等离子体处理灵芝孢子以提高三萜和多糖释放量的方法与流程

本发明涉及保健食品处理制备技术，尤其涉及一种等离子体处理灵芝孢子以提高三萜和多糖释放量的方法。

背景技术：

灵芝是一种食药两用的真菌，具有很高的药用价值，其灵芝孢子粉的药用和商业价值尤其受到关注。灵芝孢子是灵芝子实体成熟后产生并弹射的生殖细胞，其中富含有高含量的三萜化合物及较高含量的灵芝多糖类，是孢子粉具有药用价值的核心。然而，灵芝孢子被坚硬的几丁质和纤维素构成的双层孢子壁外壳包被，严重阻碍了其中活性成分的释放。在正常情况下，人体消化道中的环境无法将灵芝孢子的外被消化掉，致使其活性成分无法释放出来为人体利用。因此，需要对孢子进行破壁处理。

对此，目前比较常见的灵芝孢子粉破壁方法包括物理机械破壁法、生物酶解法、化学破壁法。但是，上述方法存在一定问题：化学破壁法存在添加化学物质残存，安全性存疑，目前使用较少；生物酶解法存在破壁率低等问题；常用的机械破壁法存在铅、砷、汞、铬、镍等重金属残留等问题。除此之外，灵芝孢子的崩解也导致了其有效成分可能会挥发到空间中，沾染到包装上，造成一定的损失。

等离子体(plasma)是由电离后产生的正负离子组成的气体状物质，其主要作用包括清洁、蚀刻和改性等方面。等离子体作用于灵芝孢子粉，可以起到灭菌和表面蚀刻等作用，一方面抑制孢子粉中微生物的增殖，提高了使用的安全性，另一方面也在其表面起到了蚀刻效果，常温下的处理过程增加了其中活性成分灵芝三萜和灵芝多糖的释放，但又保证孢子外壳的完整性，减少了有效成分的损失，使其成分缓慢释放出来，并提高了机体的利用效率。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种稳定高效的等离子体处理灵芝孢子以提高三萜和多糖释放量的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种等离子体处理灵芝孢子以提高三萜和多糖释放量的方法，包括如下步骤：

(1)灵芝孢子粉的预处理；

(2)等离子体放电处理过程；

(3)处理后灵芝孢子粉中灵芝三萜释放量对比检测；

(4)处理后灵芝孢子粉中灵芝多糖释放量对比检测。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中灵芝孢子粉的预处理方法为：收集优良菌种的灵芝孢子，利用无菌水清洗；2000-5000rpm离心后，留取沉淀的灵芝孢子。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中进行等离子体放电处理前，对步骤(1)所得的灵芝孢子进行分散处理。

作为本发明的优选方式之一，所述分散处理具体方法为：将步骤(1)所得的灵芝孢子注入玻璃平皿表面，用灭菌后的玻璃涂棒在表面涂布均匀，保证玻璃平皿内液体厚度不超过1mm；超净台中完全风干后，用灭菌后的玻璃涂棒将玻璃平皿中表面不平的位置涂抹平整。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(2)中等离子体放电处理过程的进行采用等离子体放电装置进行，具体方法为：采用低气压介质阻挡放电，处理时，将步骤(1)所得的灵芝孢子平铺于等离子体放电装置的无菌玻璃平皿中，置于反应腔室内，反应腔室通抽气泵抽气而保持2000pa以下的气压，同时控制通入放电气体作为击穿气体，放电电压为1.5-2kv，在200-600瓦功率范围条件下，处理5-10min。

作为本发明的优选方式之一，所述放电气体具体为空气、氮气、氦气和氩气中的一种。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(3)中灵芝三萜释放量对比检测过程具体采用高氯酸-香草醛法测定。

作为本发明的优选方式之一，所述高氯酸-香草醛法测定灵芝孢子中灵芝三萜释放量对比检测的具体方法为：

(1)齐墩果酸测定应用液的配制：取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；

(2)标准曲线的制定：量取齐墩果酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，分别置于具塞试管中，挥干，放冷，加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，在65-75℃水浴中加热12-18分钟，立即置冰浴中冷却4-6分钟，取出，加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在546nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；

(3)供试品溶液的制备：取本品粉末0.01g，置具塞锥形瓶中，加乙醇2ml，超声处理25-35分钟，量取供试品溶液0.2ml，置具塞试管中，置于通风橱中，放冷，加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，在65-75℃水浴中加热12-18分钟，立即置冰浴中冷却4-6分钟，取出，加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在546nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，根据上述制备的标准曲线计算，即得。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)中灵芝多糖释放量对比检测过程具体采用硫酸-蒽酮法。

作为本发明的优选方式之一，所述硫酸-蒽酮法测定灵芝孢子中灵芝多糖释放量对比检测的具体方法为：

(1)对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品，加水制成每1ml含0.12mg的溶液，即得；

(2)标准曲线的制备：量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分别置于具塞试管中，各加水至2.0ml，迅速加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加硫酸40ml使之溶解，摇匀)6ml，立即摇匀，放置12-18分钟后，立即置冰浴中冷却12-18分钟，取出，以相应的试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

(3)供试品溶液的制备：取本品粉末0.01g，加水2ml，于离心管中静置0.8-1.2小时，75-85℃水浴加热2-4小时，待测；量取供试品溶液1.5ml，加水至2.0ml，迅速加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加硫酸40ml使之溶解，摇匀)6ml，立即摇匀，放置12-18分钟后，立即置冰浴中冷却12-18分钟，取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读取供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得。

本发明相比现有技术的优点在于：本发明利用低温等离子体处理灵芝孢子粉，利用等离子体灭菌和表面蚀刻等效用，作用于灵芝孢子粉，一方面抑制孢子粉中微生物的增殖，提高了使用的安全性，另一方面也在其表面起到了蚀刻效果；常温下的处理过程增加了其中活性成分如灵芝三萜和灵芝多糖的释放，但又保证孢子外壳的完整性，减少了有效成分的损失，使其成分缓慢释放出来，并提高了机体的利用效率。

附图说明

图1是实施例1-3中的一种等离子体处理灵芝孢子以提高三萜和多糖释放量的方法的等离子体放电装置结构示意图；

图2是实施例3中的一种等离子体处理灵芝孢子以提高三萜和多糖释放量的方法的低温等离子体处理灵芝孢子粉对三萜释放量的影响；

图3是实施例3中的一种等离子体处理灵芝孢子以提高三萜和多糖释放量的方法的低温等离子体处理灵芝孢子粉对多糖释放量的影响。

图中：1为高压交流电源，2为电极，3为支架，4为供气钢瓶，5为真空抽气泵，6为反应腔室，7为无菌玻璃平皿，8为石英玻璃板。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例的一种等离子体处理灵芝孢子以提高三萜和多糖释放量的方法，包括如下步骤：

(1)洁净状态下收集优良菌种的灵芝孢子，利用无菌水多次清洗；2000rpm离心15min后，留取沉淀的灵芝孢子；

(2)将步骤(1)所得的一定量的灵芝孢子沉淀液(浓度为10⁸个/ml)注入玻璃平皿表面，用灭菌后的玻璃涂棒在表面按照一定方向涂布均匀，保证玻璃平皿内液体厚度不超过1mm；超净台中完全风干后，用灭菌后的玻璃涂棒将玻璃平皿中表面不平的位置涂抹平整，以保证孢子粉分散均匀；

采用如图1所示的等离子体放电装置(包括高压交流电源1、电极2、支架3、供气钢瓶4、真空抽气泵5、反应腔室6、无菌玻璃平皿7和石英玻璃板8)进行放电处理过程，具体方法为：采用低气压介质阻挡放电，处理时，将步骤(1)所得的灵芝孢子平铺于等离子体放电装置的无菌玻璃平皿7中，置于反应腔室6内，反应腔室6通真空抽气泵5抽气而保持2000pa以下的气压，同时控制通入氦气或氩气作为击穿气体，放电电压为1.5kv，在200瓦功率范围条件下，经石英玻璃板8阻挡放电处理8min；

(3)采用高氯酸-香草醛法测定处理后灵芝孢子粉中灵芝三萜释放量对比检测，具体方法为：

①齐墩果酸测定应用液的配制：取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；

②标准曲线的制定：量取齐墩果酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，分别置于具塞试管中，挥干，放冷，加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，在65℃水浴中加热18分钟，立即置冰浴中冷却4分钟，取出，加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在546nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；

③供试品溶液的制备：取本品粉末0.01g，置具塞锥形瓶中，加乙醇2ml，超声处理25分钟，量取供试品溶液0.2ml，置具塞试管中，置于通风橱中，放冷，加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，在65℃水浴中加热18分钟，立即置冰浴中冷却4分钟，取出，加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在546nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，根据上述制备的标准曲线计算，即得；

(4)采用硫酸-蒽酮法测定处理后灵芝孢子粉中的灵芝多糖释放量对比检测，具体方法为：

①对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品，加水制成每1ml含0.12mg的溶液，即得；

②标准曲线的制备：量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分别置于具塞试管中，各加水至2.0ml，迅速加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加硫酸40ml使之溶解，摇匀)6ml，立即摇匀，放置12分钟后，立即置冰浴中冷却12分钟，取出，以相应的试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

③供试品溶液的制备：取本品粉末0.01g，加水2ml，于离心管中静置0.8小时，75℃水浴加热4小时，待测；量取供试品溶液1.5ml，加水至2.0ml，迅速加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加硫酸40ml使之溶解，摇匀)6ml，立即摇匀，放置12分钟后，立即置冰浴中冷却12分钟，取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读取供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得。

实施例2

本实施例的一种等离子体处理灵芝孢子以提高三萜和多糖释放量的方法，包括如下步骤：

(1)洁净状态下收集优良菌种的灵芝孢子，利用无菌水多次清洗；5000rpm离心5min后，留取沉淀的灵芝孢子；

(2)将步骤(1)所得的一定量的灵芝孢子沉淀液(浓度为10¹⁰个/ml)注入玻璃平皿表面，用灭菌后的玻璃涂棒在表面按照一定方向涂布均匀，保证玻璃平皿内液体厚度不超过1mm；超净台中完全风干后，用灭菌后的玻璃涂棒将玻璃平皿中表面不平的位置涂抹平整，以保证孢子粉分散均匀；

采用如图1所示的等离子体放电装置(包括高压交流电源1、电极2、支架3、供气钢瓶4、真空抽气泵5、反应腔室6、无菌玻璃平皿7和石英玻璃板8)进行放电处理过程，具体方法为：采用低气压介质阻挡放电，处理时，将步骤(1)所得的灵芝孢子平铺于等离子体放电装置的无菌玻璃平皿7中，置于反应腔室6内，反应腔室6通真空抽气泵5抽气而保持2000pa以下的气压，同时控制通入氮气作为击穿气体，放电电压为1.8kv，在600瓦功率范围条件下，经石英玻璃板8阻挡放电处理10min；

(3)采用高氯酸-香草醛法测定处理后灵芝孢子粉中灵芝三萜释放量对比检测，具体方法为：

①齐墩果酸测定应用液的配制：取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；

②标准曲线的制定：量取齐墩果酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，分别置于具塞试管中，挥干，放冷，加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，在75℃水浴中加热12分钟，立即置冰浴中冷却6分钟，取出，加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在546nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；

③供试品溶液的制备：取本品粉末0.01g，置具塞锥形瓶中，加乙醇2ml，超声处理35分钟，量取供试品溶液0.2ml，置具塞试管中，置于通风橱中，放冷，加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，在75℃水浴中加热12分钟，立即置冰浴中冷却6分钟，取出，加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在546nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，根据上述制备的标准曲线计算，即得；

(4)采用硫酸-蒽酮法测定处理后灵芝孢子粉中的灵芝多糖释放量对比检测，具体方法为：

①对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品，加水制成每1ml含0.12mg的溶液，即得；

②标准曲线的制备：量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分别置于具塞试管中，各加水至2.0ml，迅速加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加硫酸40ml使之溶解，摇匀)6ml，立即摇匀，放置18分钟后，立即置冰浴中冷却18分钟，取出，以相应的试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

③供试品溶液的制备：取本品粉末0.01g，加水2ml，于离心管中静置1.2小时，85℃水浴加热2小时，待测；量取供试品溶液1.5ml，加水至2.0ml，迅速加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加硫酸40ml使之溶解，摇匀)6ml，立即摇匀，放置18分钟后，立即置冰浴中冷却18分钟，取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读取供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得。

实施例3

本实施例的一种等离子体处理灵芝孢子以提高三萜和多糖释放量的方法，包括如下步骤：

(1)洁净状态下收集优良菌种的灵芝孢子，利用无菌水多次清洗；3000rpm离心8min后，留取沉淀的灵芝孢子；

(2)将步骤(1)所得的一定量的灵芝孢子沉淀液(浓度为10⁹个/ml)注入玻璃平皿表面，用灭菌后的玻璃涂棒在表面按照一定方向涂布均匀，保证玻璃平皿内液体厚度不超过1mm；超净台中完全风干后，用灭菌后的玻璃涂棒将玻璃平皿中表面不平的位置涂抹平整，以保证孢子粉分散均匀；

采用如图1所示的等离子体放电装置(包括高压交流电源1、电极2、支架3、供气钢瓶4、真空抽气泵5、反应腔室6、无菌玻璃平皿7和石英玻璃板8)进行放电处理过程，具体方法为：采用低气压介质阻挡放电，处理时，将步骤(1)所得的灵芝孢子平铺于等离子体放电装置的无菌玻璃平皿7中，置于反应腔室6内，反应腔室6通真空抽气泵5抽气而保持2000pa以下的气压，同时控制通入空气作为击穿气体，放电电压为2kv，在400瓦功率范围条件下，经石英玻璃板8阻挡放电处理5min；

(3)采用高氯酸-香草醛法测定处理后灵芝孢子粉中灵芝三萜释放量对比检测，具体方法为：

①齐墩果酸测定应用液的配制：取齐墩果酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；

②标准曲线的制定：量取齐墩果酸对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，分别置于具塞试管中，挥干，放冷，加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，在70℃水浴中加热15分钟，立即置冰浴中冷却5分钟，取出，加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在546nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；

③供试品溶液的制备：取本品粉末0.01g，置具塞锥形瓶中，加乙醇2ml，超声处理30分钟，量取供试品溶液0.2ml，置具塞试管中，置于通风橱中，放冷，加入新配制的香草醛冰醋酸溶液(精密称取香草醛0.5g，加冰醋酸使溶解成10ml，即得)0.2ml、高氯酸0.8ml，摇匀，在70℃水浴中加热15分钟，立即置冰浴中冷却5分钟，取出，加入乙酸乙酯4ml，摇匀，以相应试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在546nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中齐墩果酸的含量，根据上述制备的标准曲线计算，即得；

经该处理会促使灵芝孢子粉中的三萜含量释放量显著上升，结果如图2所示；从此结果可以看出，在未处理之前，灵芝孢子粉中三萜释放量为0.01842±0.000921％，经等离子体放电处理后，其三萜释放量为0.06775±0.00339％；由此可见，经等离子体放电处理，可有效提升灵芝孢子粉中三萜类物质的释放，使其成分缓慢释放出来，提高机体的利用效率；

(4)采用硫酸-蒽酮法测定处理后灵芝孢子粉中的灵芝多糖释放量对比检测，具体方法为：

①对照品溶液的制备：取无水葡萄糖对照品，加水制成每1ml含0.12mg的溶液，即得；

②标准曲线的制备：量取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分别置于具塞试管中，各加水至2.0ml，迅速加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加硫酸40ml使之溶解，摇匀)6ml，立即摇匀，放置15分钟后，立即置冰浴中冷却15分钟，取出，以相应的试剂为空白，依照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；

③供试品溶液的制备：取本品粉末0.01g，加水2ml，于离心管中静置1.0小时，80℃水浴加热3小时，待测；量取供试品溶液1.5ml，加水至2.0ml，迅速加入硫酸蒽酮溶液(精密称取蒽酮0.1g，加硫酸40ml使之溶解，摇匀)6ml，立即摇匀，放置15分钟后，立即置冰浴中冷却15分钟，取出，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在625nm波长处测定吸光度，从标准曲线上读取供试品溶液中无水葡萄糖的含量，计算，即得；

经该处理会促使灵芝孢子粉中的多糖含量释放量显著上升，结果如图3所示；从此结果可以看出，在未处理之前，灵芝孢子粉中多糖释放量为0.91757±0.04588％，经等离子体放电处理后，其多糖释放量为2.8645±0.16683％；由此可见，经等离子体放电处理，可有效提升灵芝孢子粉中多糖释放，使其成分缓慢释放出来，提高机体的利用效率。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。