra:fr/lgc/lgc:html/)获得。
IMpRH使用的辐射剂量是7,000-rad。IMpRH包括118个猪×仓鼠辐射杂种细胞系，以及仓鼠和猪基因组DNA阳性对照，用757个标记的鉴定结果表明IMpRH中的平均标记存留率为29∶3％，包含有128个连锁群，覆盖了18对常染色体及X染色体，用于估计标记间距离的kb/cR比值是～70kb/cR(1Ray＝100cR)，理论分辨率是145kb。
(3)PCR分型条件进行扩增的PCR反应总体积为10μl，其中模板DNA为20ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/L MgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.4μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(购自Promega公司)。PCR扩增程序是94℃ 3min，循环35次94℃ 30s，62℃ 30s，然后72℃ 30s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测。
3.PCR-RFLP诊断方法建立(1)引物序列TEF-1F1 5′GGCAGGAGCAGTGCTAACAG3′TEF-1SNPR5′GCGAGTCCGAGGCAAACTTC3′该引物扩增片段长度118bp。
(2)PCR扩增条件PCR反应总体积20μl，其中猪基因组DNA约100ng，含1×buffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP终浓度为150μmol/L，引物终浓度为0.2μmol/L，2U Taq DNA聚合酶(购自Promega公司)。PCR扩增程序是94℃ 4min，循环34次94℃ 30s，63℃ 30s，72℃ 20s，最后72℃延伸5min。PCR反应产物用3％琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。
(3)RFLP检测条件PCR产物酶切反应体积是5μl，其中10×buffer 0.5μl，PCR产物2μl，限制性内切酶BshNI为0.2μl(2U)，H2O为2.310μl，将样品混匀后离心，37℃水浴4h，用3％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，记录基因型，在紫外灯下拍照。
4.标记性状关联分析在利用申请人所在的动物分子生物学与育种实验室组建的“通城猪”(该品种属于一种公开饲养的中国地方猪品种)和其他血缘的猪群做性状关联分析，取大约200个DNA样品用于基因型检测。所分析的性状有部分生长性能和部分肉质性状。申请人为此建立了如下最小二乘模型yijk＝μ+GENOTYPEi+SEXj+COMBINATIONk+εijk，其中，yijk是性状观察值，μ为总体均数，GENOTYPEi为基因型效应，SEXj为性别效应，COMBINATIONk为组合的效应，εijk为随机误差，假定服从N(0，σ2)分布。
本发明的效果是1.猪TEF-1基因的克隆结果以成年长白猪(一种具有欧洲血缘外来引进猪品种，在中国大规模饲养)的肌肉组织提取总RNA，经过反转录合成的cDNA为模板，分别用表1所示的引物进行PCR扩增，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，其中一个片断有两条特异的条带。将PCR产物回收纯化后克隆测序，并用GeneTool1.0软件中的ASSEMBLY程序进行拼接，得到一条长度为1654bp和一条1591bp的两条cDNA整合序列(见序列表SEQ ID NO1所示)。序列分析表明该cDNA序列具有1308bp(nt 247-1554)和1245bp两个开放阅读框，分别编码435和414个氨基酸的两个蛋白质。将基因编码序列在GenBank中进行同源性检索，检索结果该序列与人TEF-1基因cDNA(GenBank收录号NM_021961)的同源性达94％，2.猪TEF-1基因的定位结果用TEF-1MF和TEF-1MR引物在SCHP中分型结果表明，19个猪×中国仓鼠体细胞杂种细胞系(1-19号)中，6号出现与猪基因组DNA阳性对照扩增一致的95bp的目的片段，而在8个猪×小鼠体细胞杂种细胞系(20-27号)中，21、23号杂种细胞系均扩增得到95bp的目的片段。将上述实际观测的PCR分型数据提交给HybWeb(http://www:toulouse:inra:fr/lgc/lgc:html/)进行统计分析以获得区域定位信息，数据分析结果是TEF-1基因定位于猪2号染色体上，进一步的区域定位结果为SSC2p14-2p17。
用TEF-1MF和TEF-1MR引物在IMpRH分型结果是1111000000 0100001000 00000011010010000000 1000000000 1000000101 1000000100 0010010011 0110001001 00000000000100001100 11000000(其中0和1分别表述扩增结果为阴性和阳性)。统计分析结果，TEF-1基因与猪2号染色体上的SW1857紧密连锁，LOD值为9.77，RH图距是0.42Ray，进一步证实该基因位于猪2号染色体上。
3.PCR-RFLP诊断方法建立根据测序结果和钓取的EST序列的拼接结果发现5′非翻译区存在一个碱基突变，存在BshN I(G*G(C/T)(G/A)CC)的酶切位点，用TEF-1F1和TEF-1SNPR扩增猪基因组DNA得到118bp特异扩增片段，酶切产生三种基因型，基因型BB型有93bp和25bp两条带，AA型只有118bp的一条带，杂合子AB型有118bp，93bp和25bp三条带。
4.标记性状关联分析对猪TEF-1基因5′非翻译区BshN I-RFLP多态性位点与部分胴体、肉质、生长性状进行关联分析，基因型检测结果表明在159个个体中GG基因型有58个，GC基因型有71个，CC基因型有30个，所得到相关的性状全程日增重。
由表2可知，C等位基因是猪全程日增重的有利标记，CC基因型标记可用于提高猪生长速度的选择标记(分子标记)。
表2 TEF-1基因多态性对全程日增重的影响
序列表SEQ ID NO1是本发明克隆的猪日增重TEF-1基因的cDNA序列；图1是本发明的猪日增重TEF-1基因制备的流程图；图2是本发明中猪TEF-1基因用于PCR-RFLP检测的部分DNA片段；图3是本发明中猪日增重TEF-1基因5′非翻译区的BshN I-RFLPs的三种基因型(GG GC CC)电泳结果。
具体实施例方式
实施例1PCR-BshN I-RELP多态性在各猪品种中的检测应用利用PCR-BshN I-RFLP检测了五个猪种二花脸(中国地方猪血缘)，通城猪(中国地方猪血缘)，长白(欧洲血缘外来猪)，大白(欧洲血缘外来猪)，杜洛克猪(欧洲血缘外来猪)，各猪种的基因频率如表3所示，发现几个猪种中都是等位基因G占优势。
表3本发明克隆的猪日增重TEF-1基因BshN I多态性基因型频率及基因频率
实施例2猪标记性状关联分析的应用举例对猪日增重TEF-1基因5’非翻译区BshN I-RFLP多态性位点与部分胴体、肉质性状进行了关联分析的应用，基因型检测结果表明在159个个体中GG基因型有58个，GC基因型有71个个体，CC基因型有30个，在与部分生产性状进行关联分析应用中，所分析的性状有部分生产性状和肉质性状，所分析的性状是全程日增重。结果如表4所示。
表4 本发明克隆的猪日增重TEF-1基因多态性对全程日增重的影响
注肩注*表述P＜0.05；肩注**表述P＜0.01。
序列表<110>华中农业大学<120>猪日增重TEF-1基因及其在猪分子标记辅助选择中的应用<130>
<141>2007-05-21<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1654<212>DNA<213>猪(Sus scrofa)<220>
<221>gene<222>(1)..(1654)<223>
<220>
<221>mutation<222>(93)..(93)<223>
<220>
<221>CDS<222>(247)..(1554)<223>
<400>1ggcaggagca gtgctaacag gggtggggtg gcccagcccg gggactggga gccggggagg 60gagccgggct ccgagctgaa agcgagggaa gcrgcgccga agtttgcctc ggactcgccg 120ggcgctgcgg cggctccctt cgccgaggtt tattttcttg aaaaggctcc aggcttcggc 180ttggaaaatc cggccgccaa aattgagccc agcagctgga gcggcagtga gagccctgcc 240gaaaat atg gaa agg atg agt gac tct gca gat aag ccc att gac aat 288Met Glu Arg Met Ser Asp Ser Ala Asp Lys Pro Ile Asp Asn1 5 10gat gca gaa ggg gtc tgg agc ccc gac att gag cag agc ttt cag gaa336Asp Ala Glu Gly Val Trp Ser Pro Asp Ile Glu Gln Ser Phe Gln Glu
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1.一种猪日增重TEF-1基因，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。
2.根据权利要求1所述的猪日增重TEF-1基因，其特征在于，序列表SEQ ID NO1的第93bp处有一个A93-G93的碱基突变，导致BshN I-RFLP多态性。
3.根据权利要求1所述的猪日增重TEF-1基因，其中克隆TEF-1基因所用的引物的DNA序列如下所示正向5′GGCAGGAGCAGTGCTAACAG 3′，反向5′GCGAGTCCGAGGCAAACTTC 3′。
4.权利要求1或2所述的猪日增重TEF-1基因在猪标记辅助选择中的应用。
5.权利要求3所述的引物在猪标记辅助选择中的应用。
6.一种筛选适用于猪日增重分子标记方法，按照以下步骤用人TEF-1基因cDNA为信息探针，作同源序列筛选，获得相似性85％以上的表达序列标签；然后拼接猪表达序列标签-重叠群；根据该表达序列标签-重叠群设计引物，利用权利要求3所示的引物进行PCR扩增，对获得的PCR产物纯化、克隆和测序，进行序列分析，获得如序列表SEQ ID NO1所述的cDNA序列。
全文摘要
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种猪日增重基因TEF－1的克隆及其应用。本发明克隆了一种猪日增重基因TEF－1，它的cDNA序列如序列表SEQ ID NO1所述。序列表SEQ ID NO1的第93bp处有一个A93－G93的碱基突变，导致BshN I－RFLP多态性。本发明还公开了猪日增重TEF－1基因的制备方法、引物设计以及在猪分子标记辅助选择中的应用。
文档编号C12Q1/68GK101092622SQ20071005221
公开日2007年12月26日 申请日期2007年5月21日 优先权日2007年5月21日
发明者刘榜, 邢双, 赵书红, 朱猛进, 李奎, 樊斌, 余梅, 李长春 申请人:华中农业大学