一种灵芝多糖及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种灵芝多糖及其制备方法，该灵芝多糖的制备方法包括：灵芝子实体进行水提，得到提取残渣；提取残渣进行超微粉碎，得到超细粉；超细粉经过水提醇沉，收集到的沉淀即为灵芝多糖。本发明制备得到的灵芝多糖β-葡聚糖含量达到50％以上，具有明显的激活巨噬细胞的活性。
【专利说明】一种灵芝多糖及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药用真菌深加工领域，具体地说涉及一种灵芝多糖及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 灵芝（Ganoderma lucidum)是我国最著名的药用真菌，因其具有抗肿瘤、提高免 疫、延缓衰老等作用，已作为功能食品和药品得到广泛应用。灵芝多糖是灵芝的主要活性成 分之一，药理活性多样，尤其在提高机体免疫功能、抗肿瘤等方面效果显著。随着灵芝提取 物在保健品和医药领域的应用不断扩大，灵芝子实体的提取量剧增，导致剩余大量的提取 残渣，废弃不用将对环境产生污染，并且造成很大的资源浪费。
[0003] β_葡聚糖是真菌细胞壁上的主要成分之一，其结构主链以β_(1，3)糖苷键连接 为主，被认为是主要的活性多糖。大量研究证明该类多糖能够激活免疫细胞、调节细胞因子 分泌，参与宿主特异性免疫与非特异性免疫，从而提高机体免疫功能。近些年灵芝中分离获 得的杂多糖较多，对其β_葡聚糖的研究较少。且β-1，3_葡聚糖的提取多以碱提为主，后 续处理工艺复杂。
【发明内容】
[0004] 本发明首先提供了一种灵芝多糖的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0005] 灵芝子实体进行水提，得到提取残渣；
[0006] 提取残渣进行超微粉碎，得到超细粉；
[0007] 超细粉经过水提醇沉，收集到的沉淀即为灵芝多糖。
[0008] 具体的说，本发明的一种灵芝多糖的制备方法，包括如下步骤：
[0009] 提取残渣：将灵芝子实体粉碎成颗粒，加入10-15倍重量的水，常温浸泡30-60分 钟，加热至沸腾，保持60-120分钟，过滤；
[0010] 超细粉碎：将提取残渣干燥后，用超微粉碎震动磨机粉碎30-40分钟，过200目筛， 收集超细粉；
[0011] 水提醇沉：将超细粉，加入15-20倍重量的蒸馏水，常温浸泡30-60分钟，加热至沸 腾，保持60-120分钟，离心；将提取液，减压浓缩至料液比为1:1 一 1:2 (质量/体积，单位： 千克/升），加入无水乙醇，至乙醇重量百分比含量达到40% - 60%，室温静置3 - 5小时， 离心去除醇沉上清，收集沉淀，冷冻干燥后即为所需的灵芝多糖。
[0012] 本发明还提供了一种灵芝多糖，其是利用上述灵芝多糖的制备方法制备得到的。
[0013] 本发明得到的灵芝多糖，分子量为18万-240万道尔顿，β-葡聚糖含量达到50% 以上，具有明显的激活巨噬细胞的活性。
[0014] 本发明的灵芝多糖的制备方法是一种简便、高效、无污染、多糖含量高的适合规模 化生产的方法，通过上述制备方法可获得质量稳定的灵芝多糖，得率达到0.9%，多糖含量 超过80%，其中β-葡聚糖含量达50%以上。
[0015] 说明书附图
[0016] 图1灵芝多糖体外刺激巨噬细胞释放NO的活性测定结果
[0017] 图2HPLC分析灵芝多糖的分子量分布图谱
【具体实施方式】：
[0018] 赤灵芝子实体：浙江龙泉基地栽培获得的沪农灵芝1号子实体
[0019] 超微粉碎震动磨机：山东三清不锈钢设备有限公司SQW系列
[0020] 实施例1 :
[0021] 1、灵芝提取残渣的获得：以赤灵芝子实体为原料，粉碎成粗粒，称取200g，加入3L 水，常温浸泡30分钟，加热至沸腾，保持120分钟，过滤。滤渣重复上述步骤，再提取1次， 过滤后，所得残渣在60°C鼓风干燥器中烘干。
[0022] 2、灵芝残渣的超微粉碎：将干燥后的灵芝提取残渣采用超微粉碎震动磨机粉碎 30min，过200目筛，收集超细粉。
[0023] 3、灵芝多糖的提取分离：称取上述灵芝残渣超细粉150g，加入2L蒸馏水，常温60 分钟，加热至沸腾，保持微沸60分钟，离心。沉淀重复提取1次，离心后，收集合并提取液， 减压浓缩至料液比为1:1 (质量/体积，单位：千克/升），缓慢加入无水乙醇，边加边搅拌， 至乙醇含量达到50%，室温静置4小时，离心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0024] 4、干燥：沉淀加水溶解，挥干乙醇后置于_20°C冰箱中冻存2h，然后再放到-80°C 冰箱中冷冻3h，最后放入冷冻干燥机中冻干，即获得所需的灵芝多糖。
[0025] 多糖含量的检测：
[0026] 用苯酚一硫酸法测定，精密称取本品10mg置100ml容量瓶中，加水约80ml，加热助 溶后冷却至室温，在l〇〇ml容量瓶中定容。精密吸取样品1. 0ml，置15ml试管中，分别加入 苯酚、硫酸试剂，充分反应后在490nm处测定吸光度值，以葡聚糖为标准品计算样品的糖含 量。
[0027] β -葡聚糖含量测定：参照Megazyme公司的酵母和蘑燕β -葡聚糖检测试剂盒中 的方法对多糖样品中β_葡聚糖含量进行测定。
[0028] 制备所得灵芝多糖的得率为0.91%，多糖含量为82. 52%，β-葡聚糖含量为 53. 21%。实施例2 :
[0029] 1、灵芝提取残渣的获得：以赤灵芝子实体为原料，粉碎成粗粒，称取500g，加入6L 水，常温浸泡40分钟，加热至沸腾，保持微沸120分钟，过滤。滤渣重复上述步骤，再提取2 次，过滤后，所得残渣在60°C鼓风干燥器中烘干。
[0030] 2、灵芝残渣的超微粉碎：将干燥后的灵芝提取残渣采用超微粉碎震动磨机粉碎 40min，过200目筛，收集超细粉。
[0031] 3、灵芝多糖的提取分离：称取上述灵芝残渣超细粉400g，加入6L蒸馏水，常温60 分钟，加热至沸腾，保持微沸120分钟，离心。沉淀重复提取2次，离心后，收集合并提取液， 减压浓缩至料液比为1:1. 5 (质量/体积，单位：千克/升），缓慢加入无水乙醇，边加边搅 拌，至乙醇含量达到40%，室温静置4小时，离心去除醇沉上清，收集沉淀。
[0032] 4、干燥：沉淀加水溶解，挥干乙醇后置于_20°C冰箱中冻存2h，然后再放到-80°C 冰箱中冷冻3h，最后放入冷冻干燥机中冻干，即获得所需的灵芝多糖。
[0033] 制备所得灵芝多糖的得率为0.94%，多糖含量为85. 31%，β-葡聚糖含量为 54. 51%。实施例3 :
[0034] 灵芝多糖体外刺激巨噬细胞释放NO的活性测定：
[0035] 1、样品准备：精确称取实施例1和实施例2制备得到的灵芝多糖于灭过菌的 eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL的样品液。充分溶解后以15000r/min 离心30min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成2mg/mL、 0· 5mg/mL、0. lmg/mL 待用。
[0036] 2、细胞培养：取对数生长期的RAW264. 7巨噬细胞株，用DMEM完全培养基在37°C、 含5% C02条件下传代培养，用0. 05%胰酶或5% EDTA溶液消化，混悬液1000rpm/min离心 3min后收集细胞，计数备用。
[0037] 3、试剂配制及标准曲线绘制
[0038] Griess试剂：在烧杯中加入6. 25ml H3P03,加入蒸馈水250ml，分别加入2. 5g的 sulfanilamide 和 0· 25g 的 naphthylethyylene-diamine dihydrochloride 用磁力揽拌器 至全部溶解，棕色试剂瓶4 °C冰箱保存。
[0039] 标准曲线绘制：配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、5、10、15、20、25、 30、35、4(^11共九个 ；取丨0阼1^于96孔板孔，加入5(^1^1^88试剂，测定54311111吸光值， 标准曲线每个浓度3个重复，根据吸光值绘制标准曲线。
[0040] 4、样品刺激巨噬细胞释放N0量的测定：收集RAW264. 7细胞，用无色 1?^11640(10%胎牛血清+1%抗生素液体）培养基将细胞稀释至5\105/1^，加入96孔板， 每孔加入180 μ L，然后再加入20μ?待测样品，阳性对照为LPS(1 μ g/mL)，37°C培养48小 时。取10().uL上清于96孔板孔，加入50 μ 1 Griess试剂，室温孵浴10分钟，测定543nm吸 光值。根据标准曲线计算细胞N0的释放量。
[0041] 结果见附图1，由此结果可以看出，实施例1和实施例2所得的灵芝多糖对 RAW264. 7巨噬细胞株释放N0有明显的促进作用，可明显增强巨噬细胞的吞噬杀伤能力，从 而增强机体的抗肿瘤能力。
[0042] 实施例4 :
[0043] 灵芝多糖的分子量分析
[0044] 1、试验方法：高效液相色谱联用多角度激光散射仪分析法（HPSEC-MALLS)
[0045] 2、样品前处理：精密称取实施例1的多糖5mg，加入lmL磷酸盐缓冲液，使其充分 溶解，样品液12000rpm离心20min，取上清液，进样分析。
[0046] 3、分析条件：美国Waters HPLC高效液相色谱仪（Waters2695);色谱柱为 TSK-GEL系列G6000PWXL凝胶柱，规格为7. 8mmX300mm(T0S0H，日本）；柱温：35°C;流动相： 0.15111〇1/1似勵3和0.05111〇1/1似4?0 4，&!1=7,0.02%叠氮钠）；流速：0.511117111丨11 ;进样 量：100 μ L ;检测器：2414示差折光检测器，8角度激光散射仪（Wyatt，HELE0S8)，激光检测 器光源波长选用623. 8nm。多糖在溶液中的折光指数增量（dn/dc)按照0. 146mL/g计算。
[0047] 4、数据处理：使用 Astra (version6. 1. 1，Wyatt Technology, Santa Barbara, CA) 数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算分子量。
[0048] 分子量分析结果见图2,通过计算得知该多糖的主要分子量分布范围在18万到 240万道尔顿。
【权利要求】
1. 一种灵芝多糖的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤： 灵芝子实体进行水提，得到提取残渣； 提取残渣进行超微粉碎，得到超细粉； 超细粉经过水提醇沉，收集到的沉淀即为灵芝多糖。
2. 根据权利要求1所述的一种灵芝多糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤： 提取残渣：将灵芝子实体粉碎成颗粒，加入10-15倍重量的水，常温浸泡30-60分钟，力口 热至沸腾，保持60-120分钟，过滤； 超细粉碎：将提取残渣干燥后，用超微粉碎震动磨机粉碎30-40分钟，过200目筛，收集 超细粉； 水提醇沉：将超细粉，加入15-20倍重量的蒸馏水，常温浸泡30-60分钟，加热至沸腾， 保持60-120分钟，离心；将提取液，减压浓缩至料液比为1:1 一 1:2 (质量/体积，单位：千 克/升），加入无水乙醇，至乙醇重量百分比含量达到40% - 60%，室温静置3 - 5小时，尚 心去除醇沉上清，收集沉淀，冷冻干燥后即为所需的灵芝多糖。
3. -种灵芝多糖，其是由权利要求1或2所述方法制备得到的。
【文档编号】A61P35/00GK104059162SQ201410293682
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2014年6月25日 优先权日:2014年6月25日
【发明者】刘艳芳, 唐庆九, 周帅, 张劲松, 杨焱, 吴迪, 张忠, 颜梦秋 申请人:上海市农业科学院