蝉花水提物在制备防治急性肝损伤药物中的用途的制作方法

本发明属中药制药领域，涉及中草药蝉花水提物的新的药用用途，具体涉及蝉花水提物在制备防治急性肝损伤药物中的用途。

背景技术：

据报道，急性肝损伤起病急且病情发展迅速，可引发机体多器官衰竭甚至危及生命，因此在临床研究实践中是引起本领域技术人员高度关注的严峻的课题。有研究证实，急性肝损伤的发生发展过程中伴随着明显的炎症反应，包括炎性因子的生成、巨噬细胞和免疫细胞在肝脏中的聚集与浸润，以及相关的炎症信号通路激活等过程。通常，临床实践通过干预急性肝损伤中相关炎症反应的发展与调控过程实现有效的改善急性肝损伤程度。

中草药蝉花(Cordyceps sobolifera)最早收载于《图经本草》、《本草纲目》等古籍中。文献报道，蝉花具有抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力、保肝及抗炎等作用，但其具体药效作用及相关作用机制尚未明确。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供中草药蝉花水提物的新的药用用途，具体涉及蝉花水提物在制备防治急性肝损伤药物中的用途。

技术实现要素：

本发明的目的是提供中草药蝉花水提物的新的药用用途，具体涉及蝉花水提物在制备防治急性肝损伤药物中的用途。

本发明的蝉花水提物可通过保护肝功能及缓解肝脏炎症反应防治急性肝损伤。

本发明通过建立的D-氨基半乳糖/脂多糖(D-GalN/LPS)诱导的急性肝损伤模型，研究证实了蝉花水提物对急性肝损伤及肝脏炎症反应的保护作用，其中，通过检测血清中转氨酶(AST、ALT)和碱性磷酸酶(ALP)的活性，肝匀浆中还原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活性和丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)的含量，以及对肝脏切片进行HE染色，结果显示蝉花水提物可降低血清转氨酶(AST、ALT)与碱性磷酸酶(ALP)水平，提高肝脏抗氧化酶还原型谷 胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性，降低脂质过氧化产物丙二醛(MDA)及过氧化氢(H₂O₂)的生成，并且能缓解肝脏病理性损伤，改善肝细胞病变坏死和炎症细胞浸润的状况，维持肝细胞形态完整，结果证实，蝉花水提物有较强的保护肝功能的作用。

本发明中，实验检测了肝脏髓过氧化物酶(MPO)的活性，血清中一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)的含量，Western Blot检测肝脏一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表达，Real TimePCR检测iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6的基因表达，结果显示，本发明的蝉花水提物能抑制iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6的转录与表达，降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO等炎症介质的水平，实现缓解肝脏炎症反应的效果。

本发明中，实验检测了丝裂原激活物蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)信号通路的激活，明确了蝉花水提物抗炎的调控机制，结果表明，所述蝉花水提物能抑制MAPK通路的激活，进一步抑制肝脏炎症反应。

本发明通过急性肝损伤模型的实验证实了所述的蝉花水提物能降低血清中转氨酶(AST、ALT)与碱性磷酸酶(ALP)水平，并减轻肝细胞脂质过氧化与氧化应激损伤；能显著性缓解肝脏炎性因子的浸润，改善肝脏的病变情况；同时，能缓解肝脏中性粒细胞的浸润，抑制相关炎症介质的转录和表达，减少炎症诱导的炎症因子及一氧化氮(NO)的释放，以及能抑制MAPK通路的激活；进一步，本发明的蝉花水提物可用于制备防治急性肝损伤的药物，用于保护肝功能，缓解肝脏炎症。

附图说明

图1蝉花水提物对血清AST、ALT、ALP水平的影响，其中，

A：蝉花水提物对血清中AST和ALT水平的影响；B：蝉花水提物对血清中ALP水平的影响；###与正常组相比，p<0.001；*与模型组相比，p<0.05；**与模型组相比，p<0.01。

图2蝉花水提物对肝匀浆GSH、SOD和CAT的活性和MDA和H₂O₂水平的影响，其中，A：蝉花水提物对肝匀浆GSH活性的影响，B：蝉花水提物对肝匀浆SOD活性的影响，C：蝉花水提物对肝匀浆CAT活性的影响，D：蝉花水提物对肝匀浆MDA水平的影响，E：蝉花水提物对肝匀浆H₂O₂水平的影响；。##与正常组相比，p<0.01； ###与正常组相比，p<0.001；*与模型组相比，p<0.05；**与模型组相比，p<0.01；***与模型组相比，p<0.001。

图3蝉花水提物对肝脏病理形态学的影响，其中，

A：正常组，B：GalN/LPS组，C：Bicyclol组，D：GalN/LPS+蝉花水提物100mg/kg。，E：GalN/LPS+蝉花水提物200mg/kg，F：GalN/LPS+蝉花水提物400mg/kg。

图4蝉花水提物对肝脏MPO活性的影响，其中，

###与正常组相比，p<0.001；*与模型组相比，p<0.05；**与模型组相比，p<0.01；***与模型组相比，p<0.001。

图5蝉花水提物对血清炎症因子与NO水平的影响，其中，

A：蝉花水提物对小鼠血清TNF-α水平的影响，B：蝉花水提物对小鼠血清IL-1β水平的影响，C:蝉花水提物对小鼠血清IL-6水平的影响，D:蝉花水提物对血清NO水平的影响，###与正常组相比，p<0.001；*与模型组相比，p<0.05；**与模型组相比，p<0.01；***与模型组相比，p<0.001。

图6蝉花水提物对肝脏iNOS蛋白表达的影响，其中，

###与正常组相比，p<0.001；*与模型组相比，p<0.05；**与模型组相比，p<0.01；***与模型组相比，p<0.001。

图7蝉花水提物对肝脏TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS基因表达的影响，其中，

A：蝉花水提物对小鼠肝脏TNF-α基因表达水平的影响，B：蝉花水提物对小鼠肝脏IL-1β基因表达水平的影响，C:蝉花水提物对小鼠肝脏IL-6基因表达水平的影响，D:蝉花水提物对小鼠肝脏iNOS基因表达水平的影响；###与正常组相比，p<0.001；*与模型组相比，p<0.05；**与模型组相比，p<0.01；***与模型组相比，p<0.001。

图8蝉花水提物对肝脏MAPK通路磷酸化水平的影响，其中，

A：蝉花水提物对小鼠肝脏p38蛋白磷酸化水平的影响，B：蝉花水提物对小鼠肝脏ERK蛋白磷酸化水平的影响，C:蝉花水提物对小鼠肝脏JNK蛋白磷酸化水平的影响；###与正常组相比，p<0.001；*与模型组相比，p<0.05；**与模型组相比，p<0.01。

具体实施方式

实施例1蝉花水提物对急性肝损伤模型的保护作用实验

分组：SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为6组，分别为：①正常对照组；②模型组；③阳性药物组；④蝉花水提物低剂量组；⑤蝉花水提物中剂量组；⑥蝉花 水提物高剂量组；给药：③以双环醇200mg/kg灌胃给药两周，④-⑥分别以100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg的蝉花水提物灌胃给药两周、①-②给予等量饮用水作对照。造模及取材：腹腔注射D-GalN/LPS溶液(600mg/kg，30μg/kg)造成急性肝损伤模型，8小时后摘眼球取血并迅速开腹分离肝脏。检测血清中ALT、AST和ALP活性；制备肝匀浆，肝脏匀浆中抗氧化酶SOD、GSH、CAT的活性以及过氧化产物MDA和、H₂O₂的含量；

结果表明，蝉花水提物显著降低血清中的AST、ALT和ALP水平；同时可显著提升肝脏GSH、SOD和CAT的活性，并降低肝脏MDA和H₂O₂的生成；实验结果证明，所述的蝉花水提物对急性肝损伤具有明显的保护作用，可用于制备防治急性肝损伤的药物。

实施例2蝉花水提物对肝脏病理情况的影响

分组：SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为6组，分别为：①正常对照组；②模型组；③阳性药物组；④蝉花水提物低剂量组；⑤蝉花水提物中剂量组；⑥蝉花水提物高剂量组；给药：③以双环醇200mg/kg灌胃给药两周，④-⑥分别以100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg的蝉花水提物灌胃给药两周、①-②给予等量饮用水作对照。造模及取材：腹腔注射D-GalN/LPS溶液(600mg/kg，30μg/kg)造成急性肝损伤模型，8小时后开腹分离肝脏，并剪下肝脏右叶3.5mm×3.5mm左右，用多聚甲醛固定后梯度脱水后进行常规石蜡包埋，切片后进行HE染色；

结果显示，蝉花水提物可显著缓解肝脏病理性损伤，改善肝脏空泡样病变，并且明显改善肝细胞病变坏死、炎症细胞浸润情况，对急性肝损伤具有明显的保护作用。

实施例3蝉花水提物对肝脏中性粒细胞浸润情况的影响

分组：SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为6组，分别为：①正常对照组；②模型组；③阳性药物组；④蝉花水提物低剂量组；⑤蝉花水提物中剂量组；⑥蝉花水提物高剂量组；给药：③以双环醇200mg/kg灌胃给药两周，④-⑥分别以100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg的蝉花水提物灌胃给药两周、①-②给予等量饮用水作对照；造模及取材：腹腔注射D-GalN/LPS溶液(600mg/kg，30μg/kg)造成急性肝损伤模型，8小时后开腹分离肝脏、制备肝匀浆，并检测肝脏匀浆中的MPO活性；

结果显示，蝉花水提物可显著降低肝脏MPO活性，提示蝉花水提物可有效缓解肝脏的中性粒细胞浸润情况，可有效抑制肝脏炎性反应。

实施例4蝉花水提物对肝脏炎症情况的保护作用

分组：SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为6组，分别为：①正常对照组；②模型组；③阳性药物组；④蝉花水提物低剂量组；⑤蝉花水提物中剂量组；⑥蝉花水提物高剂量组；给药：③以双环醇200mg/kg灌胃给药两周，④-⑥分别以100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg的蝉花水提物灌胃给药两周、①-②给予等量饮用水作对照；造模及取材：腹腔注射D-GalN/LPS溶液(600mg/kg，30μg/kg)造成急性肝损伤模型，8小时后摘眼球取血并迅速开腹分离肝脏。ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平。Griess法检测血清NO水平。采用Western Blot方法检测肝脏炎症相关蛋白iNOS的表达。采用Real Time RT-PCR方法检测肝脏炎症相关基因TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS的表达；

实验数据进行单因素方差分析，结果显示，蝉花水提物可显著降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和NO水平，并且能够抑制炎症相关的蛋白和基因表达，证明蝉花水提物可对急性肝损伤中的炎症反应有明显的保护作用。

实施例5蝉花水提物抑制肝脏炎症反应的相关机制

分组：SPF级C57BL/6雄性小鼠随机分为6组，分别为：①正常对照组；②模型组；③阳性药物组；④蝉花水提物低剂量组；⑤蝉花水提物中剂量组；⑥蝉花水提物高剂量组；给药：③以双环醇200mg/kg灌胃给药两周，④-⑥分别以100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg的蝉花水提物灌胃给药两周、①-②给予等量饮用水作对照；造模及取材：腹腔注射D-GalN/LPS溶液(600mg/kg，30μg/kg)造成急性肝损伤模型，8小时后开腹分离肝脏。采用Western Blot方法检测肝脏MAPK(p38、ERK1/2、JNK1/2)的激活水平；

结果显示，蝉花水提物可显著抑制肝脏MAPK信号通路的激活，从而抑制急性肝损伤中的炎症反应。