本发明涉及鹦鹉喙羽病病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，属于兽用生物制品领域。
背景技术：
鹦鹉喙羽病(psittacinebeakandfeatherdisease，pbfd)是鹦鹉目前最重要的传染病，鹦鹉喙羽病病毒(psittacinebeakandfeatherdiseasevirus，pbfdv)感染广泛存在于世界各地野生及笼养的鹦鹉群中，有40多个品种的鹦鹉可感染该病，给伴侣鸟贸易和鹦鹉养殖业造成不小的经济损失。该病最早于上世纪70年代在澳大利亚多种野生的凤头鹦鹉(cockatoo)中发现。1981年，perry首次命名此病为鹦鹉喙羽病，鹦鹉感染鹦鹉喙羽病病毒后，因继发感染造成的死亡约占69％，或许是由于免疫抑制造成了鹦鹉的高γ球蛋白血症、相关病毒的感染及淋巴组织的破坏。目前，主要根据临床表现和组织学观察可对该病做出初步诊断，应用免疫组化或通过pcr可作出确诊，但现有的检测方法存在一定的局限性及非特异性。因此，需要建立一种快速、灵敏、性质稳定、特异性强的检测pbfdv的方法，以更好的满足工作人员的需求。
技术实现要素：
鉴于现有鹦鹉感染鹦鹉喙羽病病毒(pbfdv)检测技术的不足，本发明的目的在于提供pbfdv的核酸探针斑点杂交检测试剂盒，旨在解决现有的检测方法存在的弊端。本发明所提供的试剂盒利用特异性地高辛核酸片段探针，能同时鉴别性的检测大量样品中的pbfdv。通过对病料组织样品dna提取物进行斑点分子杂交，特异性的检测样品中的pbfdv。
本发明所涉及的试剂盒是利用pbfdvcp基因片段为模板，用特定引物(序列2和序列3)通过pcr合成了经地高辛(digoxiaenin，dig)标记的特异性核酸探针(序列1)。通过斑点分子杂交，该探针可用于检测病料样品中pbfdv特异性核酸的存在，用于判定是否有pbfdv感染。利用这一方法，在1张8×8cm大小的尼龙膜上可同时检测约100份病料的核酸样品。病料在组织样品核酸提取后，斑点分子杂交可在24h～36h内完成检测并报告结果。
本发明的技术方案
1.鹦鹉喙羽病病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有：
(1)经地高辛标记的有830碱基的序列1所述的核酸探针；
(2)作为阳性对照用的未经标记的830碱基的序列1所述的核酸序列的基因dna；
(3)作为阴性对照用的经检验合格spf鸡胚制备的cef提取的dna；
(4)尼龙膜、碱基磷酸酶标记的抗地高辛抗体、显色底物nbt/bcip溶液、变性液、中和液、预杂交液、洗液i、洗液ii、缓冲液i、缓冲液ii、缓冲液iii。
2.本发明所述的鹦鹉喙羽病病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒，其特征在于该试剂盒的试验结果判定是利用鹦鹉喙羽病病毒cp基因片段的特异性，做dna与dna的斑点分子杂交，根据有无斑点反应，可特异性检测鹦鹉喙羽病病毒。
3.本发明所述的鹦鹉喙羽病病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒的制备方法，其特征在于利用特定引物序列2和序列3所述的引物，通过pcr合成了经地高辛标记的核酸探针，通过斑点分子杂交，这些探针将用于检测病料样品中鹦鹉喙羽病病毒特异性核酸的存在。
本发明的详细描述
一、核酸探针及基因dna对照品的制备
1.地高辛标记pbfdv-cp核酸检测探针的制备
(1)以pbfdvcp基因片段ppb-cp克隆质粒(本发明人制备和测序并保存)为模板，用所设计并合成的一对引物pb-f(序列2)、pb-r(序列3)扩增出长度为830bp的pbfdv-cp基因片段(序列1)，此段序列为pbfdv特异性的。
所用引物(序列2、3)
pb-f：5’-cagaacatatcgaaatgg-3’18
pb-r：5’-tgcagatatcaagactgcc-3’19
(2)探针标记反应程序
表1pcr反应体系
*pcrdig探针合成混合物为含有dig-11-dutp的dntp的混合物，购自roche公司
pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min，反应30个循环；最后72℃延伸10min。pcr产物通过1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。由此合成的为有dig标记的830bp的pbfdv-cp核酸探针dna。将pbfdv-cp核酸检测探针用dna定量仪测定浓度，将浓度调至20ng/μl。
2.pbfdv非标记的阳性对照核酸的制备
(1)以pbfdvcp基因片段ppb-cp克隆质粒为模板，用所设计并合成的一对引物pb-f(序列2)pb-r(序列3)扩增出长度为830bp的非标记的pbfdv-cp基因片段(序列1)。
(2)反应程序
表2pcr反应体系
pcr反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，反应31个循环；72℃延伸10min，4℃保存。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行分析。由此合成如序列1所述核酸序列的为未标记的830bpdna作为阳性对照，将dna最终浓度调整至1pg/μl。
3.电泳结果见图1，地高辛标记pcr产物在琼脂糖凝胶电泳中呈现一条清晰条带，虽都是830bp，却比未经地高辛标记的pcr产物滞后(因带有地高辛标记的dntp分子量较大电泳速度较低导致)，表明用pcr合成的地高辛标记的pbfdv-cp探针有效，而且匀质性较好。
4.阴性对照核酸的制备
按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会编，中华人民共和国兽药典2015年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录方法制备spf鸡胚成纤维细胞(cef)，将cef悬液按常规方法(分子克隆实验指南)提取基因组dna，用70％酒精沉淀后重新溶于te缓冲液中，将dna浓度调整至1μg/μl。
5.变性液的制备
称取2g氢氧化钠、8.775g氯化钠定容至100ml水中。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
6.中和液的制备
称取6.057gtris-base、17.532g氯化钠定容至100ml水中，调ph值7.4。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
7.预杂交液的制备
20×ssc称取17.53g氯化钠和8.82g柠檬酸钠定容至100ml水中，调ph值7.0。
10％sds称取sds10g定容至100ml水中，调ph值至7.2。
预杂交液37.5ml20×ssc和3ml10％sds混匀后，加入3gblockingreagent，定容至150ml水中。性状为均质的牛奶样乳白色，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量析出，需置37℃充分溶解后使用。
8.洗液i的制备
15ml20×ssc和1.5ml10％sds定容至150ml水中。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
9.洗液ii的制备
3.75ml20×ssc和1.5ml10％sds定容至150ml水中。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
10.缓冲液i的制备
称取6.025gtris-base、4.383g氯化钠定容至500ml水中，调ph值7.5。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
11.缓冲液ii的制备
称取3gblokingreagent加入150ml缓冲液i中。性状为均质的牛奶样乳白色，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
12.缓冲液iii的制备
称取1.8075gtris-base、0.8766g氯化钠、0.714g氯化镁定容至150ml水中，调ph值9.5。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长，久置会有少量沉淀物，需置37℃充分溶解后使用。
13.碱性磷酸酶标记抗dig抗体
酶标抗dig抗体购自罗氏公司。性状为无色溶液，澄清，无臭、无味、无沉淀物，并应无菌生长。
14.显色底物nbt/bcip
显色底物nbt/bcip购自罗氏公司。性状为淡黄色，无臭、无味，长期静置有沉淀，用前离心取上清，并应无菌生长。
15.尼龙膜的制备
尼龙膜购自罗氏公司。性状为白色洁净，无折叠无划痕。
二、试剂盒的组成
1.特异性核酸探针
试剂1：地高辛标记的pbfdv-cp基因片段(序列1)特异性核酸探针，装量为20μl/管，1管/盒。
序列1：
2.pbfdv非标记的阳性对照核酸
试剂2：pbfdvcp基因(830bp的序列1)pcr扩增的dna，装量为20μl/管，1管/盒。
3.阴性对照核酸
试剂3：cef制备的基因组dna，装量为20μl/管，1管/盒。
4.尼龙膜8cm×8cm，5片/袋，l袋/盒。
5.其他试剂
试剂4：变性液装量为50ml/瓶，1瓶/盒。
试剂5：中和液装量为50ml/瓶，1瓶/盒。
试剂6：预杂交液装量为100ml/瓶，1瓶/盒。
试剂7：洗液i装量为100ml/瓶，1瓶/盒。
试剂8：洗液ii装量为100ml/瓶，1瓶/盒。
试剂9：缓冲液i装量为30ml/瓶，1瓶/盒。
试剂10：缓冲液ii装量为100ml/瓶，1瓶/盒。
试剂11：缓冲液iii装量为100ml/瓶，1瓶/盒。
试剂12：酶标抗dig抗体装量为10μl/管，1管/盒。
试剂13：显色底物nbt/bcip装量为500μl/管，1管/盒。
说明书1份。
变性液、中和液、预杂交液、洗液i、洗液ii、缓冲液i、缓冲液ii、缓冲液iii在2～8℃下保存，尼龙膜在常温下保存，有效期为12个月。其他组分在-20℃以下保存，有效期为12个月。
三、试剂盒的操作方法
1.核酸样品的制备：
样品dna的提取取待检测组织样品每份0.1g研磨后，加入0.5ml抽提缓冲液(100mmol/lnacl，10mmol/ltris-clph值8.0，0.25mmol/ledtaph值8.0，0.5％sds)和终浓度为100μg/ml的蛋白酶k于55℃消化过夜(6～8h)。加入等体积苯酚/氯仿溶液，充分振荡混匀后，12000r/min离心5min，上清液转移至另一离心管中，再加入两倍体积的无水乙醇混匀后置于-20℃冷冻1h以上，12000r/min离心15min，弃去上清。再加入1ml70％的无水乙醇洗涤1次，沉淀溶解于适量te缓冲液(10mmol/ltris-cl，0.1mmol/ledtaph值8.0)中，即为样品dna。
2.斑点分子杂交及免疫检测：
(1)取一张试剂盒中的尼龙膜(不分正反面，使用前正反面均有纸覆盖保护)，划好格子(0.75cm×0.75cm)，做好标记。
(2)把试剂盒中的阴性对照核酸和阳性对照核酸各取1μ1及提取的样品dna各取2μ1分别点样到尼龙膜各个格子的中央。
(3)用镊子把尼龙膜(点样面朝上)放于已用变性液饱和的滤纸上(滤纸提前放于玻璃平皿中)变性10min，再用镊子取出放于已用中和液饱和的滤纸上(滤纸提前放于玻璃平皿中)中和5min。
(4)将膜用镊子取出，放于平皿中(点样面朝上)室温干燥10min，至膜表面没有明显的水珠即可，在电热恒温鼓风干燥箱中于80℃干烤2h固定dna。
(5)将10ml预杂交液加入平皿中，用镊子将膜转移至预杂交液后，在电热恒温水槽中65℃反应2h，每15min摇动1次尼龙膜平皿。
(6)在(5)步骤开始1.5h后，取10ml预杂交液和4μlpbfdv-cp核酸探针加入50ml的离心管中，置于沸水中煮沸变性10min，取出后立即放于冰浴中速冻5min(防止变性后复性)，即为杂交液。
(7)将平皿中的预杂交液倒掉，把(6)中的杂交液倒入平皿中，需盖过尼龙膜，后转入65℃杂交6h以上，最好过夜。
(8)取出平皿，倒掉杂交液(杂交后可回收杂交液，可用三次)，在尼龙膜上加入10ml洗液i中，在水平摇床上，室温洗涤15min/次，洗涤2次。
(9)倒掉洗液i，在平皿中加入10ml洗液ii，在电热恒温水槽中，65℃洗涤15min/次，洗涤2次，每5min摇动1次尼龙膜平皿。
(10)倒掉洗液ii，平皿中加入10ml缓冲液i，于室温洗涤1min。
(11)倒掉缓冲液i，平皿中加入10ml缓冲液ii，37℃培养箱中反应30min。
(12)在10ml缓冲液ii中加入2μl抗地高辛抗体的碱性磷酸酶标记物(用之前12000r/min离心5min)，将尼龙膜放于其中，37℃培养箱中反应30min(不要超过此时间，以免影响酶活性)。
(13)倒掉(12)溶液，在平皿中加入10ml缓冲液i，在水平摇床上，室温洗涤5min/次，洗涤5次。
(14)倒掉(13)溶液，在平皿中加入10ml缓冲液iii，室温反应2min。
(15)倒掉(14)溶液，在平皿中加入10ml缓冲液iii和100μl显色底物nbt/bcip，避光显色2～10h，观察显色结果。
(16)倒掉显色液，加入水反复冲洗，及时终止显色并拍照记录结果。
3.结果判定：
阳性对照出现褐色显色，阴性对照无显色，判定试验有效。
样品有显色的为阳性，无显色为阴性。
#：信号极强显色极其明显，有很深的褐黑色斑点；
+++：信号较强显色很明显，有较深的褐色斑点；
++：信号较好显色明显，有明显褐色斑点；
+：有信号呈肉眼可见的褐色斑点；
—：没有信号不显色。
4.注意事项
4.1实验人员须经专业培训，实验过程应严格分区进行(样品制备区、扩增和产物分析区等)。
4.2实验过程中请穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器。
4.3样品制备区所用过的吸头应打入盛有消毒剂的容器中，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃，不再使用的样品和反应管也应集中密封、灭菌后方可丢弃。
4.4应定期校验移液器及pcr仪。
4.5试剂盒各组分请按储存温度分别保存，切忌反复冻融。
4.6每个样品1个吸头，避免样品交叉污染。
4.7阴、阳性对照已稀释，无需再稀释。
4.8显色底物应避光保存，用前离心。
4.9严格按照实验操作步骤操作。
附图说明
图1：pbfdv核酸探针标记电泳图，m：dnamarker(2000dl)；1-4：以pbfdvcp基因830bp片段为模板的地高辛标记pcr法扩增的pbfdv核酸探针；5-8：以pbfdvcp基因830bp片段为模板的常规pcr法结果。
图2：pbfdv-cp核酸探针灵敏性检测结果图，1：阴性对照核酸；2-6:0.1、1、10、100、1000pg量的pbfdvdna。
图3：pbfdv-cp核酸探针灵敏性检测结果图，1：阴性对照核酸；2-8：ciav、mdv、rev、alv-a，alv-b，alv-j、apv的基因组dna；9：阳性对照核酸。
本发明的积极意义
本发明涉及鹦鹉喙羽病病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒。本发明试剂盒公开了用特定引物通过pcr合成了经地高辛标记的特异性核酸探针，通过斑点分子杂交，该探针可用于检测病料样品中鹦鹉喙羽病病毒核酸的存在，用于判定是否有鹦鹉喙羽病病毒感染。利用本发明所涉及的试剂盒，通过提取病料组织样品的dna进作斑点分子杂交，可在24h～36h内完成检测并报告结果，在1张8cm×8cm大小的尼龙膜上可同时检测约100份病料的核酸样品，并且特异性强，准确性高。
具体实施方式
实施例1——本发明试剂盒检测pbfdv的敏感性试验
(1)样品：pbfdv非标记的阳性对照核酸。
(2)样品处理：将pbfdv非标记的阳性对照核酸稀释至1000、100、10、1、0.1pg/μl，以及阴性对照核酸在尼龙膜上依次点样，做好标记，进行斑点杂交。
(3)用镊子把尼龙膜(点样面朝上)放于已用变性液饱和的滤纸上(滤纸提前放于玻璃平皿中)变性10min，再用镊子取出放于已用中和液饱和的滤纸上(滤纸提前放于玻璃平皿中)中和5min。
(4)将膜用镊子取出，放于平皿中(点样面朝上)室温干燥10min，至膜表面没有明显的水珠即可，在电热恒温鼓风干燥箱中于80℃干烤2h固定dna。
(5)将10ml预杂交液加入平皿中，用镊子将膜转移至预杂交液后在电热恒温水槽中65℃反应2h，每15min摇动1次尼龙膜平皿。
(6)在(5)步骤开始1.5h后，取10ml预杂交液和4μlpbfdv-cp核酸探针加入50ml的离心管中，置于沸水中煮沸变性10min，取出后立即放于冰浴中速冻5min(防止变性后复性)，即为杂交液。
(7)将平皿中的预杂交液倒掉，把(6)中的杂交液倒入平皿中，需盖过尼龙膜，后转入65℃杂交6h以上，最好过夜。
(8)取出平皿，倒掉杂交液(杂交后可回收杂交液，可用三次)，在尼龙膜上加入10ml洗液i中，在水平摇床上，室温洗涤15min/次，洗涤2次。
(9)倒掉洗液i，在平皿中加入10ml洗液ii，在电热恒温水槽中，65℃洗涤15min/次，洗涤2次，每5min摇动1次尼龙膜平皿。
(10)倒掉洗液ii，平皿中加入10ml缓冲液i，于室温洗涤1min。
(11)倒掉缓冲液i，平皿中加入10ml缓冲液ii，37℃培养箱中反应30min。
(12)在10ml缓冲液ii中加入2μl抗地高辛抗体的碱性磷酸酶标记物(用之前12000r/min离心5min)，将尼龙膜放于其中，37℃培养箱中反应30min(不要超过此时间，以免影响酶活性)。
(13)倒掉(12)溶液，在平皿中加入10ml缓冲液i，在水平摇床上，室温洗涤5min/次，洗涤5次。
(14)倒掉(13)溶液，在平皿中加入10ml缓冲液iii，室温反应2min。
(15)倒掉(14)溶液，在平皿中加入10ml缓冲液iii和100μl显色底物nbt/bcip，避光显色2～10h，观察显色结果。
(16)倒掉显色液，加入水反复冲洗，及时终止显色并拍照记录结果。(结果见图2)。
(17)敏感性结果：
pbfdv特异性核酸片段为1000、100、10、1pg的量时，核酸显色，呈阳性反应；pbfdv特异性核酸片段为0.1pg的量及阴性对照核酸均不显色，呈阴性反应。
表3：pbfdv-cp探针的敏感性检测信号强度统计
采用本发明试剂盒可检测到1pg量的pbfdv特异性核酸片段，表明本检测方法具有较好的敏感性。
本发明利用特定引物序列2和序列3所述的引物，通过pcr合成的经地高辛标记的探针，通过斑点分子杂交，该探针可用于检测病料品中pbfdv特异性核酸的存在，且具有较高的灵敏性。
实施例2——本发明试剂盒检测pbfdv的特异性试验
(1)样品：本实验室分离鉴定和保存的鸡传染性贫血病毒(ciav)、鸡马立克氏病病毒(mdv)、禽网状内皮组织增生症病毒(rev)以及不同亚群禽白血病病毒(alv-a、alv-b、alv-j)、禽多瘤病毒(apv)病毒的各病毒基因组dna。
(2)样品处理：把试剂盒中的阴性对照核酸和阳性对照核酸各取1μl和ciav、mdv、rev、alv-a、alv-b、alv-j、apv的基因组dna各取2μl分别点样到尼龙膜上，做好标记。
(3)用镊子把尼龙膜(点样面朝上)放于已用变性液饱和的滤纸上(滤纸提前放于玻璃平皿中)变性10min，再用镊子取出放于已用中和液饱和的滤纸上(滤纸提前放于玻璃平皿中)中和5min。
(4)将膜用镊子取出，放于平皿中(点样面朝上)室温干燥10min，至膜表面没有明显的水珠即可，在电热恒温鼓风干燥箱中于80℃干烤2h固定dna。
(5)将10ml预杂交液加入平皿中，用镊子将膜转移至预杂交液后在电热恒温水槽中65℃反应2h，每15min摇动1次尼龙膜平皿。
(6)在(5)步骤开始1.5h后，取10ml预杂交液和4μlpbfdv-cp核酸探针加入50ml的离心管中，置于沸水中煮沸变性10min，取出后立即放于冰浴中速冻5min(防止变性后复性)，即为杂交液。
(7)将平皿中的预杂交液倒掉，把(6)中的杂交液倒入平皿中，需盖过尼龙膜，后转入65℃杂交6h以上，最好过夜。
(8)取出平皿，倒掉杂交液(杂交后可回收杂交液，可用三次)，在尼龙膜上加入10ml洗液i中，在水平摇床上，室温洗涤15min/次，洗涤2次。
(9)倒掉洗液i，在平皿中加入10ml洗液ii，在电热恒温水槽中，65℃洗涤15min/次，洗涤2次，每5min摇动1次尼龙膜平皿。
(10)倒掉洗液ii，平皿中加入10ml缓冲液i，于室温洗涤1min。
(11)倒掉缓冲液i，平皿中加入10ml缓冲液ii，37℃培养箱中反应30min。
(12)在10ml缓冲液ii中加入2μl抗地高辛抗体的碱性磷酸酶标记物(用之前12000r/min离心5min)，将尼龙膜放于其中，37℃培养箱中反应30min(不要超过此时间，以免影响酶活性)。
(13)倒掉(12)溶液，在平皿中加入10ml缓冲液i，在水平摇床上，室温洗涤5min/次，洗涤5次。
(14)倒掉(13)溶液，在平皿中加入10ml缓冲液iii，室温反应2min。
(15)倒掉(14)溶液，在平皿中加入10ml缓冲液iii和100μl显色底物nbt/bcip，避光显色2～10h，观察显色结果。
(16)倒掉显色液，加入水反复冲洗，及时终止显色并拍照记录结果。(结果见图3)。
(17)特异性结果：
阳性对照核酸显色，呈阳性反应；ciav、mdv、rev、alv-a，alv-b，alv-j、apv、阴性对照核酸均不显色，呈阴性反应。
(18)结果验证
经过斑点检测为阴性的，通过分子生物学方法检测确认均不含pbfdv。表明本检测方法特异性强，检测结果准确可靠。
本发明的试剂盒的试验结果判定是利用pbfdvcp基因片段的特异性，作dna与dna的斑点分子杂交，根据有无斑点反应，可特异性检测pbfdv。
序列表
<120>鹦鹉喙羽病病毒特异性核酸探针斑点杂交检测试剂盒
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>830
<212>dna
<213>扩增的鹦鹉喙羽病病毒-cp基因片段(人工序列)
<400>1
ttgggtcctccttgtagtgggatccagccggttctcgcgctgtttagccacaatgctgca60
gactggttcgctgtggtcaggtcctctatcgttatttgtggtttgggtctgaggaggcgt120
ttgaatcccctgctaacaaaccatttcttggcaccgtcgaaaggtgccagagggtcttgt180
gtttggttcgtagtagttttaaatctagttattctggagtcttggattacggccgtgtgg240
ccgaatccgtctgattgtaaggtgtaatgtccccctgtgggcctcatttccattttagct300
aacttaattcggtaatcttcaaaattgagtgtgtgtgggtttgggacggcttgtaggaag360
tcgtccaacgcaaaggtaatgtagtcagcattaaaaattaggttgccaacactggtggtt420
tgtttgttaattttgaattggaattggcgcgtgagtctgagctccagtgcgtcggtctgg480
aatcgacgatccagccaagacgcgtcggggccaccccgtggcatcgtggcgatcgcctgc540
tcgcggatgttcgcctcacccatggcagctcttcccctctcgacgtcccgtgttcgcaat600
gctatgagaccgctgaccgggctccccagcccgccggtcgcgcgtgcttagctacgtagc660
agaggggccgtcacttcgagggctgccgccactcggtgatcttgcggcccaatgaatcgg720
ccgcgttcgaggctgcccgtcccacgccctcgacgatgccaccgaatccgtcgcggatac780
ctttgatcagcgggtcagtgtaaattctattggttgagaaacggcgtctg830
<210>3
<211>18
<212>dna
<213>上游引物pb-f(人工序列)
<400>3
cagaacatatcgaaatgg18
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>下游引物pb-r(人工序列)
<400>2
tgcagatatcaagactgcc19