本发明属于生物
技术领域：
，涉及罗非鱼湖病毒的检测技术，具体涉及恒温实时检测罗非鱼湖病毒的rpa试剂盒及其专用引物和探针，及在监测罗非鱼湖病毒的应用。
背景技术：
：2009年左右以色列的太巴列湖野生罗非鱼和人工饲养罗非鱼同时患上一种不明疾病，死亡率高达70％以上，两三年后厄瓜多尔的人工饲养罗非鱼也相继大量死亡，随后该病原被确诊为罗非鱼湖病毒(tilapialakevirus,“罗湖病毒”)，现已在三大洲5个国家得到确认，包括哥伦比亚、厄瓜多尔、埃及、以色列和泰国。2017年6月13日，台湾地区确认首例“罗湖”病毒疫情，罗非鱼出现大量死亡情形，我国已经在海南省发现了tilv感染。我国是罗非鱼养殖和出口大国，2015年罗非鱼养殖产量达到180万吨，一旦爆发“罗湖”病毒疫情，将导致大批养殖罗非鱼死亡，造成严重的经济损失。tilv被归类为正粘病毒科(orthomyxoviridae)的一种新病毒，电子显微镜显示病毒粒子为具包膜的二十面体结构，大小为55～75nm，为分段、单链的负链rna病毒，由10个基因片段组成，片段1最大，为1.641kb，片段2～10分别为1.471kb、1.371kb、1.250kb、1.099kb、1.044kb、0.777kb、0.657kb、0.548kb和0.465kb，其中片段1预测蛋白与c型流感病毒的聚合酶基1(polymerasebasic1，pb1)亚基具有弱同源性，其他9个片段与genbank其他序列无同源性。研究表明，所有片段5′和3′非编码区的核苷酸序列都是相似的，这一结构与流感病毒类似，几乎所有的罗非鱼物种被证明易感tilv，该病毒主要危害罗非鱼仔稚鱼和幼鱼，对成鱼影响相对较小，因此幼体阶段似乎比成鱼更易感，感染tilv的患病罗非鱼表现出游动迟缓、食欲不振、体色苍白、皮肤充血糜烂、烂鳃等症状。有证据表明，病鱼的眼、大脑和肝脏中能检测出高浓度的病毒，具体表现为初期眼球突出、晶状体混浊发展为晶状体破裂；软脑膜出血；腹部肿胀、肾脏出血等。tilv是近年来出现的急性传染性病原。2017年5月，oie、联合国粮农组织(fao)等国际组织都针对tilv发布了公告或预警，要求加强对该病毒的检疫和防范，国外已经在罗非鱼湖病毒的细胞培养、组织病理学、pcr、原位杂交等检测技术方面进行了研究，并建立相应的分子检测方法，而国内针对tilv的研究几乎空白。tilv的已有检测技术如lamp技术反应原理复杂，引物设计繁琐，并且在引物设计时针对靶标序列所需要的保守区段较为严格，反应产物不均一，不利于后期的测序构建克隆。pcr技术耗时较长，成本较高，而且需要精密的温度循环仪器，严重限制pcr技术在现场检测中的应用。技术实现要素：重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinaseploymeraseamplication，rpa)利用t4噬菌体编码的重组酶蛋白uvsx和uvsy、单链结合蛋白gp32及bsudna聚合酶，模拟生物体内dna复制，在常温下即可对目标片段进行等温扩增，可以在20-40min完成数十亿的dna拷贝。本发明的发明人在前期研究的基础上，发现目前还没有用于罗非鱼湖病毒rpa检测的特异性探针及其引物，而合适探针及其引物的设计是运用rpa技术检测罗非鱼湖病毒的最关键步骤，设计并通过实验筛选rpa检测罗非鱼湖病毒的具有特异性的引物和探针，基于重组酶聚合酶扩增技术(rpa)和侧向流动免疫层析技术(lfd)相结合，能在15min内恒温37℃条件下可视化检测罗非鱼湖病毒。本发明的上述目的通过以下技术方案实现：用于检测罗非鱼湖病毒的rpa专用引物，是根据罗非鱼湖病毒目的基因设计的，且所述罗非鱼湖病毒目的基因序列为：gatgcacctagatcccaagcaatcggctaatataggggagcaagactttgtgagtacccgagaaatttacaagctggatatgttggaactacctcccataagtaggaagggtgatctggacagagctagtggtcttgagacaagatgggacgtcatcttacttctggaatgcctcgactctaca；所述rpa专用引物的正向引物序列为：gatgcacctagatcccaagcaatcggctaa，所述rpa专用引物的反向引物序列为：tgtagagtcgaggcattccagaagtaagat，所述用于侧向流动免疫层析反应的引物序列为：5`biotin-gatgcacctagatcccaagcaatcggctaa。本发明的第二方面，用于检测罗非鱼湖病毒的探针，是根据罗非鱼湖病毒目的基因设计的，且所述罗非鱼湖病毒目的基因序列为：gatgcacctagatcccaagcaatcggctaatataggggagcaagactttgtgagtacccgagaaatttacaagctggatatgttggaactacctcccataagtaggaagggtgatctggacagagctagtggtcttgagacaagatgggacgtcatcttacttctggaatgcctcgactctaca；所述探针的序列为：5`6-fam-actttgtgagtacccgagaaatttacaagctg/thf/atatgttggaactacctc-3`c3spacer。本发明的第三方面，用于恒温实时检测罗非鱼湖病毒的rpa试剂盒，包括上述rpa专用引物和探针。优选地，用于恒温实时检测罗非鱼湖病毒的rpa试剂盒，还包括含有tilv-7450的阳性对照。优选地，用于恒温实时检测罗非鱼湖病毒的rpa试剂盒，还包括含有无菌ddh2o的阴性对照。需要进一步说明的是，本发明的反应原理在于：采用重组酶聚合酶扩增技术(rpa)与侧向流动免疫层析技术(lfd)相结合，羧基荧光素(fam)标记的特异探针与生物素标记的核酸扩增产物特异性结合作为抗原，将其滴加于试纸条上便会与胶体金标记抗fam的抗体结合，形成三元复合物，当扩散到检测线时三元复合物被生物素配体捕获，形成有颜色的检测线。未杂交的fam标记探针与胶体金标的抗fam的抗体结合，形成不含生物素的两元复合物，结合在质控线上，从而保证试纸条检测的可靠性。上述方法将侧向流动免疫层析技术作为rpa反应的末端检测，具有检测结果肉眼可判读，操作简单，检测时间短，便于携带等优点。与现有技术相比，本发明的积极进步效果在于：(1)本发明针对罗非鱼湖病毒目的基因设计具有特异性的rpa专用引物和探针，是运用rpa技术检测罗非鱼湖病毒的关键，克服目前没有罗非鱼湖病毒rpa专用引物和探针的问题。(2)本发明中包括上述引物和探针的rpa试剂盒可以快速且成功检测罗非鱼湖病毒tilv，能在15min内、恒温37℃条件下可视化检测样品是阳性还是阴性。附图说明图1为实施例1中反应产物的试纸条分析结果，其中，1、2号样品为阳性检测结果，nc为阴性样品；图2为实施例2中rpa反应体系特异性引物的筛选，其中，nc为阴性样品；primer1primer2和primer3分别为针对tilv湖病毒设计的特异性引物。具体实施方式下面结合附图给出本发明较佳实施例，以详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述实施例。发明人委托上海生物工程公司合成针对tilv目的基因的特异性引物序列和探针序列，通过在保守基因区域设计一系列梯度候选引物，并根据rpa凝胶检测结果从中选择最佳引物。其中，rpa专用引物的正向引物f引物的序列为：gatgcacctagatcccaagcaatcggctaa；f-lfd引物的序列：5`biotin-gatgcacctagatcccaagcaatcggctaa；rpa专用引物的反向引物r引物的序列为：tgtagagtcgaggcattccagaagtaagat；探针pro-lfd的序列为：5`6-fam-actttgtgagtacccgagaaatttacaagctg/thf/atatgttggaactacctc-3`c3spacer；如序列表所示。采用的rpa检测试剂盒twistampliquidbasicrtkit购自英国twistdx公司。实施例1rpa试剂盒检测罗非鱼湖病毒通过上述试剂盒检测罗非鱼湖病毒的具体方法为：1)50ulrpa反应体系包括：f-lfd引物、r引物各2.4ul(10um)，pro-lfd探针0.6ul(10um)，rehydrationbuffer29.5ul，模板2ul和ddh2o10.6ul，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的twistbasicrt八联管中，充分混匀后加入2.5ul醋酸镁(280mm)溶液，放入37℃金属恒温箱中4min，拿出混匀后又放入37℃金属恒温箱15min。2)取10ul步骤1)的反应液，加入100ulhybridetectassaybuffer混匀后插入lfd试纸条反应10min，结果如附图1所示。当试纸条出现两条条带，一条位于质控区内，一条位于检测区，结果为阳性，表明样本中含有罗非鱼湖病毒；当试纸条只有质控区出现一条条带，检测区没有条带，结果是阴性，表明样本中不含有罗非鱼湖病毒，其中，1和2为湖病毒阳性样品，nc为阴性样品。实施例2rpa反应体系的反应条件优化rpa检测试剂盒twistampliquidbasicrtkit购自英国剑桥twistdx公司，经筛选设计好的三对引物如表1所示。表1名称序列rpa-tilv-f01aaaggagaccaaccgcctccactcaccactrpa-tilv-r01agaccactagctctgtccagatcacccttcrpa-tilv-f02gatgcacctagatcccaagcaatcggctaarpa-tilv-r02tgtagagtcgaggcattccagaagtaagatrpa-tilv-f03aggagaccaaccgcctccactcaccacttarpa-tilv-r03tagagtcgaggcattccagaagtaagatga50ulrpa反应体系包括：f/r引物各2.4ul(10um)、rehydrationbuffer29.5ul、模板2ul和ddh2o11.2ul，将上述混合液加入到含有冻干酶粉的0.2mltwistbasicrt八联管中，充分混匀后加入2.5ul醋酸镁(280mm)溶液开始反应；上述反应体系在37℃下扩增反应5min，混匀后再在37℃下扩增反应20min，取5ul产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察，结果如附图2所示，rpa-tilv-f02/r02引物扩增效率最高。以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。序列表<110>上海海洋大学<120>恒温实时检测罗非鱼湖病毒的rpa试剂盒及其专用引物和探针<130>2018-05-29<141>2018-06-20<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>184<212>dna<213>未知()<400>1gatgcacctagatcccaagcaatcggctaatataggggagcaagactttgtgagtacccg60agaaatttacaagctggatatgttggaactacctcccataagtaggaagggtgatctgga120cagagctagtggtcttgagacaagatgggacgtcatcttacttctggaatgcctcgactc180taca184<210>2<211>30<212>dna<213>未知()<400>2gatgcacctagatcccaagcaatcggctaa30<210>3<211>30<212>dna<213>未知()<400>3tgtagagtcgaggcattccagaagtaagat30当前第1页12