本发明涉及生物制药
技术领域：
，具体涉及一种一种从灵芝中提取灵芝多糖的方法。
背景技术：
灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。灵芝是一种珍贵的药用真菌，属于担子菌纲多孔菌科灵芝属，在我国有两千多年的药用史。灵芝首载于《神农本草经》，历代医家都认为灵芝能治疗多种疾病，是滋补强壮扶正固本的珍贵药物。目前已从灵芝中分离得到：三萜类化合物、多糖类、核苷类、甾醇类、生物碱类、呋喃衍生物、氨基酸多肽类、无机元素和脂肪酸等多种成分。其中，灵芝多糖是灵芝所含的主要有效成分之一，因其具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和抗衰老等作用而倍受人们关注。灵芝多糖存在于灵芝的子实体、孢子粉和菌丝体中，具有抑制肿瘤、增强机体对自由基清除的能力，故能减少自由基对机体的损伤、有延缓衰老之功效，还可以提高免疫力、抗炎症、降血脂、降血糖等作用。热水浸提法是提取灵芝多糖常用的方法之一。但是，传统热水浸提法存在提取时间长、温度高、得率低的问题。为克服传统水提取法的不足，近年来，出现了超声或微博辅助萃取、超高压、酶法等新的提取技术与方法，但是这些方法的提取效果也很不理想。与其它食用菌不同，灵芝子实体木质化程度高，结构复杂，多糖一般木质素通过物理或化学键结合在一起，采用一般的方法很难将多糖提取出来。为克服以上方法的缺陷，申请号为201510764260.0的发明专利公开了一种从灵芝子实体中提取灵芝多糖的方法，利用亚氯酸钠-冰醋酸氧化体系来消解灵芝子实体中的木质素和纤维素，使灵芝多糖更多的释放出来，从而提高灵芝多糖的提取效率，但是提取率仍然不高，且用酸碱处理影响多糖的品质。技术实现要素：本发明的发明目的是，针对上述问题，提供一种从灵芝中提取灵芝多糖的方法，该提取方法采用酶处理和超声辅助法协同作用，具有操作步骤简单、产物收率高、处理时间短等优点。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种从灵芝中提取灵芝多糖的方法，包括以下步骤，s1、脱脂：对灵芝子实体进行干燥、粗碎；加入5～10倍重量的乙醇，在75～80℃条件下回流提取进行脱脂，得到粗提物。s2、浸润：将所述粗提物进行干燥、破壁，然后加入5～10倍重量的水，在50～70℃下浸泡1～3h，得到预处理液。s3、酶处理：调节所述预处理液的ph为6～8，然后加入灵芝子实体质量的3～8％的复合酶，在40～55℃下处理1～3h，然后灭酶，得到提取液。所述复合酶包括质量比为2～5:1～3:2:1～3:2:2:1的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、ɑ-淀粉酶、中性蛋白酶和甘露聚糖酶。s4、超声波提取：将所述提取液超声波提取30～40min，提取温度为40～45℃，然后离心过滤得上清液i和残渣。s5、二次提取：将步骤s4中的残渣进行二次提取，向所述残渣加入5～8倍体积的水，在超高压200～300mpa、75～85℃条件下处理20～40min，然后离心过滤得上清液ii。；s6、醇沉：合并上清液i和上清液ii得滤液，将所述滤液减压浓缩至原质量的40～60％，加入95％乙醇，使滤液中乙醇终浓度为75～85％，静置2～4h过滤、真空干燥、粉碎，得灵芝多糖。优选的，步骤s1中，灵芝子实体粗碎为40～50目。优选的，步骤s1中，所述乙醇的体积分数为80～90％。优选的，步骤s2中，将所述粗提物进行干燥、破壁为400～600目。优选的，步骤s3中，所述纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、ɑ-淀粉酶、中性蛋白酶和甘露聚糖酶的酶活单位为1～10万u/g。优选的，步骤s3中，所述灭酶在85～95℃下处理10～20min。优选的，步骤s4中，超声波功率为100～250w。优选的，步骤s4和s5中，所述离心过滤过程为在6000～7000r/min下离心10～15min。由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：1.本发明的从灵芝中提取灵芝多糖的方法，采用脱脂、破壁处理、酶处理和超声辅助法协同作用，具有操作步骤简单、节省溶剂、产物收率高、处理时间短等优点。采用复合酶解法提取灵芝子实体多糖，一方面通过降解植物细胞壁使有效成分更易提取从而达到提高提取率或降低溶剂消耗量的目的；另一方面可以针对其中的大多数杂质(淀粉、果胶、蛋白质等)选择性降解，以更利于后续分离纯化的进行。复合酶采用纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、ɑ-淀粉酶、中性蛋白酶和甘露聚糖酶结合使用，可以提高酶解程度，缩短时间，提高提取速率和收率。2.本发明的从灵芝中提取灵芝多糖的方法，采用超声波两级提取方式，结合酶处理和加热提取，可以大大提高产物收率。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种从灵芝中提取灵芝多糖的方法，包括以下步骤，s1、脱脂：对灵芝子实体进行干燥、粗碎；加入8倍重量的乙醇，所述乙醇的体积分数为85％，在75℃条件下回流提取进行脱脂，得到粗提物。灵芝子实体粗碎为50目。s2、浸润：将所述粗提物进行干燥、破壁，破壁为500目。然后加入6倍重量的水，在60℃下浸泡2h，得到预处理液。s3、酶处理：调节所述预处理液的ph为7，然后加入灵芝子实体质量的5％的复合酶，在40～55℃下处理1～3h，然后灭酶，得到提取液。所述灭酶为在90℃下处理15min。所述复合酶包括质量比为3:2:2:2:2:2:1的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、ɑ-淀粉酶、中性蛋白酶和甘露聚糖酶。所述纤维素酶的酶活单位为4万u/g，半纤维素酶的酶活单位为6万u/g，果胶酶的酶活单位为5万u/g，木聚糖酶的酶活单位为6万u/g，ɑ-淀粉酶的酶活单位为8万u/g，中性蛋白酶的酶活单位为10万u/g和甘露聚糖酶的酶活单位为4万u/g。s4、超声波提取：将所述提取液超声波提取35min，超声波功率为150w，提取温度为45℃，然后离心过滤得上清液i和残渣，离心过滤过程为在6500r/min下离心12min。s5、二次提取：将步骤s4中的残渣进行二次提取，向所述残渣加入6倍体积的水，在超高压250mpa、80℃条件下处理30min，然后离心过滤得上清液ii，离心过滤过程为在6500r/min下离心12min。s6、醇沉：合并上清液i和上清液ii得滤液，将所述滤液减压浓缩至原质量的50％，加入95％乙醇，使滤液中乙醇终浓度为80％，静置3h过滤、真空干燥、粉碎，得灵芝多糖。实施例2一种从灵芝中提取灵芝多糖的方法，包括以下步骤，s1、脱脂：对灵芝子实体进行干燥、粗碎；加入5倍重量的乙醇，所述乙醇的体积分数为90％，在80℃条件下回流提取进行脱脂，得到粗提物。灵芝子实体粗碎为40目。s2、浸润：将所述粗提物进行干燥、破壁，破壁为600目。然后加入5倍重量的水，在70℃下浸泡1h，得到预处理液。s3、酶处理：调节所述预处理液的ph为6，然后加入灵芝子实体质量的3％的复合酶，在55℃下处理1h，然后灭酶，得到提取液。所述灭酶为在85℃下处理20min。所述复合酶包括质量比为4:3:2:1:2:2:1的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、ɑ-淀粉酶、中性蛋白酶和甘露聚糖酶。所述纤维素酶的酶活单位为6万u/g，半纤维素酶的酶活单位为5万u/g，果胶酶的酶活单位为6万u/g，木聚糖酶的酶活单位为3万u/g，ɑ-淀粉酶的酶活单位为10万u/g，中性蛋白酶的酶活单位为10万u/g和甘露聚糖酶的酶活单位为5万u/g。s4、超声波提取：将所述提取液超声波提取40min，超声波功率为100w，提取温度为45℃，然后离心过滤得上清液i和残渣，离心过滤过程为在7000r/min下离心10min。s5、二次提取：将步骤s4中的残渣进行二次提取，向所述残渣加入5～8倍体积的水，在超高压300mpa、85℃条件下处理20min，然后离心过滤得上清液ii，离心过滤过程为在7000r/min下离心10min。s6、醇沉：合并上清液i和上清液ii得滤液，将所述滤液减压浓缩至原质量的60％，加入95％乙醇，使滤液中乙醇终浓度为85％，静置2h过滤、真空干燥、粉碎，得灵芝多糖。实施例3一种从灵芝中提取灵芝多糖的方法，包括以下步骤，s1、脱脂：对灵芝子实体进行干燥、粗碎；加入10倍重量的乙醇，所述乙醇的体积分数为80％，在75℃条件下回流提取进行脱脂，得到粗提物。灵芝子实体粗碎为50目。s2、浸润：将所述粗提物进行干燥、破壁，破壁为400目。然后加入5倍重量的水，在50℃下浸泡3h，得到预处理液。s3、酶处理：调节所述预处理液的ph为8，然后加入灵芝子实体质量的8％的复合酶，在40℃下处理3h，然后灭酶，得到提取液。所述灭酶为在95℃下处理10min。所述复合酶包括质量比为5:3:2:1:2:2:1的纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、ɑ-淀粉酶、中性蛋白酶和甘露聚糖酶。所述纤维素酶的酶活单位为10万u/g，半纤维素酶的酶活单位为8万u/g，果胶酶的酶活单位为5万u/g，木聚糖酶的酶活单位为4万u/g，ɑ-淀粉酶的酶活单位为3万u/g，中性蛋白酶的酶活单位为6万u/g和甘露聚糖酶的酶活单位为5万u/g。s4、超声波提取：将所述提取液超声波提取30min，超声波功率为250w，提取温度为40℃，然后离心过滤得上清液i和残渣，离心过滤过程为在6000r/min下离心15min。s5、二次提取：将步骤s4中的残渣进行二次提取，向所述残渣加入5～8倍体积的水，在超高压200mpa、75℃条件下处理40min，然后离心过滤得上清液ii，离心过滤过程为在6000r/min下离心15min。s6、醇沉：合并上清液i和上清液ii得滤液，将所述滤液减压浓缩至原质量的40％，加入95％乙醇，使滤液中乙醇终浓度为7％，静置4h过滤、真空干燥、粉碎，得灵芝多糖。对比例1一种从灵芝中提取灵芝多糖的方法，与实施例1相比，酶处理过程采用采用单一纤维素酶处理。对比例2一种从灵芝中提取灵芝多糖的方法，与实施例1相比，步骤s2中，没有破壁处理。对比例3一种从灵芝中提取灵芝多糖的方法，与实施例1相比，没有二次提取步骤。对比例4一种从灵芝中提取灵芝多糖的方法，与实施例1相比，没有脱脂步骤。分别采用实施例1-3和对比例1-4的方法提取灵芝多糖，并计算得率，结果数据见下表1。表1实施例1-3和对比例1-4数据对比实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2对比例3对比例4多糖得率/％19.2518.1218.568.5410.258.159.56从实施例1-3和对比例1-4可以看出，本发明采用脱脂、破壁处理、酶处理和超声辅助法协同作用，多糖收率较高。实施例1和对比例1-4可以看出脱脂、破壁处理、酶处理和超声辅助法协同作用，共同提高得率，减少任一步骤，都会降低得率。上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。当前第1页12