一种HLA-B＊5801基因的检测方法及检测试剂盒与流程

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种hla-b*5801基因的检测方法及检测试剂盒。

背景技术

随着人们饮食中的高蛋白、高嘌呤、高热量食物的摄入量的大幅上升，以及饮酒量增加，活动量减少等，导致了肥胖和代谢综合征患者增加，使得伴随的高尿酸血症和原发性痛风的发病率呈上升趋势。研究显示，痛风是一种由于嘌呤物质代谢异常，尿酸产生过多或因尿酸排泄不良而致血中尿酸升高，尿酸盐结晶沉积在关节滑膜、滑囊、软骨及其他组织中引起的反复发作性炎症性疾病，其表现为患者关节活动受限、热、痛、肿，伴有关节畸形、结节性痛风结石甚至肾脏病变，该疾患给患者带来极大痛苦。

别嘌醇是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂，通过抑制该酶的活性，减少次黄嘌呤和黄嘌呤合成尿酸，从而减少尿酸的生成，使血和尿中的尿酸含量减低到溶解度以下水平，防止尿酸形成结晶沉积在其他组织内，被广泛用于痛风、高尿酸血症的治疗中，还可预防白血病、淋巴瘤或其他肿瘤在化疗或放疗后继发组织内尿酸盐沉积、肾结石，尤其适用于尿酸生成过多、对排尿酸药过敏或无效，以及不宜使用排尿酸药物的患者。但该药可引起严重副反应，包括stevens-john综合征(sjs)及中毒性表皮坏死症(ten)。sjs表现为严重的多形性红斑，可累及皮肤与粘膜，包括口、鼻、眼、阴道、尿道、胃肠道和下呼吸道粘膜，患者有失明之虞，可进一步发展形成ten，全身黏膜溃烂，在红斑上发生松弛性大泡或表皮剥离，若遇轻度触碰或牵拉可导致表皮大面积剥离。研究表明，hla-b*5801等位基因与别嘌呤醇引发的严重皮炎副反应呈现很强的相关性，尤其在汉族人中高达100％，几乎所有副反应的患者都是hla-b*5801的携带者，而别嘌呤醇耐受者中只有15％左右的hla-b*5801携带者，检测hla-b*5801等位基因可以预防别嘌呤醇引发的sjs或ten。在2012年美国风湿病学会更新的痛风管理指南中也建议使用别嘌呤醇前，应对严重过敏反应的高危人群，建议进行hla-b*5801等位基因检测。但鉴于hla-b多态性位点的复杂性，hla-b*5801检测方法操作繁琐、干扰因素多，且可能由于罕见或未知hla等位基因的干扰导致结果模棱两可难以判读。

日本学者研究发现psors1c1基因位点的snp-rs9263726与别嘌呤醇所致的sjs/ten相关，且该snp与hla-b*5801完全连锁，这一发现为检测hla-b*5801等位基因找到了简单快速的方法。目前，国内外对hla-b*5801等位基因进行检测的方法主要有dna直接测序法和taqman探针法等，dna直接测序法是目前等位基因检测的金标准，但存在费时费力等缺陷，是一种低通量的检测方法，不适用于大量样本检测；taqman是高度特异的定量pcr技术，其特点是适应于大样本少量等位基因的位点检测，是一种中等通量的等位基因检测，而对于同时检测多个等位基因的位点，则费用较高，并不适合使用。

技术实现要素：

基于此，有必要针对通过检测标签snp来检测样本的hla-b的基因型这一研究方向，提供hla-b*5801基因的检测方法及检测试剂盒。

一种hla-b*5801基因的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)针对hla-b*5801基因设计特异性引物；

(2)利用特异性pcr扩增包含hla-b*5801基因的目的片段；

(3)利用限制性内切酶消化pcr产物片段；

(4)进行单碱基延伸反应；

(5)进行脱盐纯化处理；

(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因hla-b*5801的基因序列。

上述hla-b*5801基因的检测方法，检测准确性高，同金标准sanger测序法的结果相比，准确率超过99.7％，同时可以直接检测dna质谱，能检测出样本中的三等位snp位点的存在，实验可重性高。该方法在检测通量上面比起传统的snp位点其他检测技术要大很多，一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验，成本折算后单位点成本比其他同类检测snp位点的技术方法花费少，适合多种用户和批量检测的需求，是检测snp位点的理想工具。

在其中一个实施例中，所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增hla-b*5801基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物seqidnos：1和一条反向引物seqidnos：2，正向引物seqidnos：1的序列为：ccagctttacaaggaccccag，反向引物seqidnos：2的序列为：ttggctctcaccagaaatgg。

在其中一个实施例中，所述步骤(2)中特异性pcr扩增的反应程序为：98℃热启动，10分钟；95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；扩增40个循环；72℃终延伸，5分钟。

在其中一个实施例中，所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。

在其中一个实施例中，所述步骤(3)中的限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。

在其中一个实施例中，所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括单碱基延伸引物seqidnos：3，引物seqidnos：3的序列为：gatcccagctccgaggaaactc。

在其中一个实施例中，所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为：95℃热启动，1分钟；95℃变性，5秒；56℃退火，5秒；80℃延伸，5秒；扩增40个循环；72℃终延伸，3分钟。

在其中一个实施例中，所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为：

(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；

(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ulddh2o，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。

本发明还提供了一种hla-b*5801基因的检测试剂盒，包括用于扩增hla-b*5801基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物seqidnos：1和一条反向引物seqidnos：2，正向引物seqidnos：1的序列为：ccagctttacaaggaccccag，反向引物seqidnos：2的序列为：ttggctctcaccagaaatgg。

上述hla-b*5801基因的检测试剂盒，简化了实验流程，人员操作时间短、难度小，实验自动化程度高。

在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括用于单碱基延伸反应的单碱基延伸引物seqidnos：3，引物seqidnos：3的序列为：gatcccagctccgaggaaactc。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果；

(1)本发明所述的hla-b*5801基因的检测方法在检测通量上面比起传统的snp位点其他检测技术要大很多，一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验，是检测snp位点的理想工具；

(2)本发明所述的hla-b*5801基因的检测方法检测准确性高，同金标准sanger测序法的结果相比，准确率超过99.7％，同时可以直接检测dna质谱，能检测出样本中的三等位snp位点的存在，实验可重性高。

(3)本发明所述的hla-b*5801基因的检测方法低成本、性价比高，一张芯片上可以完成384个生物样本的多重实验，成本折算后单位点成本比其他同类检测snp位点的技术方法花费少，适合多种用户和批量检测的需求。

(4)本发明所述的基因序列snp位点核酸质谱检测方法实验流程简单、人员操作时间短、难度小，实验自动化程度高，数据处理软件处理方便，报告结果清晰易懂。

附图说明

图1为本发明一实施例的核酸质谱分析图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

一种hla-b*5801基因的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

(1)针对hla-b*5801基因设计特异性引物；

(2)利用特异性pcr扩增包含hla-b*5801基因的目的片段；

(3)利用限制性内切酶消化pcr产物片段；

(4)进行单碱基延伸反应；

(5)进行脱盐纯化处理；

(6)通过核酸质谱仪检测分析目标基因hla-b*5801的基因序列。

本发明所述的hla-b*5801基因的检测方法主要基于pcr和单碱基延伸技术，其原理是首先通过pcr引物对含待检snp的目标片段进行扩增，pcr结束后加入限制性内切酶去除反应液中的dntp。然后在反应液中加入snp延伸引物及ddntp等相关组分并进行单碱基延伸反应，反应过程中snp延伸引物可与待检测snp的5’端序列结合并延伸一个碱基，根据不同snp模板可得到不同的延伸产物。

优选地，所述步骤(1)中设计的特异性引物包括用于扩增hla-b*5801基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物seqidnos：1和一条反向引物seqidnos：2，正向引物seqidnos：1的序列为：ccagctttacaaggaccccag，反向引物seqidnos：2的序列为：ttggctctcaccagaaatgg。

相比于其他传统的检测hla-b*5801基因的技术手段，本发明经检测hla-b*5801基因区域的snp位点，这一点就与传统的荧光定量pcr、或sanger测序法较为不同。正如上述核酸质谱的原理，利用核酸质谱检测方法仅在目的区域snp位点延伸一个具有多态性的碱基，不需要检测整个特异性扩增的基因片段。整体检测的通量、实验时间、反应成本、结果进度均较传统方法有很大的提升及优化，具有很好的市场应该价值。

优选地，所述步骤(2)中特异性pcr扩增的反应程序为：98℃热启动，10分钟；95℃变性，30秒；55℃退火，30秒；72℃延伸，30秒；扩增40个循环；72℃终延伸，5分钟。

优选地，所述步骤(3)中的限制性内切酶进行消化处理条件为：37℃消化处理45分钟，85℃加热变性5分钟，冰浴10分钟。

优选地，所述步骤(3)中的限制性内切酶为虾碱性磷酸酶。

优选地，所述步骤(4)中单碱基延伸反应包括单碱基延伸引物seqidnos：3，引物seqidnos：3的序列为：gatcccagctccgaggaaactc。

优选地，所述步骤(4)中单碱基延伸反应的反应程序为：95℃热启动，1分钟；95℃变性，5秒；56℃退火，5秒；80℃延伸，5秒；扩增40个循环；72℃终延伸，3分钟。

优选地，所述步骤(6)的核酸质谱检测的具体步骤为：

(1)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；

(2)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ulddh2o，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(3)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(4)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。

核酸质谱检测时通过将反应液与树脂混合进行离子交换，用于去除液体中吸附于dna片段上的k⁺、na⁺、mg²⁺等离子，防止其干扰质谱检测结果。

反应液与基质在靶板上结晶，进行质谱检测并得到图谱。由于各延伸产物分子量不同，因此可以在各自的分子量位置查看是否出现检测峰，然后判断该样品的snp分型。核酸质谱平台特异性良好，使用国际通用标准品能达到30ppm，最低检测限为5ng基因组dna,对比试验选择的金标准验证技术为sanger测序技术和同类型获批的检测产品，符合性均为100％。

一种hla-b*5801基因的检测试剂盒，包括用于扩增hla-b*5801基因的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物seqidnos：1和一条反向引物seqidnos：2，正向引物seqidnos：1的序列为：ccagctttacaaggaccccag，反向引物seqidnos：2的序列为：ttggctctcaccagaaatgg。

优选地，所述试剂盒还包括用于单碱基延伸反应的单碱基延伸引物seqidnos：3，引物seqidnos：3的序列为：gatcccagctccgaggaaactc。

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述。

实施例1：利用核酸质谱检测方法对人hla-b*5801基因snp位点的检测

1.人基因组dna提取

(1)在生物安全柜中对病人的血液样本进行基因组dna提取操作。采用blood&cellculturednaminikit(qiagencatno:13323)进行提取实验。

(2)引物设计

针对人hla-b*5801基因snp位点进行snp位点引物设计，分别针对这个snp设计特异性的pcr引物和单碱基延伸引物，所设计的pcr引物序列如表1所示。

表1

(3)特异性pcr反应

利用特异性pcr技术扩增出包含hla-b*5801基因的目的片段，按照表2的反应体系配制扩增反应，反应体系配制完成后按照表3的反应程序进行扩增。

表2

表3

(4)碱式磷酸酶消化处理

利用虾碱式磷酸酶对多重pcr反应产物进行消化，去除体系内多余的dntp。每个反应体系中加入0.5u的碱式磷酸酶，用配套的10*tris-buffer调节缓冲液浓度，每个反应加入10*tris-buffer0.5ul。然后在预热的水浴锅内进行37℃消化处理45分钟，然后85℃加热变性5分钟，最后冰浴10分钟。

(5)进行单碱基延伸反应

配制单碱基延伸反应体系，按照表4的反应体系配置。取2ul配制好的单碱基延伸反应的反应液加入到前步消化反应的体系内，然后按照表5的反应程序进行单碱基延伸反应。

表4

表5

(6)产物脱盐纯化及核酸质谱上机前处理

(a)在树脂板上铺好待用树脂，风干5-10分钟；

(b)向样本板的反应孔中加入待测的样本，补充25ulddh2o，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(c)除去封口膜，将样本板倒扣在步骤(1)的树脂板上固定，然后将样本板和树脂板一起翻转，使风干的树脂落入样本板的反应孔内，用封口膜密封，3000转/分钟瞬时离心；

(d)将样本板置于旋转器上慢速旋转20分钟，再3000转/分钟离心5分钟，然后点样上机，用核酸质谱仪进行检测。

(7)核酸质谱仪上机及软件数据分析

按照仪器的操作规程进行上机检测操作，待样品检测完毕，对检测结果进行软件处理分析，最终得到检测结果，核酸质谱分析图具体见图1。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。