一种以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法
【专利摘要】本发明公开了一种以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蝉花的方法，所述方法包括如下步骤：从野生蝉花中分离筛选出蝉花菌株，将其接种于培养基上，培养至长出菌丝体，再进行明暗交替培养，待长满孢子后，将孢子洗下，制成孢子悬液；以家蚕活体蚕蛹为寄主，采用注射、浸泡或体喷的方法使用蝉花孢子悬液将家蚕活体蚕蛹感染；将已感染的家蚕蚕蛹，培养至蚕蛹变硬，进行明暗交替培养。本发明采用活体蚕蛹为寄主培育蚕蛹蝉花，营养成分高、无毒，可以开发成各种食品及保健品，食用安全可靠；本发明以家蚕蚕蛹培育蝉花的方法，培养周期短，技术工艺简便，适用于大规模化生产，具有广阔的应用前景。
【专利说明】
一种以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法
技术领域
[0001]本发明属于培育蝉花的方法，具体涉及一种以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法。
【背景技术】
[0002]蝴花(Cordycepscicadae)为麦角菌科大蝴草(Cordyceps cicadae Shing)寄生在蝉科昆虫山蝉若虫上的子座及若虫尸体的复合体，是我国传统的一种名贵中药材。在中国，蝉花被用作传统的中药材和食物已经有1500多年，远远早于冬虫夏草。现代医学研究表明蝉花含多种活性成分，具有治疗小儿抽搐、抗肿瘤、镇痛和镇静、改善肾功能、抗疲劳、免疫调节等功用，是一种与冬虫夏草相近的珍贵药材，可作为冬虫夏草的替代品。
[0003]蝉花市场需求量日益增大，然而蝉花生长需要特定的生态环境和寄主昆虫，自然出产率较低，再加上人们长期大量采挖，资源日趋减少。为了满足市场和临床的需求，近年来，科研人员开展了蝉花的人工培育研究，并取得了一定的进展。目前，国内外已有一些关于蝉花人工培养技术的公开报道。例如，“一种蝉花的培养方法(CN103392500A)”，将蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae)活化后接种于培养基上，暗培养至长出菌蕾后，避光进行通风培养，培养40天左右即可收获子实体。“以蝉幼虫为寄主的蝉花子实体及其培育方法(CN102763560A)”，将蛹虫草子实体在固体培养基上经孢子分离提纯复壮，得到蛹虫草菌丝体，经用液体培养基振荡培养，制成液体菌种，对金蝉幼虫进行处理，在蝉幼虫身体上用无菌针扎小洞，用无菌注射器吸入液体菌种注入蝉幼虫体后背，将已注射感染的蝉幼虫置于无菌的组培瓶内，用注射器将0.1ml液体菌种注入蝉幼虫外体，盖上瓶盖，培养至蝉花子实体长至3cm长。“一种蝉花仿生的培养方法(CN103975765A)”，以蝉花的生态环境和生长规律为依据，采用微生物工程技术、生态学和栽培学的方法，进行蝉花仿生培养栽培技术系统研究，确立蝉花在天然竹林下仿生栽培技术操作规程，建立仿生态体系，从而获得优质蝉花原料。“一种人工金蝉花的生产方法(CN103598014A)”，将野生金蝉花低温除湿，进行干燥，收集蝉花孢子粉，按照孢子粉与培养基以重量比为I: 1000比例混合，将混合后的培养基在15-25°C下培养20-30天获得蝉花。“一种蝉拟青霉人工培养的方法及其培养产物的应用(CN102242070A)”经过菌种制备、配料装盒、灭菌、接种、固体发酵、采收等步骤大规模人工培养蝉拟青霉，采用玉米粉、麸皮、小麦、大麦、大米、粟、高粱等谷物与甘蔗渣、蔗糖、贝壳粉、蚕蛹粉、硝酸钾为培养基培养蝉拟青霉。“一种蝉花的人工培养方法(CN101225362A)”，选择蝉拟青霉异核体菌株，经用培养基培养蝉拟青霉I周后，用0.05%吐温80水将蝉拟青霉孢子洗下并稀释成蝉拟青霉孢子液，将感染体(家蚕老熟幼虫)置于蝉拟青霉孢子液中感染后，20 °C-28 °C培养2-3周获得蝉花。
[0004]家蚕蚕蛹营养成分十分丰富，传统利用主要是开发成各种食品及保健品。近年来，蚕蛹培养蛹虫草逐渐成为蚕业多用途利用领域的研究热点，“蚕蛹虫草酒”就是以蚕蛹虫草为主料而成。但是，迄今为止，还没有采用蚕蛹培育蝉花的方法。
【发明内容】
[0005]发明目的:针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法。本发明采用家蚕活体蚕蛹为寄主培育蚕蛹蝉花，营养成分高、无毒，可以开发成各种食品及保健品，食用安全可靠;本发明以家蚕蚕蛹培育蝉花的方法，培养周期短，技术工艺简便，适用于大规模化生产。
[0006]技术方案:为了实现上述目的，如本发明所述一种以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，包括如下步骤:
[0007](I)从野生蝉花中分离筛选出蝉花菌株，将蝉花菌株培养至长出菌丝体，再进行明暗交替培养，待长满孢子后，将孢子洗下，制成蝉花孢子悬液；
[0008](2)对家蚕活体蚕蛹体表进行消毒;通过蝉花孢子悬液对家蚕蚕蛹进行感染；
[0009](3)将已感染的家蚕蚕蛹，培养至蚕蛹变硬，且节间出现白色菌丝体；
[0010](4)将变硬的蚕蛹，放在无菌环境中，进行明暗交替培养。
[0011 ]进一步地，步骤(I)所述将蝉花菌株培养至长出菌丝体为将蝉花菌株接种于TOA固体培养基上，20-22 °C暗培养8-10天至长出菌丝体。
[0012]进一步地，步骤(I)所述将孢子洗下为通过0.03-0.07%吐温80的无菌水将孢子洗下。
[0013]进一步地，步骤(I)所述明暗交替培养具体步骤为22_24°C明暗交替培养，周期为12-14h，光照强度250-350LX，湿度85%-95%，培养时间为10-12d;步骤(4)所述明暗交替培养具体步骤为20-24°C明暗交替培养，周期为10-14h，光照强度150-400Lx，湿度85%~95% ,培养时间为10-25d。该生长条件模拟野生蝉花自然生长条件，得到的蝉花不仅外形与野生蝉花相似，而且质量与野生蝉花相当。
[OOM]进一步地，步骤(I)所述蝴花孢子悬液浓度为14-1O7个/mL。
[0015]进一步地，步骤(2)所述对家蚕蚕蛹进行感染为用注射器在蚕蛹皮下组织注射5-1Oul蝴花孢子悬液，放入已灭菌的培养皿中。
[0016]进一步地，步骤(2)所述对家蚕蚕蛹进行感染为将蚕蛹放在蝉花孢子悬液中浸泡10-15min后取出，放入已灭菌的培养皿中。
[0017]进一步地，步骤(2)所述对家蚕蚕蛹进行感染为通过喷雾的方法在蚕蛹体表喷射虫单花孢子悬液，放入已灭菌的培养皿中。
[0018]进一步地，步骤(3)所述培养至蚕蛹变硬为20-24°C暗培养至蚕蛹变硬。
[0019]进一步地，步骤(4)所述无菌环境为煮沸0.5-1.5h灭菌的沙子或者无菌塑料盒。
[0020]有益效果:与现有技术相比，本发明以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法具有如下优点:采用家蚕活体蚕蛹为寄主培育蚕蛹蝉花，营养成分高、无毒，可以开发成各种食品及保健品，食用安全可靠;本发明的培育方法，培养周期短，技术工艺简便，适用于大规模化生产;本发明一方面为蚕蛹资源高附加值的开发利用提供了新途径，有利于提高养蚕业的经济效益；另一方面，近年来由于虫草需求量大增，导致冬虫夏草价格直线上升，进而推动了对蝉花的需求，同时随着蝉花生态环境破坏，蝉花资源即将面临枯竭的问题，因此，本发明对保护蝉花野生资源、维持生态平衡具有潜在的社会效益。
【附图说明】
[0021]图1为实施例1条件下培育的蝉花样本；
[0022]图2为实施例2条件下培育的蝉花样本；
[0023]图3为实施例3条件下培育的蝉花样本；
[0024]图4为实施例4条件下培育的蝉花样本。
【具体实施方式】
[0025]以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0026]实施例1
[0027]1、从采集于浙江安吉竹林的野生蝉花中分离，经多代筛选获得能够感染蚕蛹的蝉花菌株，将其接种于TOA固体培养基上，20°C暗培养10天至长出菌丝体后，再进行24 °C明暗交替培养，周期为14h，光照强度350Lx，湿度95%，培养时间为1d。待长满孢子后，用0.03%吐温80的无菌水将孢子洗下，制成蝉花孢子悬液，稀释至浓度为14个/mL。
[0028]2、通过喷雾的方法用75%酒精对家蚕蚕蛹体表进行消毒，用微量注射器在家蚕蚕蛹皮下组织注射5ul的蝉花孢子悬液，接种后迅速放入已灭菌的培养皿中，进行感染。
[0029]3、将已感染的家蚕蚕蛹，在20°C培养箱中暗培养至蚕蛹变硬，节间出现白色菌丝体，一般约为8d。
[0030]4、将变硬的家蚕蚕蛹，埋入煮沸0.5h灭菌的沙子中，转入生化培养箱，进行24°C明暗交替培养，周期为14h，光照强度400Lx，湿度95%，培养1d得到图1所示的蝉花样本。
[0031]实施例2
[0032]1、从采集于浙江安吉竹林的野生蝉花中分离，经多代筛选获得能够感染蚕蛹的蝉花菌株，将其接种于PDA固体培养基上，21°C暗培养9天至长出菌丝体后，再进行23°C明暗交替培养，周期为12h，光照强度300Lx，湿度90 %，培养时间为11d。待长满孢子后，用0.05 %吐温80的无菌水将孢子洗下，制成蝉花孢子悬液，稀释至浓度为16个/mL。
[0033]2、通过喷雾的方法用75%酒精对家蚕蚕蛹体表进行消毒，将蚕蛹放在蝉花孢子悬液中浸泡1min后取出，放入已灭菌的培养皿中，进行感染。
[0034]3、将已感染的家蚕蚕蛹，在22°C培养箱中暗培养至蚕蛹变硬，节间出现白色菌丝体，一般约为7d。
[0035]4、将变硬的家蚕蚕蛹，放入无菌塑料盒中，并覆盖一层保鲜膜，转入生化培养箱，进行220C明暗交替培养，周期为12h，光照强度300Lx，湿度90 %，培养22d得到图2所示蝉花样本。
[0036]实施例3
[0037]1、从采集于浙江安吉竹林的野生蝉花中分离，经多代筛选获得能够感染蚕蛹的蝉花菌株，将其接种于PDA固体培养基上，22°C暗培养8天至长出菌丝体后，再进行22°C明暗交替培养，周期为12h，光照强度250Lx，湿度85 %，培养时间为12d。待长满孢子后，用0.07 %吐温80的无菌水将孢子洗下，制成蝉花孢子悬液，稀释至浓度为17个/mL。
[0038]2、通过喷雾的方法用75%酒精对家蚕蚕蛹体表进行消毒，用微量注射器在家蚕蚕蛹皮下组织注射1ul的蝉花孢子悬液，接种后迅速放入已灭菌的培养皿中，进行感染。
[0039]3、将已感染的家蚕蚕蛹，在24°C培养箱中暗培养至蚕蛹变硬，节间出现白色菌丝体，一般约为6d。
[0040]4、将变硬的家蚕蚕蛹，埋入煮沸1.5h灭菌的沙子中，转入生化培养箱，进行20°C明暗交替培养，周期为10h，光照强度150LX，湿度85%，培养25d得到图3所示的蝉花样本。
[0041 ] 实施例4
[0042]1、从采集于浙江安吉竹林的野生蝉花中分离，经多代筛选获得能够感染蚕蛹的蝉花菌株，将其接种于PDA固体培养基上，22°C暗培养9天至长出菌丝体后，再进行22°C明暗交替培养，周期为12h，光照强度300Lx，湿度90%，培养时间为1d。待长满孢子后，用0.05 %吐温80的无菌水将孢子洗下，制成蝉花孢子悬液，稀释至浓度为15个/mL。
[0043]2、通过喷雾的方法用75%酒精对家蚕蚕蛹体表进行消毒，将蚕蛹放在蝉花孢子悬液中浸泡15min后取出，放入已灭菌的培养皿中，进行感染。
[0044]3、将已感染的家蚕蚕蛹，在22°C培养箱中暗培养至蚕蛹变硬，节间出现白色菌丝体，一般约为7d。
[0045]4、将变硬的家蚕蚕蛹，埋入煮沸Ih灭菌的沙子中，转入生化培养箱，进行22°C明暗交替培养，周期为12h，光照强度200Lx，湿度90%，培养20d得到图4所示的蝉花样本。
[0046]实施例5
[0047]1、从采集于浙江安吉竹林的野生蝉花中分离，经多代筛选获得能够感染蚕蛹的蝉花菌株，将其接种于TOA固体培养基上，21°C暗培养10天至长出菌丝体后，再进行23°C明暗交替培养，周期为13h，光照强度300Lx，湿度90 %，培养时间为12d。待长满孢子后，用0.05 %吐温80的无菌水将孢子洗下，制成蝉花孢子悬液，稀释至浓度为15个/mL。
[0048]2、通过喷雾的方法用75%酒精对家蚕蚕蛹体表进行消毒，在通过喷雾的方法在蚕蛹体表喷射蝉花孢子悬液，放入已灭菌的培养皿中，进行感染。
[0049]3、将已感染的家蚕蚕蛹，在22°C培养箱中暗培养至蚕蛹变硬，节间出现白色菌丝体，一般约为7d。
[0050]4、将变硬的家蚕蚕蛹，放入无菌塑料盒中，并覆盖一层保鲜膜，转入生化培养箱，进行22°C明暗交替培养，周期为12h，光照强度250Lx，湿度90%，培养时间为18d。
【主权项】
1.一种以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)从野生蝉花中分离筛选出蝉花菌株，将蝉花菌株培养至长出菌丝体，再进行明暗交替培养，待长满孢子后，将孢子洗下，制成蝴花孢子悬液； (2)对家蚕活体蚕蛹体表进行消毒;通过蝉花孢子悬液对家蚕蚕蛹进行感染； (3)将已感染的家蚕蚕蛹，培养至蚕蛹变硬，且节间出现白色菌丝体； (4)将变硬的蚕蛹，放在无菌环境中，进行明暗交替培养。2.根据权利要求1所述以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，其特征在于，步骤(I)所述将蝉花菌株培养至长出菌丝体为将蝉花菌株接种于PDA固体培养基上，20-22Γ暗培养8-10天至长出菌丝体。3.根据权利要求1所述以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，其特征在于，步骤(I)所述将孢子洗下为通过质量分数为0.03-0.07 %吐温80的无菌水将孢子洗下。4.根据权利要求1所述以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，其特征在于，步骤(I)所述明暗交替培养具体步骤为22-240C明暗交替培养，周期为12-14h，光照强度250-350Lx，湿度85%-95%，培养时间为10-12d;步骤(4)所述明暗交替培养具体步骤为20-24°C明暗交替培养，周期为10_14h，光照强度150-400Lx，湿度85%-95%，培养时间为10-25d。5.根据权利要求1所述以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，其特征在于，步骤(1)所述蝉花孢子悬液浓度为14-1O7个/mL。6.根据权利要求1所述以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，其特征在于，步骤(2)所述对家蚕蚕蛹进行感染为用注射器在蚕蛹皮下组织注射5-10ul蝉花孢子悬液，放入已灭菌的培养皿中。7.根据权利要求1所述以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，其特征在于，步骤(2)所述对家蚕蚕蛹进行感染为将蚕蛹放在蝉花孢子悬液中浸泡10-15min后取出，放入已灭菌的培养皿中。8.根据权利要求1所述以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，其特征在于，步骤(2)所述对家蚕蚕蛹进行感染为通过喷雾的方法在蚕蛹体表喷射蝉花孢子悬液，放入已灭菌的培养皿中。9.根据权利要求1所述以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，其特征在于，步骤(3)所述培养至蚕蛹变硬为20-24°C暗培养至蚕蛹变硬。10.根据权利要求1所述以家蚕蚕蛹为寄主人工培育蚕蛹蝉花的方法，其特征在于，步骤(4)所述无菌环境为煮沸0.5-1.5h灭菌的沙子或者无菌塑料盒。
【文档编号】A01G1/04GK106034738SQ201610396919
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】唐顺明, 曾光远, 张有做, 沈兴家, 赵珊珊, 魏兆军, 赵巧玲, 刘莉萍, 刘龙山
【申请人】江苏科技大学