一种灵芝多糖绿色提取新工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种灵芝多糖的绿色提取新工艺，具体的说是一种双膜法提取灵芝多糖的方法，该方法是将灵芝发酵液采用特定的条件通过微滤膜和超滤膜处理分离得到灵芝多糖。本发明改变了传统灵芝多糖“水提醇沉”的提取方式，提高了灵芝多糖的纯化效果，降低了生产中乙醇用量，增加了经济效益；同时，该方法可以减少滤液废水的排放，显著增加了社会效益。
【专利说明】一种灵芝多糖绿色提取新工艺
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种提取真菌胞外多糖的方法，更确切地说是一种基于膜技术提取灵芝多糖的新方法。
【背景技术】
[0002]灵芝多糖是由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、鼠李糖、半乳糖等其他单糖组成的多聚糖，是运用现代生物工程技术从灵芝发酵滤液中提取精制的具有生理活性的蛋白多糖物质，是灵芝的最有效成分之一。实验证明，灵芝多糖有多方面的药理活性:能提高机体免疫力，加速血液微循环，提高血液供氧能力，降低机体静止状态下的无效耗氧量，消除体内自由基，提高机体细胞膜的封闭度，抗放射，提高肝脏、骨髓、血液合成DNA，RNA，蛋白质的能力，延长寿命等。灵芝的多种药理活性大多和灵芝多糖有关。
[0003]传统的灵芝多糖生产是将分离后的灵芝发酵滤液浓缩到一定倍数后进行多次酒精醇沉，去除其中的单糖，提高多糖含量。但是在醇沉过程中由于单糖往往伴随着多糖同时被醇沉下来，单糖去除率较低，因此需要多次醇沉,耗费酒精和人工较多，生产成本较高；同时，传统的热浓缩方式，耗用大量的蒸汽，对生产成本和产品质量有较大影响。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了解决上述灵芝多糖分离纯化方法的不足，从而设计了一种基于膜技术来分离纯化灵芝多糖的绿色新工艺，该工艺既提高了灵芝多糖的纯化效果，增加了经济效益；又减少了废水的排放，增加了社会效益。
[0005]为了实现上述目的，本发明主要按照下述步骤进行: [0006]一种双膜法提取灵芝多糖的方法，该方法包括下述步骤:
[0007]I)将灵芝发酵液通过微滤膜，得到微滤透析液和菌丝体，收集微滤透析液；其中，微滤膜的孔径在0.05~I μ m，操作温度为10~70°C，工作压力:进压为2~8bar，出压为
O~5bar ；
[0008]2)将步骤I)中的微滤透析液通过超滤膜，得到超滤透析液和浓缩液，收集浓缩液；其中，超滤选择截留分子量为800~1000Da的超滤膜，操作温度为38~50°C，工作压力:进压为I~8bar,出压为0.5~3bar ；
[0009]3)将步骤2)中超滤浓缩液在低温条件下浓缩得到浓缩浆；浓缩浆再进一步低温真空烘干至干燥物水分含量为3~8%，即得。所得干燥物即为灵芝多糖。
[0010]优选将步骤2)中超滤浓缩液在40~80°C条件下浓缩到菌丝体含量为30~70%得到浓缩浆；再将所得的浓缩浆在60~75°C，真空度-0.0SMpa以上的条件下进行烘干，烘干至干燥物水分含量为3~8%。
[0011]优选微滤采用孔径为0.05~0.5μηι的微滤膜,最优选微滤采用孔径为0.05 μ m的微滤膜，微滤采用50~60°C的操作 温度,进压为2~4bar,出压为I~2bar。优选超滤采用截留分子量为900~1000Da的超滤膜，超滤采用40~45°C的操作温度，进压为6~8bar,出压为I~3bar。
[0012]本发明微滤所用膜为陶瓷膜或有机膜。超滤所用膜材料可选用PAN、PVDF、PC、PES、PP、PE复合膜中的一种。
[0013]灵芝发酵液提取的灵芝多糖因其是生物活性产品，对温度较为敏感，若温度超过600C，每升高5°C，灵芝多糖指标下降10%。在不超过60°C范围内，分别选取了 20、30、40、50、600C 5个温度进行膜分离的操作，结果发现，在这5个温度操作所得到的灵芝多糖其理化指标相差不大，但是不同温度下膜通量及维持该温度所产生的能耗大不相同，低温下膜通量较小，而且维持低温所需冷却水较大，温度升高，膜通量增加，操作过程不需要冷却水或需要极少的冷却水。综上，优选膜过滤温度范围40~60°C，其中优选微滤膜50~60°C，超滤膜 40 ~45°C。
[0014]本发明采用灵芝发酵液通过微滤膜，得到发酵液的微滤透析液和菌丝体，菌丝体可直接低温干燥粉碎制成发酵灵芝菌粉；微滤透析液通过超滤膜，得到超滤透析液和浓缩液，超滤透析液可作为发酵配料水；经双膜处理后可显著降低生产成本。
[0015]与现有技术比较本发明生产方法为灵芝多糖分离提取提供了一种新的方法，该方法具有以下几个突出的优点:
[0016]1、微滤除菌丝体提高菌丝体得率，操作过程中无机械力破坏，极大程度保存了菌丝体内腺苷、甘露醇成分，配套成本低，无须板框、离心机等装置；
[0017]2、超滤I旲的过滤精度闻，单糖去除率闻，提闻灵芝多糖广品质量；同时，超滤透析液中含有单糖，可作为发酵配料用水，减少了污水处理量；
[0018]3、用超滤膜进行预浓缩，实现冷浓缩，减少蒸汽用量，降低生产成本；
[0019]4、本发明生产过程无酒精消耗，极大的降低了生产成本和工时消耗，同时，本发明实现清洁自动化生产，极大改善了工作环境。
[0020]5、近年来膜技术在国内外不断得到广泛的推广，膜成本也在不断下降，将膜分离纯化技术应用到灵芝多糖的提取过程中将产生显著的经济效益。应用膜技术不仅能提高产品质量，还能减少废水的排放，保护环境，实现自动化控制和清洁生产，降低生产成本，还能改善工人的工作环境，提高工作效率。
[0021]6、采用本发明方法得到的多糖得率高达4.24g/L，多糖含量28.41%，单糖2.14%。多糖测定方法苯酚-硫酸法，单糖测定方法DNS法测定。与传统水提法相比，灵芝多糖的提取率提高了至少1.0个百分点，多糖含量提高了 10个百分点以上，单糖含量降低了至少3个百分点，且提取时间缩短3倍以上，成本大幅度降低；提取全过程避免了高温加热，从而减少了高温对多糖的破坏；所用仪器设备操作方便，自动化程度较高，便于大规模生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为双膜法提取灵芝多糖的工艺流程图。
【具体实施方式】
[0023]以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。
[0024]实施例1[0025]本发明灵芝多糖提取方法按下述步骤进行:
[0026]1、灵芝发酵液来源:由中国农业微生物菌种保藏管理中心提供并鉴定，Ganodermalucidium，保藏编号ACCC50059。将菌株转接到斜面培养基26~28°C常规培养5_6天，得活化的灵芝菌株；将活化好的灵芝菌株接种于种子培养基，其中种子培养基组成为黄豆饼粉2.0%，蔗糖4.0%，酵母粉2.0%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.09%,消泡剂0.1%，用水配制，pH值自然，26~28°C振荡培养2-3天得灵芝一级种子液；将一级种子液接入二级种子培养基，其中二级种子培养基组成为黄豆饼粉3.0%，蔗糖3.0%，酵母粉2.0%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.09%,消泡剂0.1%，用水配制，pH值自然，26~28°C培养2天左右，接种量1%，通气
I: 0.4~0.8vvm ;将二级种子培养基接入发酵培养基，其中发酵培养基组成为黄豆饼粉
4.0%，蔗糖2.0%，酵母粉2.0%，磷酸二氢钾0.4%，硫酸镁0.09%,消泡剂0.1%，用水配制，pH值自然，26~28°C培养80-90h，接种量3%-5%，通气1: 0.3~0.5vvm，发酵结束即为灵芝发酵液。
[0027]2、微滤过滤:将上述灵芝发酵液7500Kg (发酵液菌丝体含量为3.7%)通过微滤过滤，得到灵芝的微滤透析液6370Kg和1130Kg的湿菌丝体(含水量为76%)，透析液的透光率为83%，湿菌丝体可直接低温干燥粉碎制得发酵灵芝菌粉。微滤过滤所用的膜材料是孔径为50nm的陶瓷膜，具体工艺条件是:操作温度为50~60°C，进压为3.0bar,出压为1.0bar,压力差为2.0bar。
[0028]3、超滤过滤:将步骤I所得的微滤透析液6370Kg通过超滤过滤得超滤透析液5640Kg和730Kg超滤浓缩液，透析液的透光率为95 %，5640Kg透析液可作为发酵配料用水。超滤所用的膜材料是截留分子量为1000Da的PVDF的超滤膜，工艺条件是:操作温度为40°C,进压为7bar,出压为2b ar,压力差为5bar。
[0029]4、低温浓缩:将步骤2超滤所得的超滤浓缩液730Kg在真空度为0.09MPa，浓缩温度为60°C下继续将灵芝浓缩液浓缩至固形物含量59%的灵芝多糖浓缩浆55.6Kg。
[0030]5、低温真空干燥:将步骤3得到的55.6kg灵芝多糖浓缩浆进入真空干燥箱进行烘干，得到31.3kg灵芝多糖粗品(水分含量4.2%)。具体工艺条件是:干燥温度75~85°C，真空度为-0.085Mpa，干燥时间40h。该工艺条件下得到灵芝多糖含量28.41%，单糖含量
2.14%。
[0031]实施例2
[0032]本发明灵芝多糖提取方法，按下述步骤进行:
[0033]1、微滤过滤:将实施例1中的灵芝发酵液7500Kg (发酵液菌丝体含量为3.7%)通过微滤过滤，得到灵芝的微滤透析液6372Kg和1128Kg的湿菌丝体(含水量为76.1%)，透析液的透光率为84%，湿菌丝体可直接低温干燥粉碎制得发酵灵芝菌粉。微滤过滤所用的膜材料是孔径为IOOnm的陶瓷膜，具体工艺条件是:操作温度为50~60°C，进压2.0bar,出压
1.0bar,压力差为 1.0bar0
[0034]2、超滤过滤:将步骤I所得的微滤透析液6372Kg通过超滤过滤得超滤透析液5655Kg和717Kg超滤浓缩液，透析液的透光率为96%，5655Kg透析液可作为发酵配料用水。超滤所用的膜材料是截留分子量为SOODa的PAN的超滤膜，工艺条件是:操作温度为42°C，进压为6.5bar,出压为2.0bar,压力差为4.5bar。
[0035]3、低温浓缩:将步骤2超滤所得的超滤浓缩液717Kg在真空度为0.09MPa,浓缩温度为60°C下继续将灵芝多糖浓缩至固形物含量61%的灵芝多糖浓缩浆53.8Kg。
[0036]4、低温真空干燥:将步骤3得到的53.8kg灵芝多糖浓缩浆进入真空干燥箱进行烘干，得到31.8kg灵芝多糖粗品(水分含量3%)。具体工艺条件是:干燥温度75~85°C，真空度为-0.085Mpa，干燥时间42h。该工艺条件下得到灵芝多糖含量28.35%，单糖含量2.85%。
[0037]实施例3
[0038]本发明灵芝多糖提取方法，按下述步骤进行:
[0039]1、微滤过滤:将灵芝发酵后的7500Kg发酵液(发酵液菌丝体含量为3.7%)通过微滤过滤，得到灵芝的微滤透析液6374Kg和1126Kg的湿菌丝体(含水量为77%)，透析液的透光率为80%，湿菌丝体可直接低温干燥粉碎制得发酵灵芝菌粉。微滤过滤所用的膜材料是孔径为500nm的陶瓷膜，具体工艺条件是:操作温度为50~60°C，进压2.3bar，出压
0.9bar,压力差为 1.4bar。
[0040]2、超滤过滤:将步骤I所得的微滤透析液6374Kg通过超滤过滤得超滤透析液565 IKg和723Kg超滤浓缩液，透析液的透光率为94 %，565 IKg透析液可作为发酵配料用水。超滤所用的膜材料是截留分子量为900Da的PP的超滤膜，工艺条件是:操作温度为45°C，进压为6.0bar,出压为1.8bar,压力差为4.2bar。
[0041]3、低温浓缩:将步骤2超滤所得的超滤浓缩液723Kg在真空度为0.09MPa,浓缩温度为60°C下继续将灵芝多糖浓缩至菌丝体含量56%的灵芝多糖浓缩浆58.5Kg。
[0042]4、低温真空干燥:将步骤3得到`的58.5kg灵芝多糖浓缩浆进入真空干燥箱进行烘干，得到30.9kg灵芝多糖粗品(水分含量3.3%)。具体工艺条件是:干燥温度75~85°C，真空度为-0.085Mpa，干燥时间38h。该工艺条件下得到灵芝多糖含量28.05%，单糖含量
2.97%。
【权利要求】
1.一种双膜法提取灵芝多糖的方法，其特征是该方法包括下述步骤: 1)将灵芝发酵液通过微滤膜，得到微滤透析液和菌丝体，收集微滤透析液；其中，微滤膜的孔径在0.05~I μ m，操作温度为10~70°C，工作压力:进压为2~8bar，出压为O~5bar ； 2)将步骤I)中的微滤透析液通过超滤膜，得到超滤透析液和浓缩液，收集浓缩液；其中，超滤选择截留分子量为800~1000Da的超滤膜，操作温度为38~50°C，工作压力:进压为I~8bar,出压为0.5~3bar ； 3)将步骤2)中超滤浓缩液在低温条件下浓缩得到浓缩浆；浓缩浆再进一步低温真空烘干至干燥物水分含量为3~8%，即得。
2.根据权利要求1所述的双膜法提取灵芝多糖的方法，其特征是所述步骤I)中采用的微滤膜的孔径为0.05~0.5 μ m。
3.根据权利要求1所述的双膜法提取灵芝多糖的方法，其特征是所述步骤I)中微滤采用的操作温度为50~60°C，工作压力:进压为2~4bar，出压为I~2bar。
4.根据权利要求1所述的双膜法提取灵芝多糖的方法，其特征是所述步骤2)中超滤膜选择截留分子量为900~1000Da的超滤膜。
5.根据权利要求1所述的双膜法提取灵芝多糖的方法，其特征是所述步骤2)中超滤膜过滤米用的操作温度为40~45°C,工作压力:进压为6~8bar,出压为I~3bar。
6.根据权利要求1所述的双膜法提取灵芝多糖的方法，其特征是所述步骤I)中微滤所用膜为陶瓷膜或有机膜。`
7.根据权利要求1所述的双膜法提取灵芝多糖的方法，其特征是所述步骤2)中超滤所用膜材料选用PAN、PVDF, PC、PES, PP、PE复合膜中的一种。
8.根据权利要求1所述的双膜法提取灵芝多糖的方法，其特征是所述步骤3)中将步骤2)中超滤浓缩液在40~80°C条件下浓缩到菌丝体含量为30~70%得到浓缩浆。
9.根据权利要求1所述的双膜法提取灵芝多糖的方法，其特征是所述步骤3)中所得的浓缩浆在60~85°C，真空度-0.0SMpa以上的条件下进行烘干，烘干至干燥物水分含量为3~8%,即得。
【文档编号】C08B37/00GK103509130SQ201310439842
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】徐玲, 王文风, 张瑞华 申请人:江苏神华药业有限公司