专利名称：灵芝螺旋藻中粗多糖的提取和测定方法
技术领域：
本发明涉及一种灵芝螺旋藻保健食品中粗多糖的提取和测定方法，特别是涉及一种灵芝螺旋藻片中粗多糖的提取和测定方法。
背景技术：
灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，灵芝被《本经》称为 上品，被誉为“仙草”。灵芝孢子粉为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质，其营 养价值和药理作用远远高于灵芝本身。灵芝孢子中含有蛋白质和氨基酸类、糖肽类、维生素 类、胡萝卜素、留醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类、内酯和无机离子类等。其中粗粗多糖能 够抗肿瘤、免疫调节；调节血脂以及对神经、心血管和呼吸系统有调节改善作用。从增强重 要器官系统的功能(如强心、保肝、促进造血、增强免疫功能等)和通过神经系统、内分泌系 统和免疫系统的调节作用以及它们之间的相互调节来协调机体的功能活动，使之能适应内 外环境的改变，减轻各种致病因素对机体的损害，提高机体的抗病能力。螺旋藻是一种高蛋白食品，干藻粉中植物性蛋白含量为50% 70%，相当于大豆 的1. 68倍，牛肉的3. 3倍，鸡蛋的3. 1倍，鱼肉的3. 7倍；其脂肪含量只有5%，且不含胆固 醇，它含有17种氨基酸，人体所必需的8种在螺旋藻中都含有，且含量高于FAO标准及西洋 参等其它滋补品。螺旋藻中粗多糖成分具有抗辐射和显著提高细胞超氧化物歧化酶(SOD) 的活力，增强机体的非特异性免疫力，改善造血功能，促进人体外周血中NR细胞活性，延缓 机体衰老；它还具有提高巨噬细胞清除异物的能力。螺旋藻粗多糖对电离辐射的损伤具有 明显的防护作用，减轻放射性治疗对癌症病人血细胞的破坏，作为癌症病人进行放化疗的 辅助治疗药物；也可用于贫血病的辅助治疗。螺旋藻中还含有的β-胡萝素、维生素E多种 维生素和硒等对人体有益微量元素成分，具有防癌、抗癌、清除人体自由基、增强人体免疫 功能和延缓衰老的作用。破壁灵芝孢子粉和螺旋藻粉中已证明具有增强免疫力功能的功效成分为水溶性 粗多糖，但是成熟可靠的提取其中水溶性粗多糖的方法还不多，相应的可靠的检测方法几 乎没有。特别是因为灵芝螺旋藻保健品中具有多种的干扰成分，很多测定方法的测定数据 准确率不高，提取和测定方法步骤也较为复杂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种步骤简单并且准确率高的在含有破壁灵 芝孢子粉和螺旋藻粉的营养品或保健食品中水溶性粗多糖的提取和含量测定的方法，特别 是一种灵芝螺旋藻片中粗多糖的提取以及测定方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种灵芝螺旋藻中粗多糖的提取 和测定方法，其步骤包括1)称取样品细粉0. 5 1. 0g，加入30 60倍重量的浓度为80 100%乙醇溶 液，振荡搅拌均勻，超声提取20 40min，离心弃去液体；
2)将步骤1中得到的沉淀物再加入30 60倍重量的浓度为80 100%的乙醇 溶液，振荡搅拌均勻，超声提取20 40min，离心弃去液体；3)沉淀物加入30 100倍重量的纯化水后在70 100°C的水浴中提取1 3h， 过滤，将滤液转移到IOOml容量瓶中，再将残渣洗涤2 4次，该多次洗涤的溶液一并转移 到容量瓶中定容，摇勻，作为样品溶液，所述的样品溶液中仅含有灵芝螺旋藻中的多糖；4)用硫酸苯酚法测出样品溶液中多糖的含量。上述的方法中，其特征在于所述样品为灵芝螺旋藻片。上述的方法中，优选地，所述的乙醇溶液浓度为80%。上述的方法中，所述水浴温度为100°C。优选地，上述硫酸苯酚法的具体步骤为1)取Iml样品溶液置于20ml具塞试管中，加入1. Oml浓度为5%的苯酚溶液，然 后快速加入5. Oml的浓硫酸，静置IOmin后，振荡并且充分混勻，置30°C水浴中反应20min， 使用紫外分光光度仪于490nm处测吸光度；2)测定标准品溶液精密称取干燥至恒重的葡萄糖或葡聚糖标准品，制成0. Img/ ml的标准品溶液，分别取0、0. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml、1. Oml体积的标准品溶液置于20ml 具塞试管中并分别补蒸馏水至1. Oml,同样再加入1. Oml浓度为5%的苯酚溶液，然后快速 加入5. Oml浓硫酸，静置IOmin后，振荡并且充分混勻，置30°C水浴中反应20min，使用紫外 分光光度仪在490nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，计算 得到回归方程；3)将步骤1)中得到的样品溶液的吸光度代入该回归方程，计算样品中粗多糖的含量。与现有技术相比，本发明的优点在于简化了灵芝螺旋藻中粗多糖的提取和测定的 步骤，并且测定的准确率高，灵敏度高，常规实验室均可应用，并且弥补了市场上并没有可 靠提取和测定灵芝螺旋藻保健品中粗多糖含量方法的空白。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。灵芝螺旋藻中粗多糖的提取和测定方法，是将灵芝螺旋藻类保健食品、特别是不 含有糊精、淀粉等干扰物的灵芝螺旋藻类保健食品、尤其是其片剂研磨成细粉，精密称量后 置于大容量离心管中，加入乙醇水溶液混勻，超声提取、离心，弃去溶液；得到的沉淀物再 加入乙醇水溶液，震荡混勻，超声提取、离心，将沉淀加水后转移到圆底烧瓶中，沸水浴提取 后，过滤，再将滤液定容，以葡萄糖或葡聚糖标准品溶液为对照，采用硫酸苯酚法测定粗多 糖的含量。具体步骤为(1)精密称取灵芝螺旋藻样品细粉0. 5 1. Og,加入30 60倍重量的浓度为 80 100%乙醇水溶液，振荡搅拌均勻，超声提取20 40min，离心弃去溶液。 (2)将步骤1中得到的沉淀物再加入30 60倍的重量的浓度为80 100%的乙 醇水溶液，振荡搅拌均勻，超声提取20 40min，离心弃去溶液。(3)将步骤2中得到的沉淀物加入30 100倍重量的纯化水在70 100°C的水浴中提取1 3h，过滤，将滤液转移到IOOml容量瓶中，再将残渣洗涤2 4次，该多次洗涤 的溶液一并转移到容量瓶中定容，摇勻，作为样品溶液。所述的样品溶液仅含有灵芝螺旋藻 中的多糖。以上步骤即为提取灵芝螺旋藻中多糖的步骤。(4)用硫酸苯酚法测定样品溶液中的粗多糖的含量。
其中硫酸苯酚法测定多糖含量的具体步骤为吸取Iml样品溶液置于20ml具塞试 管中，加入1. Oml浓度为5%的苯酚溶液，然后快速加入5. Oml浓硫酸，静置IOmin后，振荡 并且充分混勻，置30°C水浴中反应20min，使用紫外分光光度仪于490nm处测吸光度。精密称取干燥至恒重的葡萄糖或葡聚糖标准品，制成0. lmg/ml的对照溶液，分别 取0,0. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml、l. Oml体积的溶液置于20ml具塞试管中并补蒸馏水至 1. Oml,同样再加入1. Oml浓度为5 %的苯酚溶液，然后快速加入5. Oml浓硫酸，静置IOmin 后，振荡并且充分混勻，置30°C水浴中反应20min，使用紫外分光光度仪在490nm处测定吸 光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，拟合曲线得回归方程。(5)将步骤(4)中得到的样品溶液的吸光度代入回归方程，计算样品溶液中粗多 糖的含量，并且通过换算可得到样品中粗多糖的含量。以下为测定灵芝螺旋藻片中吸光度的几个具体实施例。实施例1 精密称取灵芝螺旋藻片细粉0. 9552g，加入30g的浓度为80%乙醇溶液，振荡搅拌 均勻，超声提取40min，离心弃去溶液。沉淀再加入30g的80%浓度的乙醇溶液，振荡搅拌 均勻，超声提取40min，离心弃去溶液。将沉淀加入30ml纯化水并且在100°C的水浴提取 3h，过滤，滤液转移到IOOml容量瓶中，残渣洗涤4次，洗涤的溶液一并转移到容量瓶定容， 摇勻，作为样品溶液。精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品0. 1080g，加蒸馏水溶解并定容于IOOOml容 量瓶中，制成0. 108mg/ml的对照溶液，并且分别取该葡萄糖溶液0、0. 2ml,0. 4ml,0. 6ml、 0. 8ml、1. Oml分别置于20ml具塞试管中并补蒸馏水至1. 0ml，加入1. 0ml5%的苯酚溶液，然 后快速加入5. Oml浓硫酸，静置lOmin，振荡充分混勻，置30°C水浴中反应20min，用紫外分 光光度仪于490nm处测吸光度，以吸光度为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线。表1对照品溶液标准曲线数值表 计算拟合后得到回归方程y = 6. 3148x-0. 0042，相关参数R2 = 0. 9993。吸取Iml样品溶液与20ml具塞试管中，同法制备，用紫外分光光度仪于490nm处 测吸光度A = 0. 676，将样品溶液吸光度带入方程式可得样品溶液中粗多糖的含量，并且将 mg/ml的单位换算成mg/g，即进行样品溶液和样品之间的换算，计算得样品中粗多糖的含 量为 11. 28mg/g。实施例2精密称取灵芝螺旋藻片细粉0. 5016g，加入15g的浓度为80%的乙醇水溶液，振荡 搅拌均勻，超声提取20min，离心弃去溶液。沉淀物再加入15g的80%乙醇水溶液，振荡搅拌均勻，超声提取20min，离心弃去溶液。沉淀加入50ml纯化水100°C水浴提取lh，过滤，滤液转移到IOOml容量瓶中，残渣洗涤2次，洗涤溶液一并转移到容量瓶定容，摇勻，作为样品 溶液。吸取Iml样品溶液于20ml的具塞试管中，同测定标准溶液方法制备，用紫外分光光 度仪于490nm处测吸光度A = O. 356，将样品溶液吸光度带入方程式即得到样品溶液中粗多 糖的含量，将mg/ml的单位换算成mg/g，即进行样品溶液和样品之间的换算，计算样品中粗 多糖的含量为11.37mg/g。 尽管以上详细地描述了本发明的优选实施例，但是应该清楚地理解，对于本领域 的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任 何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种灵芝螺旋藻中粗多糖的提取和测定方法，其步骤包括1)称取样品细粉0.5～1.0g，加入30～60倍重量的浓度为80～100％乙醇溶液，振荡搅拌均匀，超声提取20～40min，离心弃去液体；2)将步骤1中得到的沉淀物再加入30～60倍重量的浓度为80～100％的乙醇溶液，振荡搅拌均匀，超声提取20～40min，离心弃去液体；3)将步骤2中得到的沉淀物加入30～100倍重量的纯化水后，在70～100℃的水浴中提取1～3h，过滤，将滤液转移到100ml容量瓶中，再将残渣洗涤2～4次，该多次洗涤的溶液一并转移到容量瓶中定容，摇匀，作为样品溶液，该样品溶液仅含有灵芝螺旋藻中的多糖；4)用硫酸苯酚法测出样品溶液中多糖的含量。
2.如权利要求1所述的灵芝螺旋藻中粗多糖的提取和测定方法，其特征在于所述样品 为灵芝螺旋藻片。
3.如权利要求1所述的灵芝螺旋藻中粗多糖的提取和测定方法，其特征在于所述的乙 醇溶液浓度为80%。
4.如权利要求1所述的灵芝螺旋藻中粗多糖的提取和测定方法，其特征在于所述水浴 温度为100°C。
5.如权利要求1所述的灵芝螺旋藻中粗多糖的提取和测定方法，其特征在于所述硫酸 苯酚法的具体步骤为1)吸取1ml样品溶液置于20ml具塞试管中，加入1.0ml浓度为5%的苯酚溶液，然后 快速加入5. 0ml的浓硫酸，静置lOmin后，振荡并且充分混勻，置30°C水浴中反应20min，使 用紫外分光光度仪于490nm处测吸光度；2)测定标准品溶液精密称取干燥至恒重的葡萄糖或葡聚糖标准品，制成0.lmg/ml的 标准品溶液，分别取0、0. 2ml,0. 4ml,0. 6ml,0. 8ml、1. 0ml体积的该标准品溶液置于20ml具 塞试管中并分别补蒸馏水至1. 0ml,同样再加入1. 0ml浓度为5%的苯酚溶液，然后快速加 入5. 0ml浓硫酸，静置lOmin后，振荡并且充分混勻，置30°C水浴中反应20min，使用紫外分 光光度仪在490nm处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，标准品溶液的浓度为横坐标绘制标 准曲线，得回归方程；3)将步骤1)中得到的样品溶液的吸光度代入回归方程，计算样品溶液中粗多糖的含 量，通过换算可得样品中粗多糖的含量。
全文摘要
一种灵芝螺旋藻中粗多糖的提取和测定方法，精密称量灵芝螺旋藻样品置于大容量离心管中，加入乙醇水溶液混匀，超声提取、离心、弃去溶液；得到的沉淀物再加入乙醇水溶液，震荡混匀，超声提取、离心，沉淀，加水后转移到圆底烧瓶中，沸水浴提取后，过滤，再将滤液定容，以葡萄糖或葡聚糖标准品溶液为对照，采用硫酸苯酚法测定粗多糖的含量。该方法步骤简单并且准确、灵敏度高，特别适用于不含糊精、淀粉等干扰物的灵芝螺旋藻保健食品中粗多糖的提取和测定。
文档编号G01N1/34GK101839863SQ201010109669
公开日2010年9月22日 申请日期2010年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者贾福怀, 邢晓伟, 黄金宝 申请人:宁波御坊堂生物科技有限公司