本发明涉及一种食药用菌三萜类功效成分的提取分离制备方法，具体涉及一种牛樟芝菌丝体三萜类提取物的制备方法，本发明制得的牛樟芝菌丝体三萜类提取物的纯度高达70％～90％。
(二)
背景技术：
牛樟芝(Taiwanofungus camphorates)，又名牛樟菇或樟芝，是一种原产于我国台湾省的珍稀药用菌，仅生长于牛樟树(Cinnamomumkanehirai)中空芯材内壁，数量稀少，且生长速度缓慢。牛樟芝含有维生素、固醇类、麦角甾醇、多糖、三萜类、超氧化物歧化酶(SOD)、腺苷和小分子蛋白质等多种成分，具有抗肿瘤、增加免疫能力、抗细菌、抗病毒、抗过敏、抗高血压、降血糖、降胆固醇、抑制血小板凝集及保肝护肝等功效，且被证实不具毒副作用，使用安全性高。研究表明，三萜类化合物是其发挥功效的主要成分，不仅能抑制癌细胞的生长，抑制组织胺的释放，还具有防止过敏，保护肝脏，促进血小板凝集、降低血脂等功效。三萜类含量越高则医用价值越高。三萜类化合物普遍存在于牛樟芝、灵芝等菌菇类植物中，其中，灵芝中三萜类物质含量仅为1％-3％，而牛樟芝中三萜类物质含量可高达15％-45％，被称为“灵芝之王”。另外樟芝中三萜类化合物和灵芝中三萜类化合物是不尽相同的，灵芝中主要以羊毛甾烷类三萜为主，而樟芝中则含有较多的麦角甾烷类三萜。羊毛甾烷类的三萜也常在其它真菌中被发现，而麦角甾烷三萜类化合物则比较罕见，是樟芝的指标成分。
牛樟树是野生樟芝的唯一寄主，牛樟树仅生长在台湾地区，自然界中牛樟树数量不多，且能寄生樟芝的老树更是罕见，再加上野生樟芝生长缓慢，近代以来因不法滥采，导致野生樟芝资源严重短缺，价格十分昂贵，无法满足社会更多需求。近年来台湾、福建、浙江等地开展了樟芝人工栽培研究，并取得较好效果。目前牛樟芝人工培养方式主要有三种：牛樟树段木栽培、固态发酵和深层液态发酵。第一种得到的是子实体，后两种得到的是菌丝体或其混合物。(1)牛樟树锻木培养法：优点是能得到与天然樟芝子实体成分和含量较为相同的生理活性物质。但缺点是需要珍稀牛樟锻木，要得到成形的子实体一般需要1-3年时间，周期非常长。樟芝菌丝体培养是目前有效的人工规模化培养方式，主要通过固态和液态发酵。(2)固态培养：一般需要几周，甚至几个月。可以得到与子实体相近的成分。(3)深层液态发酵：生产的机械化和自动化程度高，可以实现规模化生产，发酵工艺条件易控制，人力成本较低。但主要问题是产生的菌丝体活性成分较少，与子实体或是固态发酵产物差别较大。
目前已有的三萜类化合物的提取方法主要包括有机溶剂萃取法，加热回流提取，微波辅助提取等。有机溶剂萃取常采用甲醇、乙醚、氯仿等有机溶剂进行萃取，虽然提取率较高，但加大了后续医药食品应用时的安全风险。目前已有的樟芝三萜纯化精制文献专利，如，“一种牛樟芝中三萜化合物的精制方法”，申请号201410811689.6，该专利方法为：牛樟芝前处理、三萜类化合物超临界CO2萃取、三萜类化合物超声提取、减压蒸馏得到三萜类化合物粗提物浸膏、乙酸乙酯提取，得三萜类化合物精提物萃取液以及减压蒸馏得到三萜类化合物精提物。“一种牛樟菌牛樟芝总三菇提取方法”，申请号201410471598.2。“用大孔吸附树脂制备樟芝多糖和樟芝三萜的方法及其产品”，授权专利号ZL 200510038035.5，发明对樟芝子实体或菌丝体采取热水提取，大孔树脂吸附水提取液和乙醇分级洗脱方法分别获得樟芝多糖和樟芝三萜，所获得的樟芝三萜具有很好的抗肝癌细胞活性。所采用的非极性大孔吸附树脂是D-101树脂，中极性大孔吸附树脂是HPD400。但上述三个专利均未提及制备后的三萜具体纯度数据。“一种高含量牛樟芝真菌活性多糖和三萜精粉及其副产品的综合利用生产工艺”，申请号201410339121.9，该发明采用固形体颗粒发酵，培育的牛樟芝菌丝体，经提取、浓缩，高纯度粮食酒醇析沉淀牛樟芝真菌活性多糖和三萜精粉，牛樟芝多糖含量为80％，但三萜含量仅有30％。江南大学的陆震鸣等人发表的文献“基于大孔树脂吸附的樟芝胞外总三萜的分离工艺”，XAD-16大孔树脂分离纯化樟芝胞外总三萜，获得总三萜样品纯度也仅为26.1％。
本发明采用超声波乙醇水溶液辅助提取、溶剂萃取和AB-8大孔树脂纯化牛樟芝菌丝体三萜类物质，得到的三萜类提取物纯度高达70％～90％。
(三)
技术实现要素：
本发明目的在于提供一种牛樟芝菌丝体三萜类提取物的制备方法。本发明对牛樟芝菌丝体中三萜类化合物采用超声辅助提取，提取液经大孔树脂纯化得到高纯度三萜，分析检测发现其具有较高的提取率及纯度。
本发明采用如下技术方案：
一种牛樟芝菌丝体三萜类提取物的制备方法，所述的制备方法按如下步骤进行：
(1)取牛樟芝菌丝体粉末，以料液质量比1：10～30加入60wt％～80wt％乙醇水溶液中，超声提取20～40min，离心，收集上清液，滤渣重复超声提取1～3次，合并各次所得上清液，浓缩(通常浓缩至初始体积的1/5左右)，冷冻干燥，得到牛樟芝三萜粗提物；
所述牛樟芝菌丝体粉末由牛樟芝固体栽培菌丝体经40～60℃真空干燥、粉碎过筛至40～80目得到，置于双层密封袋4℃冷藏备用；
所述超声提取的功率为80～100W；
(2)取步骤(1)所得牛樟芝三萜粗提物，以料液质量比1：10～20超声分散于水中，得到分散液；然后加入与所得分散液等体积的30～60℃石油醚进行脱脂(推荐重复脱脂1～3次)，得到脱脂液；接着加入与所得脱脂液等体积的乙酸乙酯进行萃取(推荐重复萃取1～3次)，收集乙酸乙酯层减压蒸除溶剂，得到浓缩物；
所述石油醚脱脂为本领域的常规操作方法，即在所述分散液中加入等体积的30～60℃石油醚萃取，弃去石油醚层，收集萃余液即可；
(3)将步骤(2)所得浓缩物加入20wt％～30wt％乙醇水溶液中，调节pH至2～5(用0.1N盐酸水溶液进行调节)，随后进行大孔吸附树脂柱纯化，先分别用2～4倍柱体积的去离子水和20wt％～40wt％乙醇水溶液洗脱除杂，再用3～6倍柱体积的60wt％～90wt％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压蒸除溶剂，冷冻干燥，即得所述的牛樟芝菌丝体三萜类提取物。
推荐所述大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂，玻璃层析柱：2.6×80cm，上样浓度5～25mg/mL，上样体积0.1～0.3倍柱体积，上样流速0.5～2.5mL/min。
上样原液的pH为5～6，因牛樟芝三萜中大多为含羧基的三萜酸成分，调节pH有利于抑制三萜酸的羧基H+的解离，加入适量0.1N盐酸水溶液，调节上样pH为2～5，有利于弱极性的大孔吸附树脂吸附三萜成分。AB-8大孔树脂平均孔径较大，有利于三萜类物质的较大量吸附。
上样后，先分别用2～4倍柱体积的去离子水和20wt％～40wt％乙醇水溶液洗脱除杂，去离子水能够除去未被树脂吸附的大量糖类、蛋白等物质，20wt％～40wt％乙醇水溶液能够将吸附在树脂上的色素、酚类化合物洗脱。
本发明制得的牛樟芝菌丝体三萜类提取物按如下方法进行分析检测：
①纯化物得率：(纯化物干重/牛樟芝原料质量)×100％；
②总三萜含量：采用香草醛-冰乙酸法；称取10mg提取物加10mL80％乙醇溶解，水浴挥干，加入新配制的5％香草醛-冰乙酸溶液0.2mL，高氯酸0.8mL，混匀。置于70℃水浴加热15min，冷却至室温后加5.0mL冰乙酸稀释，混匀。以乙醇为空白对照，550nm下测定吸光值。结果表达为每克牛樟芝原料干重所含齐墩果酸的相当量(mg OA/g干重)；
③三萜纯度：(提取物中总三萜含量/提取物质量)×100％。
本发明的有益效果在于：采用超声波辅助提取，溶剂萃取与大孔树脂相结合的方法，工艺简单，成本较低，适合中试和工业化生产。按照本发明方法制备的牛樟芝菌丝体三萜类提取物，提取率为5％～8％，三萜纯度高达70％～90％。
(四)附图说明
图1：本发明制备方法的工艺流程图。
(五)具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。
以下实施例中所用到的物料、仪器相关信息为：
牛樟芝固体栽培菌丝体：由丽水瑞草药用真菌研究所提供；
真空干燥箱：德国宾德Binder VD23；
FS-1200型超声波细胞破碎器：上海生析仪器公司；
离心机：TD5A-WS，配NO.4转子，湖南湘仪离心机仪器有限公司；
旋转蒸发仪：R2002B，配循环水泵，上海申生科技有限公司
AB-8大孔吸附树脂：安徽三星树脂科技有限公司。
实施例1
(1)将牛樟芝固体栽培菌丝体于45℃真空干燥、粉碎过筛至50目，称取牛樟芝菌丝体粉末50g，以料液质量比1：10加入500g 60wt％乙醇水溶液中进行超声辅助提取，提取功率为80W，时间为20min，5000r/min离心，收集上清液，滤渣重复超声提取1次，合并各次所得上清液，在50℃、真空度0.1Mpa条件下旋转蒸发，浓缩至原体积1/5，之后冷冻干燥，得到牛樟芝三萜粗提物；
(2)取步骤(1)所得牛樟芝三萜粗提物，超声分散于200mL纯净水中，得到分散液；然后加入与所得分散液等体积的30℃石油醚进行脱脂，重复脱脂2次，得到脱脂液；接着加入与所得脱脂液等体积的乙酸乙酯进行萃取，重复萃取2次，收集萃取液减压蒸除溶剂，得到浓缩物；
(3)将步骤(2)所得浓缩物加入300mL20wt％乙醇水溶液中，原始pH为5.2，用0.1N盐酸水溶液调节pH至4.5，随后进行AB-8大孔吸附树脂柱纯化，玻璃层析柱：2.6×80cm，上样浓度24.7mg/mL，上样体积0.3倍柱体积，上样流速2.0mL/min，先分别用2倍柱体积的去离子水和20wt％乙醇水溶液洗脱除杂，再用3倍柱体积的70wt％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压蒸除溶剂，冷冻干燥，即得产品牛樟芝菌丝体三萜类提取物2.9g。
经分析检测，所得产品提取率为5.8％，三萜含量为71.6％。
实施例2
(1)将牛樟芝固体栽培菌丝体于50℃真空干燥、粉碎过筛至60目，称取牛樟芝菌丝体粉末50g，以料液质量比1：30加入1500g 70wt％乙醇水溶液中进行超声辅助提取，提取功率为90W，时间为30min，5000r/min离心，收集上清液，滤渣重复超声提取2次，合并各次所得上清液，在50℃、真空度0.05Mpa条件下旋转蒸发，浓缩至原体积1/5，之后冷冻干燥，得到牛樟芝三萜粗提物；
(2)取步骤(1)所得牛樟芝三萜粗提物，超声分散于300mL纯净水中，得到分散液；然后加入与所得分散液等体积的45℃石油醚进行脱脂，重复脱脂3次，得到脱脂液；接着加入与所得脱脂液等体积的乙酸乙酯进行萃取，重复萃取3次，收集萃取液减压蒸除溶剂，得到浓缩物；
(3)将步骤(2)所得浓缩物加入400mL20wt％乙醇水溶液中，原始pH为5.4，用0.1N盐酸水溶液调节pH至4.0，随后进行AB-8大孔吸附树脂柱纯化，玻璃层析柱：2.6×80cm，上样浓度15.3mg/mL，上样体积0.2倍柱体积，上样流速2.0mL/min，先分别用3倍柱体积的去离子水和30wt％乙醇水溶液洗脱除杂，再用4倍柱体积的80wt％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压蒸除溶剂，冷冻干燥，即得产品牛樟芝菌丝体三萜类提取物3.45g。
经分析检测，所得产品提取率为6.9％，三萜含量为76.7％。
实施例3
(1)将牛樟芝固体栽培菌丝体于50℃真空干燥、粉碎过筛至80目，称取牛樟芝菌丝体粉末50g，以料液质量比1：30加入1500g 80wt％乙醇水溶液中进行超声辅助提取，提取功率为100W，时间为40min，5000r/min离心，收集上清液，滤渣重复超声提取2次，合并各次所得上清液，在50℃、真空度0.05Mpa条件下旋转蒸发，浓缩至原体积1/5，之后冷冻干燥，得到牛樟芝三萜粗提物；
(2)取步骤(1)所得牛樟芝三萜粗提物，超声分散于300mL纯净水中，得到分散液；然后加入与所得分散液等体积的60℃石油醚进行脱脂，重复脱脂3次，得到脱脂液；接着加入与所得脱脂液等体积的乙酸乙酯进行萃取，重复萃取3次，收集萃取液减压蒸除溶剂，得到浓缩物；
(3)将步骤(2)所得浓缩物加入400mL30wt％乙醇水溶液中，原始pH为5.5，用0.1N盐酸水溶液调节pH至2.5，随后进行AB-8大孔吸附树脂柱纯化，玻璃层析柱：2.6×80cm，上样浓度20.4mg/mL，上样体积0.15倍柱体积，上样流速1.0mL/min，先分别用4倍柱体积的去离子水和30wt％乙醇水溶液洗脱除杂，再用6倍柱体积的90wt％乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压蒸除溶剂，冷冻干燥，即得产品牛樟芝菌丝体三萜类提取物3.9g。
经分析检测，所得产品提取率为7.8％，三萜含量为86.3％。
对比例
江南大学的陆震鸣等人(陆震鸣，等.基于大孔树脂吸附的樟芝胞外总三萜的分离工艺.食品与发酵工业，2011,37(6)：188-192)以自制樟芝发酵液为原料，以总三萜的洗脱效果为考察指标，研究了大孔树脂分离纯化的吸附性能及洗脱参数。
樟芝发酵液由该实验室发酵制备，Amberlite XAD系列大孔树脂为美国罗门哈斯(Rohm&Haas)公司产品。
结果表明，XAD-16大孔树脂适宜樟芝胞外总三萜的富集分离，其再生能力良好，吸附过程符合Langmuir方程。同时获得了XAD-16大孔树脂对三萜类化合物的动态分离条件：上样发酵液的pH为6.0，上样量为3个柱体积，吸附流速为2mL/min，解吸附溶剂为乙醇。溶液中三萜类化合物的初始浓度(同上样浓度)为0.97mg/mL，获得的总三萜样品纯度为260.54mg/g，即样品纯度仅有26.1％。
而本发明采用人工栽培菌丝体为原料，经超声提取、溶剂萃取和AB-8大孔吸附树脂纯化(调节上样pH2～5)，得到的三萜类提取物提取率达5～8％，纯度高达70％～90％。与上述公开的文献对比，论文为人工培养发酵液(因来源不同，樟芝三萜的成分及含量有较大差异)，未有超声提取和溶剂萃取过程，所用树脂型号不同，调整的pH不同，所得样品的三萜纯度相差巨大，而且本发明的三萜提取率达5～8％。