本发明属于灵芝液体培养基技术领域，具体涉及一种高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基及其制备方法。
背景技术：
灵芝是担子菌纲，多孔菌科，灵芝属，并具有上千年药用价值的药用真菌。灵芝含有丰富的活性成分，以多糖和属三萜类的灵芝酸为主要活性成分。药理研究显示，灵芝多糖具有抗癌、抗肿瘤、免疫调节、抗衰老、抗氧化等作用；灵芝酸可抑制肿瘤细胞、艾滋病毒以及细菌。
目前，市面上所销售的灵芝分为野生灵芝和人工培育灵芝，野生灵芝生于阔叶树的基部或朽木上，有时也生于针叶树上。随着灵芝的药用价值被人们广泛认识，现金深山老林的野生灵芝资源也在不断的减少，虽然一年生的灵芝繁殖力不弱，但多还没有将灵芝孢子喷出，还未成熟就被人们采摘，所以野生灵芝资源现在在逐年锐减。为满足人们对灵芝的大量需求，人们开始采用人工方式培育灵芝。传统的灵芝培养基是采用木屑和一些农作物秸秆，如棉籽壳、麦麸、玉米芯等作为栽培原料，但是这种栽培原料中木屑占据了很大的比重，长久下去会造成严重的树木资源短缺，更重要的是，这些原料中各营养成分不是很明确，也不能明确其所起的作用，进而不能实现原料可控性，最终不能很好的控制其灵芝的生长及品质需求。
虽然现有技术中也慢慢的采用营养成分明确的培养基培养灵芝，但其培养的灵芝所产灵芝多糖和灵芝酸却比较低。
技术实现要素：
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基及其制备方法，可有效解决现有技术中灵芝培养基成分不明确，无法实现原料可控性以及大量使用木材造成树木资源短缺的问题，同时还可提高灵芝多糖和灵芝酸含量。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液中包括以下物质：0.3-0.5gnh4h2po4、0.1-0.15gkh2po4、0.05-0.1gk2hpo4、0.05-0.08gna2hpo4、0.03-0.06gmgso4、0.12-0.16gcacl2、2.2-2.6mgfeso4·7h2o、1.3-1.4mgznso4.7h2o、1-2mgmnso4·h2o、0.15-0.3mgcocl2·6h2o、0.15-0.3mgcuso4·5h2o、0.1-0.3g酵母浸膏、1.5-3g木质素磺酸盐和0.01-0.03mgvb1。
进一步地，一种高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液中包括以下物质：0.4gnh4h2po4、0.12gkh2po4、0.08gk2hpo4、0.06gna2hpo4、0.04gmgso4、0.14gcacl2、2.4mgfeso4·7h2o、1.32mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.2mgcocl2·6h2o、0.2mgcuso4·5h2o、0.2g酵母浸膏、2g木质素磺酸盐和0.02mgvb1。
进一步地，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液通过以下方法制备得到：将46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，然后分别量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混匀，制得200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液。
上述高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液：将46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，然后分别量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混匀，制得；
(2)将除木质素磺酸盐和vb1以外的其他成分加入步骤(1)制备的缓冲溶液中，混匀后过2层纱布，然后向滤液中加入木质素磺酸盐，混匀后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，最后冷却至室温；
(3)然后向步骤(2)所得物质中加入vb1，混匀，制得高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基。
本发明提供的高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基及其制备方法，具有以下有益效果：
(1)本发明选用工业化木质素磺酸盐作为灵芝合成培养基的碳源，与传统培养基中的木屑作为碳源相比，其来源广泛易得，成本低，环境友好，不会造成环境资源的短缺现象。
(2)本发明选用成分明确，可达到对灵芝生长的可控性。
(3)本发明选用缓冲液体系调节培养基的ph值，使灵芝生长条件达到最佳。
(4)采用本发明制备的培养基培养灵芝，其所产灵芝多糖和灵芝酸均较高。
附图说明
图1为灵芝菌丝对碳源的利用程度。
具体实施方式
实施例1
一种高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液中包括以下物质：0.3gnh4h2po4、0.1gkh2po4、0.05gk2hpo4、0.05gna2hpo4、0.03gmgso4、0.12gcacl2、2.2mgfeso4·7h2o、1.3mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.15mgcocl2·6h2o、0.15mgcuso4·5h2o、0.1g酵母浸膏、1.5g木质素磺酸钠和0.01mgvb1。
上述高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液：将46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，然后分别量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混匀，制得；
(2)将除木质素磺酸钠和vb1以外的其他成分加入步骤(1)制备的缓冲溶液中，混匀后过2层纱布，然后向滤液中加入木质素磺酸钠，混匀后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，最后冷却至室温；
(3)然后向步骤(2)所得物质中加入vb1，混匀，制得高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基。
采用上述高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基培育灵芝，其过程为：
将灵芝菌丝接种到pda平板培养基中，于30℃恒温箱中培养7天，然后取培养后的菌种，再将其菌丝接种于pda液体培养基中，在120r/min，30℃条件下培养7天，取菌液2ml，接种于上述200ml高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基中，再置于120r/min，30℃条件下培养30天。
实施例2
一种高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液中包括以下物质：0.5gnh4h2po4、0.15gkh2po4、0.1gk2hpo4、0.08gna2hpo4、0.06gmgso4、0.16gcacl2、2.6mgfeso4·7h2o、1.4mgznso4.7h2o、2mgmnso4·h2o、0.3mgcocl2·6h2o、0.3mgcuso4·5h2o、0.3g酵母浸膏、3g木质素磺酸钠和0.03mgvb1。
上述高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液：将46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，然后分别量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混匀，制得；
(2)将除木质素磺酸钠和vb1以外的其他成分加入步骤(1)制备的缓冲溶液中，混匀后过2层纱布，然后向滤液中加入木质素磺酸钠，混匀后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，最后冷却至室温；
(3)然后向步骤(2)所得物质中加入vb1，混匀，制得高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基。
采用上述高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基培育灵芝，其过程与实施例1相同。
实施例3
一种高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液中包括以下物质：0.4gnh4h2po4、0.12gkh2po4、0.08gk2hpo4、0.06gna2hpo4、0.04gmgso4、0.14gcacl2、2.4mgfeso4·7h2o、1.32mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.2mgcocl2·6h2o、0.2mgcuso4·5h2o、0.2g酵母浸膏、2g木质素磺酸钠和0.02mgvb1。
上述高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液：将46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，然后分别量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混匀，制得；
(2)将除木质素磺酸钠和vb1以外的其他成分加入步骤(1)制备的缓冲溶液中，混匀后过2层纱布，然后向滤液中加入木质素磺酸钠，混匀后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，最后冷却至室温；
(3)然后向步骤(2)所得物质中加入vb1，混匀，制得高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基。
采用上述高产灵芝多糖和灵芝酸的灵芝液体培养基培育灵芝，其过程与实施例1相同。
实施例4
一种灵芝液体培养基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液中包括以下物质：0.4gnh4h2po4、0.12gkh2po4、0.08gk2hpo4、0.06gna2hpo4、0.04gmgso4、0.14gcacl2、2.4mgfeso4·7h2o、1.32mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.2mgcocl2·6h2o、0.2mgcuso4·5h2o、0.2g酵母浸膏、2g木质素硫酸钠和0.02mgvb1。
上述灵芝液体培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液：将46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，然后分别量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混匀，制得；
(2)将除木质素硫酸钠和vb1以外的其他成分加入步骤(1)制备的缓冲溶液中，混匀后过2层纱布，然后向滤液中加入木质素硫酸钠，混匀后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，最后冷却至室温；
(3)然后向步骤(2)所得物质中加入vb1，混匀，制得灵芝液体培养基。
采用上述灵芝液体培养基培育灵芝，其过程与实施例1相同。
实施例5
一种灵芝液体培养基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液中包括以下物质：0.4gnh4h2po4、0.12gkh2po4、0.08gk2hpo4、0.06gna2hpo4、0.04gmgso4、0.14gcacl2、2.4mgfeso4·7h2o、1.32mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.2mgcocl2·6h2o、0.2mgcuso4·5h2o、0.2g酵母浸膏、2g粉状纤维素(cellulosefibers)和0.02mgvb1。
上述灵芝液体培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液：将46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，然后分别量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混匀，制得；
(2)将除纤维素和vb1以外的其他成分加入步骤(1)制备的缓冲溶液中，混匀后过2层纱布，然后向滤液中加入纤维素，混匀后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，最后冷却至室温；
(3)然后向步骤(2)所得物质中加入vb1，混匀，制得灵芝液体培养基。
采用上述灵芝液体培养基培育灵芝，其过程与实施例1相同。
实施例6
一种灵芝液体培养基，200ml，ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液中包括以下物质：0.4gnh4h2po4、0.12gkh2po4、0.08gk2hpo4、0.06gna2hpo4、0.04gmgso4、0.14gcacl2、2.4mgfeso4·7h2o、1.32mgznso4.7h2o、1mgmnso4·h2o、0.2mgcocl2·6h2o、0.2mgcuso4·5h2o、0.2g酵母浸膏、1g木质素磺酸钠、1g木质素硫酸钠和0.02mgvb1。
上述灵芝液体培养基的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液：将46.94gna2hpo4·12h2o和9.078gkh2po4分别溶于蒸馏水中，并定容至1000ml，然后分别量取10mlna2hpo4·12h2o和190mlkh2po4，混匀，制得；
(2)将除木质素磺酸钠、木质素硫酸钠和vb1以外的其他成分加入步骤(1)制备的缓冲溶液中，混匀后过2层纱布，然后向滤液中加入木质素磺酸钠、木质素硫酸钠，混匀后置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，最后冷却至室温；
(3)然后向步骤(2)所得物质中加入vb1，混匀，制得灵芝液体培养基。
采用上述灵芝液体培养基培育灵芝，其过程与实施例1相同。
实验例
1、测定灵芝菌丝对碳源的利用程度
分别将实施例3-6培养灵芝的锥形瓶与含50ml浓度为0.02mol/l的ba(oh)2溶液的锥形瓶通过橡皮胶管连接，两锥形瓶均用封口膜密封，每两天取一次样，同时，每两天向培养灵芝的锥形瓶中注入300ml经钠石灰过滤过的空气，然后用1/44mol/l的草酸溶液滴定ba(oh)2溶液，测得co2产生量，进而判断灵芝菌丝对碳源的利用程度，测定结果见图1。
其中，cellulose为纤维素，sl为木质素磺酸钠，kl为木质素硫酸钠，blend为含有木质素磺酸钠和木质素硫酸钠。
由图1可知，灵芝菌丝生长以木质素磺酸钠为碳源时，co2产生量最多，说明灵芝菌丝在相同培养条件下，对木质素磺酸盐利用的最好。
2、灵芝多糖含量的测定
将实施例3-6培养30天后的培养液分别置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，然后冷却至室温，接着抽滤，除去菌丝，再用培养基中所用的ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液定容至200ml。
采用苯酚-浓硫酸法测定葡萄糖含量，即取定容后的培养液0.2ml，用蒸馏水定容至2ml，再分别添加5％的苯酚溶液1.5ml，浓硫酸6ml，混匀，放置5min，然后90℃水浴10min，取出立即放入冰水中冷却至室温，以蒸馏水代替培养液作为空白对照，在490nm波长下测定吸光值，制作葡萄糖标准曲线，计算灵芝多糖含量。
实施例3-6所得灵芝多糖浓度分别为0.710g/l、0.623g/l、0.573g/l和0.661g/l。说明采用实施例3中的培养基培养灵芝，其灵芝多糖含量明显比实施例4-6中的培养基培养的灵芝产的灵芝多糖含量要高。
现有培养基成分及含量：葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、kh2po41g、mgso40.5g、vb10.01g，将各成分加入1000ml蒸馏水中，混匀，置于121℃灭菌20min，制得灵芝发酵培养基，采用该培养基培养灵芝，其过程与实施例3相同。
采用上述方法测现有培养基培养灵芝后产的灵芝多糖含量，其含量为0.587g/l。
实施例3与现有培养基培养的灵芝，所产灵芝多糖含量进行比较，进一步说明了实施例3可有效提高灵芝产灵芝多糖。
3、灵芝酸含量的测定
将实施例3-6培养30天后的培养液分别置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min，然后冷却至室温，接着抽滤，除去菌丝，再用培养基中所用的ph5.8的na2hpo4·12h2o-kh2po4缓冲溶液定容至200ml。
取定容后的培养液0.2ml，用蒸馏水定容至2ml，再分别添加5％香草醛-冰乙酸溶液0.4ml，高氯酸1.6ml，迅速混匀，70℃水浴15min，取出后立即放入冰水浴中冷却至室温，再加入8ml乙酸乙酯，混匀，于560nm处测吸光度，制作灵芝酸标准曲线，计算灵芝酸含量。
实施例3-6所得灵芝酸含量分别为0.578g/l、0.417g/l、0.356g/l和0.429g/l。
说明采用实施例3中的培养基培养灵芝，其灵芝酸含量明显比实施例4-6中的培养基培养的灵芝产的灵芝酸含量要高。
现有培养基成分及含量：葡萄糖35g、蛋白胨3.5g、kh2po41g、mgso40.5g、vb10.01g，将各成分加入1000ml蒸馏水中，混匀，置于121℃灭菌20min，制得灵芝发酵培养基，采用该培养基培养灵芝，其过程与实施例3相同。
采用上述方法测现有培养基培养灵芝后产的灵芝酸含量，其含量为0.345g/l。
实施例3与现有培养基培养的灵芝，所产灵芝酸含量进行比较，进一步说明了实施例3可有效提高灵芝产灵芝酸。