本发明涉及鱼类遗传育种的分子标记辅助技术，具体涉及一种利用荧光标记微卫星标记鉴定大鳞副泥鳅家系的方法。
背景技术
大鳞副泥鳅(paramisgurnusdabryanus)，俗称黄板鳅，是一种小型淡水经济鱼类，隶属于鲤形目(cypriniformes)、鳅科(cobitidae)、副泥鳅属(paramisgurnus)。分布于我国的黑龙江、辽河中下游、海河水系、长江、钱塘江和台湾等水系。因其具有较高的食用价值和药用价值，在国内外市场广受欢迎，是我国出口韩国和日本的重要水产品之一。
大鳞副泥鳅对环境适应性强，可进行池塘、稻田、网箱和工厂化养殖，是理想的养殖对象。目前，我国大鳞副泥鳅养殖的苗种多为野生捕捞或者野生亲本繁殖而来，由于栖息环境的不断恶化和捕捞强度的增大，大鳞副泥鳅的野生资源量在不断减少。大鳞副泥鳅种质资源状况评估及良种选育工作严重滞后，优质苗种的缺乏已严重制约了大鳞副泥鳅养殖业的发展。因此，尽快开展大鳞副泥鳅良种选育工作是促进泥鳅养殖业可持续健康发展的必要手段。
在水产动物育种中，近交会导致隐性有害等位基因的表达，从而引起育种群体繁殖和生长性能的衰退。因此，保持清晰的系谱信息对于制定繁殖计划至关重要，根据亲缘关系信息进行合理交配可将每一代的近交控制在最低水平。此外，家系混养可减少环境带来的误差，使得遗传参数的估计更加准确。在传统的水产动物选择育种中，为了保持家系信息，需要将不同的家系分养，所需水体大且不便管理，更重要的是，不同的环境因素会使育种相关性状的遗传参数估计产生偏差，不利于育种计划的制定。为了保持混养家系信息，畜牧上多以物理标记为手段，而在水产动物中采用烙印、体外标、编码金属标等物理标记尚存在困难，且物理标记对鱼类生长会产生不利影响，尤其是对幼体伤害较大。即使可以使用物理标记，也需要鱼体长到足够大时才能操作，标记之前的分养仍会带来环境误差微卫星分子标记的出现使得混养家系亲缘关系的鉴定成为可能，是目前水产动物系谱确认中应用最广泛、最可靠的方法，已应用于多种水产经济动物的亲缘关系认定和系谱追踪。目前，尚未见将微卫星标记应用于大鳞副泥鳅家系鉴定的报道。
技术实现要素：
本发明的目的是利用荧光标记的多态微卫星引物建立大鳞副泥鳅的亲子鉴定平台，用于大鳞副泥鳅家系的亲子鉴定和家系管理，为大鳞副泥鳅的选择育种提供准确的亲缘关系鉴定检测技术。
本发明专利包括以下四个步骤：
一种大鳞副泥鳅微卫星家系鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：
⑴选择体质健壮发育良好的大鳞副泥鳅作为亲本进行全同胞家系繁殖，剪取每个亲本的尾鳍组织放于离心管内，用无水乙醇固定，并记录家系编号，于-20℃保存备用；
⑵亲本和子代基因组dna的提取；
⑶多态性微卫星标记的筛选和引物合成：选取12对微卫星引物，按照片段大小分为四组，第一组pdab15、pda62、pda125，第二组pda81、pd226、pd684，第三组pda202、pd221、pda242，第四组pd86、pd451，pd825，在正向引物5’端分别用fam蓝色、rox红色、hex绿色3种不同的荧光基团进行修饰；
⑷采用荧光pcr反应对亲本及子代dna样品进行扩增，扩增产物按照步骤⑶中的微卫星引物的分组方法进行混合，作为上机检测的样品，样品在abi3730xl基因分析仪上进行分型，用gs-500liz作为内参，用genemapper3.5软件读取个体的基因型；
⑸采用cervus3.0软件对亲本和子代基因型进行分析，判定子代个体的父母本，
所述步骤⑶所述的12对微卫星引物的核苷酸序列如下所示：
pdab15f:gaatgtttcacggttcttgtr:cattagtgaggacacaatgt
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pd825f:aggtgatgtgagagtgttggacr:ggagaacgtggcagaggttt。
而且，所述亲本和子代基因组dna的提取方法如下：
每个亲本剪取鳍条组织约0.2g，子代取全鱼，放于2ml离心管中，用剪刀将组织剪碎，加入600μl的细胞裂解液和8μl20mg/ml的蛋白酶k，放入65℃水浴锅中水浴2～3h，每隔30min摇匀一次，直到组织充分裂解；
将离心管冷却至室温，加入200μl7.5mol/l的醋酸铵，充分摇匀，冰上冷却5min或4℃冷却10min，12000r/min，4℃离心10min，取上清液至新离心管。加入与上清液等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温下沉淀1～2min，12000r/min，4℃离心10min，弃去上清液；
加入70％的酒精1ml洗涤dna，12000r/min，4℃离心10min，弃去上清液，加入无水乙醇1ml，12000r/min，4℃离心10min，弃去无水乙醇，室温干燥约30min，加入50μl双蒸水溶解dna；
用nanodropnd-1000紫外分光光度计检测dna浓度和质量，将各dna样品稀释至100ng/μl，-20℃保存备用。
而且，所述细胞裂解液的成分为：tris-hcl100mmol/l，ph8.0；edta50mmol/l，ph8.0；sds1％；nacl125mmol/l。
大鳞副泥鳅微卫星家系鉴定方法在大鳞副泥鳅家系鉴定中的应用。
本发明的优点和积极效果是：
1、本发明选择的微卫星位点多是从转录组序列中筛选的est-ssr标记，等位基因数目较多，多态性高，出现无效等位基因的概率小，鉴定准确率高，可为大鳞副泥鳅选择育种提供有力的技术保障。
2、本发明首次公开了一种大鳞副泥鳅微卫星家系鉴定方法(即一种大鳞副泥鳅亲子鉴定方法)，它将极大地推动大鳞副泥鳅分子育种研究的开展，加快大鳞副泥鳅优良品种的选育进程。
3、本发明所用的微卫星标记还可用于大鳞副泥鳅不同群体的遗传多样性分析，为大鳞副泥鳅种质资源评价提供技术支持。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
本发明提供一种大鳞副泥鳅微卫星家系鉴定方法，方法包括大鳞副泥鳅全同胞家系的获得；亲本和子代基因组dna的提取；多态性微卫星标记的筛选和引物合成；亲本及子代dna样品的荧光pcr扩增；以及亲本和子代的基因型分析等步骤。本发明选择的微卫星位点等位基因数目多，多态性高，pcr产物稳定可靠。利用这些微卫星位点鉴定17个全同胞家系，子代共340个个体找到其真正父母本的概率分别为95.9％和97.9％，总体鉴定成功率高达95.6％，可满足大鳞副泥鳅遗传育种中亲本亲缘关系的鉴定和家系管理的要求，为大鳞副泥鳅的分子育种提供有力的技术支撑。
具体每一个步骤以实施例的方式进行说明，如下：
实施例1
1)大鳞副泥鳅全同胞家系的建立
从天津市大黄堡湿地、潮白新河和团泊水库3个野生大鳞副泥鳅群体选取雌雄个体各17尾，进行人工催产繁殖，雌雄配比1:1，建立17个全同胞家系。剪取每个家系亲本的鳍条组织放于无水乙醇内，并做好家系信息记录，于-20℃保存备用。将17个家系分别放于17个塑料水箱中分养，待鱼苗孵出15天后，从每个家系中随机选取20尾鱼，用无水乙醇固定，作为亲子鉴定的样本。
2)亲本和子代基因组dna的提取
每个亲本剪取鳍条组织约0.2g，子代取全鱼，放于2ml离心管中，用剪刀将组织剪碎，加入600μl的细胞裂解液(tris-hcl100mmol/l，ph8.0；edta50mmol/l，ph8.0；sds1％；nacl125mmol/l)和8μl20mg/ml的蛋白酶k，放入65℃水浴锅中水浴2～3h，每隔30min摇匀一次，直到组织充分裂解。将离心管冷却至室温，加入200μl7.5mol/l的醋酸铵，充分摇匀，冰上冷却5min或4℃冷却10min，12000r/min，4℃离心10min，取上清液至新离心管。加入与上清液等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温下沉淀1～2min，12000r/min，4℃离心10min，弃去上清液。加入70％的酒精1ml洗涤dna，12000r/min，4℃离心10min，弃去上清液，加入无水乙醇1ml，12000r/min，4℃离心10min，弃去无水乙醇，室温干燥约30min，加入50μl双蒸水溶解dna。用nanodropnd-1000紫外分光光度计检测dna浓度和质量，将各dna样品稀释至100ng/μl，-20℃保存备用。
3)多态性微卫星标记的筛选和pcr扩增
对已发表的大鳞副泥鳅微卫星引物和本实验室开发的微卫星引物进行筛选，最终选择12对扩增稳定，多态性高的引物作为家系鉴定的引物。在每对微卫星引物的正向引物5’端分别用fam、rox、hex三种不同的荧光基团进行修饰(见表1)，引物在上海生工生物工程股份有限公司合成。pcr扩增采用15μl体系：11.3μlddh2o，1.5μl10×pcr缓冲液，正、反引物各0.2μl(10μmol·l-1)，dntp0.15μl(10mmol·l-1)，0.15μltaqdna聚合酶(5u·μl-1)，1.5μldna模板。pcr反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，ta退火45s，72℃延伸1min，反应进行33个循环；最后72℃再延伸10min。
表1微卫星引物序列信息
其中：f正向引物r反向引物
4)微卫星位点基因分型及亲子鉴定分析
扩增产物在abi3730xl基因分析仪上进行分型，用gs-500liz作为内参，用genemapper3.5软件读取个体的基因型。采用软件cervus3.0计算亲本和子代在各微卫星座位等位基因频率、杂合度、期望杂合度、多态信息含量、平均排除概率、hardy-weinberg平衡及无效等位基因频率，并跟据lod值鉴定每个家系个体的父母本(表2)。
5)结果
在cervus3.0软件模拟分析中，用17对亲本模拟产生10000个子代，在80％和95％的置信区间范围内亲子鉴定成功率分别可达到97％和96％。在实际鉴定的17个家系340个个体中，有14例没有找到真正的母本，7例没有找到真正的父本，其中3例父母本均发生错配。从候选亲本中找到真正父母亲的概率分别95.9％和97.9％，总体鉴定成功率高达95.6％，能够满足遗传育种中系谱分析和家系管理的要求。
表212个微卫星位点的遗传多样性统计及排除概率
注：k为等位基因数目，ho为观察杂合度，he为期望杂合度，pic为多态含量，excl1为双亲未知时排除率，excl2为已知单亲时排除率，hw为哈迪温伯格平衡检验，nd表示未做检验，ns表示符合哈迪温伯格平衡，***表示极显著偏离哈迪温伯格平衡，f(null)表示无效等位基因频率。
序列表
<110>天津市水产研究所
<120>一种大鳞副泥鳅微卫星家系鉴定方法及其应用
<160>24
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