一种具有对孔雀石绿吸附作用的拉曼活性基底的制备方法与流程

本发明涉及检测材料技术领域，更具体地，涉及一种具有对孔雀石绿吸附作用的拉曼活性基底的制备方法，还涉及由该制备方法得到的拉曼活性基底和应用。

背景技术

近年来，由于孔雀石绿残留超标导致的水产品质量与安全问题频频爆发，一方面对消费者的身体健康造成了巨大的危害，另一方面严重影响了我国水产品在国际市场上的竞争力。目前，针对水产品中孔雀石绿检测方法繁多，主要包括高效液相色谱法(hplc)、色谱串联质谱法(lc-ms/ms)、电化学法、竞争性酶联免疫吸附法(elisa)、表面增强拉曼光谱法(sers)以及分光光度法。其中，最为普遍使用的方法，如hplc、lc-ms/ms，其检测敏感度特别依靠检测前的样本预处理步骤；然而，传统的样本预处理步骤，如固相萃取(spe)、液液萃取(lle)，通常都是繁琐、耗时的，并且需要使用大量的有毒化学试剂，对操作人员造成极大的危害。

表面增强拉曼光谱法在分析检测一些小分子物质时，具有快速、灵敏和无损的特点。尤其一些新颖、贵重的金属，如金、银、铜纳米颗粒被发现作为一种表面增强拉曼活性基底，这使得拉曼光谱法在对一些禁用药物分子检测时，可以达到一个极低的检测限。一些文献已经报道，一种“核-壳”模型的纳米基底被用于检测一种渔业用药(孔雀石绿)时，检测限已达到惊人的1×10^-11moll^-1，这种模型的基底在保持了金属纳米颗粒增强效果的同时，还极大提高了其稳定性。然而，大多数表面增强拉曼光谱基底不具有选择性，这就对拉曼光谱法的灵敏度产生了一定的影响。因此，为了减少其它杂质分子的干扰，提高检测灵敏度，在拉曼光谱法量化检测以前，一个复杂耗时样本准备步骤通常需要被执行。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种表面增强拉曼光谱活性基底的制备方法，即一种拉曼活性基底的制备方法。该制备方法包括如下步骤：

以孔雀石绿为模板，乙烯基单体和金属纳米颗粒为原料，在交联剂和引发剂存在下发生反应；

所述金属纳米颗粒由表面包裹惰性半导体薄膜的金属颗粒；所述金属颗粒为au颗粒或ag颗粒。

在本发明一个优选实施方式中，所述惰性半导体薄膜由二氧化硅、石墨烯或三氧化二铝制得。所述惰性半导体薄膜优选由二氧化硅制得，即为二氧化硅薄膜。其中，优选在金属颗粒表面包裹一层均匀的惰性半导体薄膜。

其中，所述惰性半导体薄膜的厚度为2nm～5nm，优选为2nm。

在本发明一个优选实施方式中，所述惰性半导体薄膜表面修饰有丙烯酸。由于在惰性半导体薄膜表面修饰了丙烯酸，可以引导聚合反应在金属纳米颗粒表面进行，可以在其表面生成一层均匀的分子印迹聚合物膜。当惰性半导体薄膜为二氧化硅薄膜时，包裹了二氧化硅薄膜的金属颗粒可以表示为ag@sio2颗粒，在其表面修饰丙烯酸，可以引导聚合反应在ag@sio2颗粒表面进行。

其中，所述丙烯酸与所述表面包裹惰性半导体薄膜的金属颗粒的质量比为(10^-4～10^-5):1，优选为2.1*10^-5:1。

在本发明一个优选实施方式中，所述金属颗粒为ag颗粒。

在本发明一个优选实施方式中，金属颗粒的粒径为60nm～70nm，优选为65nm。

在本发明一个优选实施方式中，所述金属纳米颗粒由表面包裹二氧化硅薄膜的银颗粒和修饰在所述二氧化硅薄膜表面的丙烯酸组成，即所述金属纳米颗粒可以为丙烯酸修饰的ag@sio2颗粒。

在本发明一个优选实施方式中，所述孔雀石绿与所述金属纳米颗粒的质量比为1:(1～3)，优选为1:(1～1.5)。

在本发明一个优选实施方式中，所述乙烯基单体为丙烯酰胺或甲基丙烯酸，优选为丙烯酰胺。

其中，所述交联剂优选为二甲基丙烯酸乙二醇酯。所述引发剂优选为偶氮二异丁腈。

在本发明一个优选实施方式中，所述孔雀石绿、乙烯基单体、交联剂的质量比为1:(5～10):(30～45)，优选为1:8:40。其中，乙烯基单体优选为丙烯酰胺。

在本发明一个优选实施方式中，该制备方法包括如下步骤：

以孔雀石绿为模板，丙烯酰胺和金属纳米颗粒为原料，在二甲基丙烯酸乙二醇酯和偶氮二异丁腈存在下发生反应得到所述表面增强拉曼光谱活性基底；所述金属纳米颗粒由表面包裹二氧化硅薄膜的银颗粒和修饰在所述二氧化硅薄膜表面的丙烯酸单体组成。

在本发明一个优选实施方式中，该制备方法具体包括如下步骤：

1)将孔雀石绿和乙烯基单体在溶剂中混合，在4～10℃下反应1～2h；

2)向步骤1)反应后的溶液中加入所述金属纳米颗粒、交联剂和引发剂，在50～60℃下反应28～30h，除去孔雀石绿后得所述表面增强拉曼光谱活性基底。

其中，上述步骤优选在氮气的保护下进行。

其中，溶剂优选为乙腈。在步骤2)中，当反应结束后，优选使用乙腈溶液除去孔雀石绿。可以将除去孔雀石绿后的产物在真空条件下干燥保存。

在本发明一个优选实施方式中，上述步骤具体可以为：

将孔雀石绿和丙烯酰胺溶解在乙腈中，混匀，在4℃下搅拌2小时，得到反应液a，将上述金属纳米颗粒和二甲基丙烯酸乙二醇脂(edgma)加入反应液a中，n2保护下搅拌得到前预聚物溶液；然后，在n2保护下，加入偶氮二异丁腈(aibn)，得到混合溶液b，60℃下反应28h，反应结束后，用乙腈溶液洗去模板分子；得到的产物在真空条件下干燥保存，得到具有特定吸附作用的表面增强拉曼光谱活性基底。

当金属纳米颗粒优选由表面包裹二氧化硅薄膜的银颗粒和修饰在所述二氧化硅薄膜表面的丙烯酸组成，即所述金属纳米颗粒可以为丙烯酸修饰的ag@sio2颗粒时，得到的表面增强拉曼光谱活性基底记为ag@sio2@mips。

在本发明一个优选实施方式中，上述金属纳米颗粒的制备方法包括如下步骤：

向含有所述表面包裹惰性半导体薄膜的金属颗粒的乙醇溶液中加入丙烯酸溶液，在无氧条件下，转速200～300rpm下反应2～3h，即得。

其中惰性半导体薄膜的厚度可以根据反应条件以及所加试剂的量进行调整。

在本发明一个优选实施方式中，当金属纳米颗粒优选由表面包裹二氧化硅薄膜的银颗粒和修饰在所述二氧化硅薄膜表面的丙烯酸单体组成时，制备方法优选为：100mg的表面包裹sio2的银纳米颗粒分散到20ml的乙醇溶液中，然后加入20μl的丙烯酸溶液中，混匀后将溶液密封，并在转速300rpm下反应2个小时，将得到的产物干燥洗涤即得所述丙烯酸修饰的ag@sio2颗粒。

其中，可以使用本领域中常见的方法来制备的到表面包裹惰性半导体薄膜的金属颗粒，具体可以优选使用如下步骤制备：

向金属颗粒的乙醇溶液中加入氨水和提供惰性半导体材料的前驱体，在25℃下反应10h，收集沉淀得所述表面包裹惰性半导体薄膜的金属颗粒。

当优选使用ag@sio2颗粒时，制备方法可以优选为：在30ml银纳米粒子无水乙醇中加入20ml的氨水(质量分数：6％)和5ml的teos，反应10小时后，收集沉淀物并用无水乙醇清洗，得到核(ag)-壳(sio2)结构的ag@sio2纳米颗粒。

在本发明一个优选实施方式中，上述银纳米粒子的制备方法优选为：将甲醛和氨水按顺序加入agno3溶液中，30℃条件下反应2分钟，收集沉淀物，并将沉淀物放入30ml的无水乙醇中，所得产物用无水乙醇清洗，最后在60℃下真空干燥。

使用本发明提供的制备方法得到的表面增强拉曼光谱活性基底对孔雀石绿具有特异性吸附能力。

本发明的第二个目的在于提供使用上述制备方法制备得到的表面增强拉曼光谱活性基底，即具有对孔雀石绿吸附作用的拉曼活性基底。

本发明的第三个目的在于提供上述制备方法或上述表面增强拉曼光谱活性基底在检测孔雀石绿中的应用。

使用本发明得到的表面增强拉曼光谱活性基底检测孔雀石绿时，具有选择性强、灵敏度高稳定性强和表面增强效果显著等优点。

本发明提供的制备方法得到的表面增强拉曼光谱活性基底(即拉曼活性基底)相比于传统的表面增强基质，这种具有特异性吸附能力的表面增强基底可以捕获目标分子，增强了基底的选择性，提高了灵敏度。这种具有特异性识别能力的基底在捕获目标分子后，由于其与目标分子有一定的吸附作用力，在经过简单的洗涤步骤之后，其它的干扰分子可以被洗脱，仅仅留下目标分子被选择性的吸附在基底表面，可以省去复杂、耗时的样本预处理步骤，如图2所示。

附图说明

图1为本发明实施例1中制备的ag@sio2@mips纳米颗粒的操作步骤简略说明图；

图2为本发明提供的制备方法制备的表面增强拉曼光谱活性基底的实际工作原理图；其中，图中特殊基质为本发明制备的ag@sio2@mips颗粒，捕获器为mips分子，对模板分子具有特异性吸附能力；

图3为本发明实施例1提供的表面增强拉曼光谱活性基底的制备方法的流程图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供了一种表面增强拉曼光谱活性基底，如图1和图3所示，其制备方法包括如下步骤，

步骤1、将质量分数为37％的甲醛和25％的氨水按顺序加入100mlagno3溶液中，在超声混匀、30℃条件下反应2分钟，离心后收集沉淀物，并将沉淀物放入30ml的无水乙醇中，得到直径65nm的ag纳米颗粒。

步骤2、在上述的ag纳米颗粒表面包裹一层均匀的sio2膜，得到形貌一致的ag@sio2纳米颗粒，然后用丙烯酸对其表面进行修饰。

具体方法为：在ag纳米颗粒表面包裹一层均匀的二氧化硅薄膜，具体方法为：在上述的30ml银纳米粒子无水乙醇中加入20ml的氨水(质量分数：6％)和5ml的teos，反应10小时后，离心沉淀，收集沉淀物并用无水乙醇清洗，得到核(ag)-壳(sio2)结构的ag@sio2纳米颗粒；然后用丙烯酸对所得ag@sio2颗粒进行修饰，具体为：100mg的sio2纳米颗粒分散到20ml的乙醇溶液中，然后加入20μl的丙烯酸溶液中，超声5分钟后，将溶液密封，并在转速300rpm下反应2个小时，将得到的产物洗涤后在60℃下真空干燥。然后用红外光谱表征被丙烯酸修饰的ag@sio2颗粒，可以观察到1728cm^-1处有一个红外振动峰，此峰归属于c＝o键，该振动峰的出现标明丙烯酸分子在ag@sio2颗粒表面修饰成功。

步骤3、制备具有对孔雀石绿分子特定吸附作用的表面增强拉曼光谱活性基底。

具体方法为：将孔雀石绿(0.025mmol)、和丙烯酰胺(0.2mmol)按溶解在60ml乙腈中，超声混匀，然后在4℃下保存2小时，对其进行搅拌发生自组装反应，得到反应液a。随后向溶液a中加入10mg被丙烯酸修饰的ag@sio2、1mmol二甲基丙烯酸乙二醇脂(egdma)和5mg偶氮二异丁腈(aibn)得到混合液b，所有步骤均在n2的保护下。混合液b在60℃条件下发生聚合反应；聚合反应结束后，用乙腈溶液洗去模板分子(孔雀石绿)；得到的产物在真空条件下60℃干燥保存，得到具有特定吸附作用的表面增强拉曼光谱基质，记为ag@sio2@mips。

对比例1

本对比例提供一种基底ag@sio2@nips，ag@sio2@nips的制备方法与实施例1相同，唯一不同的是在步骤3中不加入孔雀石绿。

实验例：

实施例1得到的ag@sio2@mips与对比例1得到的ag@sio2@nips的吸附对照试验。

具体方法为：分别称取10mgag@sio2@mips和ag@sio2@nips颗粒，然后置于100ml的烧杯中，然后分别向其加入不同浓度的孔雀石绿标准溶液，充分震荡，5小时后分离，用紫外分光光度法测定分离后溶液的吸光度，并得出相应的孔雀石绿浓度，再根据分离前标准溶液的孔雀石绿浓度，根据两者差值，计算出两种相应纳米颗粒对孔雀石绿分子的吸附量，以上每组实验分别进行三次。从测试结果可以看出ag@sio2@mips纳米颗粒对孔雀石绿的吸附能力可以达到80％以上，而ag@sio2@nips纳米颗粒对孔雀石绿的吸附能力仅仅只有20％左右。从而得出结论：ag@sio2@mips纳米颗粒对孔雀石绿分子具有明显的特异性识别能力。

最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。