一种淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备的制作方法

本发明涉及医学领域一种淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备，主要用于急、慢性淋巴细胞白血病融合基因检测方法的质量控制。

背景技术

白血病是一类造血干细胞恶性克隆性疾病，分为急性和慢性，前者又分为急性淋巴细胞性白血病(all，再分为l1、l2和l3)和急性髓性白血病(aml，再分为m1即急性极微分化型原始粒细胞白血病、m2即急性部分分化型原始粒细胞白血病、m3即急性早幼粒细胞白血病、m4即急性粒-单核细胞白血病及m5即急性单核细胞白血病等)，按造血系统可分为粒细胞系(粒系)白血病、淋巴细胞系(淋系)白血病等。

白血病患者因某些染色体发生易位或重排而产生融合基因，如慢性粒细胞白血病(cml)由t(9；22)(q34；q11)易位形成的bcr-abl(90％以上)融合基因、急性早幼粒细胞白血病(apl)由t(15；17)(q22；q22)染色体易位形成的pml-raraα(95％以上)融合基因、急性髓系白血病(aml)最常见的aml1/eto(41％)和pml-rara(23％)融合基因、儿童急性淋巴细胞白血病(all)的el/aml1(占46％)、e2a/pbx1(占20％)、bcr/ablp190、bcr/ablp210、mll/af4融合基因以及成人all患者由于t(9；22)易位而产生的m-bcr/abl和m-bcr/abl融合基因。

总之如bcr-abl、pml-rarα、aml1-eto、cbf-myh11、mllaf4、tel-aml1、e2a-pbx1、ste-can、tls-erg1等都是白血病的常见融合基因，这些基因的检测对白血病的诊断、治疗和预后判断均有重要的作用。这些基因的检测可采用荧光原位杂交、免疫印迹、pcr(rt-pcr、rq-pcr、多重逆转录pcr)、fcm、基因芯片技术及全基因组测序等方法。但有很多因素会影响其检测方法的准确性，harismendy等报道，不同的ngs平台假阳性率高达7.8％，等报道，26％的所检测的基因突变得到不同的解读，11％的检测突变得到完全相反的解读。2016年fda校准项目(precisionfda)用基因测序公司的操作软件“阅读”同一份基因检测样本的dna测序结果，几乎50％的阅读软件无法重复同样的结果。这就需要研制白血病融合基因检测的质量控制物质，以监测、校准检测系统，提高融合基因检测的准确性。

但作为质控物，需在各个实验室与被检标本进行同时检测或预先用于检测方法的校准，需要反复试用，其用量很大，需要产业化制备的条件，所以首先要解决的是如何用有限的来自患者的而且是实验后剩余的骨髓细胞来制备各实验室反复试用的用量问题。申请人认为应该用细胞永生化的方法来解决这个问题。已知eb病毒转染法能解决b淋巴细胞的培养扩增，我们也曾采用eb病毒转染法建立易误诊染色体异常淋巴细胞系并用于淋巴细胞培养和染色体制备的质量控制，但申请人经反复试验，始终未能使eb病毒转染骨髓细胞而获得建系成功，可能是因为eb病毒仅能使成熟b淋巴细胞转化而不能使骨髓细胞转化。申请人发现bodnar等曾报道用端粒酶催化亚单位(htert)转染人体组织细胞，实现了永生化，也发现猴肾病毒的大t抗原(sv40lt)能被用于多种细胞的永生化建株，但经申请人的试验均未使骨髓细胞永生化，申请人经多年的试验、研究和文献检索，终于从单克隆抗体的制备技术中受到启发，发现kohler等曾于1975年将具有抗体产生基因的b淋巴细胞与具有无限扩增性能的骨髓瘤细胞在体外融合，得到兼具骨髓瘤细胞无限繁殖和b淋巴细胞分泌抗体的杂交瘤细胞株，其中来源于b淋巴细胞的抗体产生基因随着杂交瘤的繁殖而扩增，因被用于单克隆抗体的产业化制备而获诺贝尔奖。

申请人受上述单克隆抗体制备方法的启发，拟将含融合基因但不能在体外无限生长的人源骨髓细胞与能在体外无限生长的鼠sp2/0骨髓瘤细胞融合，制备同时植入两细胞全基因组、具有永生化特性的基因移植杂交株，使其中的融合基因随杂交株的无限生长而扩增，进而经杂交株的传代培养、克隆筛选、融合基因验证和克隆化扩增，制备已知融合基因且高度匹配于被测融合基因的人源性同源单克隆质控参考株，用于融合基因的产业化制备、相应融合基因检测的室内质控、室间质评、方法学验证及新方法的创建。

但试验的结果又发现，含有目标融合基因的骨髓细胞融合率较低，所筛选到的含有目标融合基因的杂交细胞较少，所以申请人在骨髓细胞与sp2/0融合前增加了骨髓细胞预培养步骤，并在预培养、细胞融合、克隆筛选及克隆化传代的培养基中加入所需骨髓细胞(含目标融合基因)的分化刺激剂，从而增加了含有目标融合基因的骨髓细胞的融合率。

技术实现要素：

为了解决长期困绕的无淋系白血病融合基因检测质控物的问题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备方法，另一目的是要提供一种淋系白血病融合基因检测的质控参考株。

本发明的目的是这样实现的：以b淋巴细胞刺激因子(blys或baff)为诱导剂，培养淋系白血病患者的骨髓细胞，以增加定向发育的淋系细胞，继之将经培养的人骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞配成混合细胞，以聚乙二醇诱导细胞融合，并在细胞融合、hat筛选、克隆化传代中均以含b淋巴细胞刺激因子的培养基，制备淋系白血病融合基因检测的质控参考株。

较具体的说，以含25～35ng/mlb淋巴细胞刺激因子的骨髓细胞培养基培养含有多种造血干细胞但无法在体外无限传代的淋系白血病患者骨髓细胞24h～48h，然后将经培养的人骨髓细胞与能在体外无限传代的鼠骨髓瘤细胞(sp2/0)以2∶1混合，在30％聚乙二醇融合剂(peg1500)的作用下，使人骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞融合为兼具两细胞成份和特性的杂交细胞，继之以含15～25ng/mlb淋巴细胞刺激因子、2×hat和15％胎牛血清的dmem培养基选择培养，以筛选杂交细胞克隆，然后分别挑取各克隆细胞进行分瓶扩大培养或在6孔板中进行分孔扩大培养，最后分别取适量的来自各克隆的扩增细胞，分别进行融合基因检测，鉴定出含有融合基因的杂交株克隆，进而扩增并制备淋系白血病融合基因检测的质控参考株。

本发明根据已广泛应用但仅局限于单克隆抗体制备的鼠免疫b细胞与鼠骨髓瘤细胞融合的杂交瘤技术，设计了淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备方法。本发明曾试验了以未经培养及经培养的骨髓细胞分别以文献报道的eb病毒转染、猴肾病毒大t抗原基因(sv40lt)转染及端粒酶逆转录酶(htert)转染方法构建能在体外无限传代扩增的永生化骨髓淋巴细胞系，均未获得预期结果，而以未经培养及经培养的骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞进行直接融合，其融合率也达不到预期效果，所以本发明在反复试验及传统杂交瘤技术的基础上，引用了b淋巴细胞刺激因子，增加了以b淋巴细胞刺激因子为诱导剂的骨髓细胞融合前培养步骤，以促使b淋巴细胞系各期细胞的定向分化、增量和成熟，从而增加淋系的融合率，而且b淋巴细胞刺激因子参与了骨髓细胞融合、杂交细胞筛选及其克隆化传代扩增的全程诱导，有利于淋系各期细胞的分化，由此制备出能在体外无限扩增的淋系白血病融合基因检测质控参考株，经融合基因的验证，应用于淋巴细胞白血病融合基因检测的质量控制。

具体实施方式

图1是本发明所制的杂交细胞克隆图。

在图1中，淋系白血病患者的骨髓细胞经b淋巴细胞刺激因子诱导而分化的各期淋巴细胞，在peg的作用下，与鼠骨髓瘤细胞融合后，经hat筛选1～2周，在倒置显微镜下拍摄(40x)，得到杂交细胞克隆图。

下面结合图1，对本发明的实施方案作详细的描述。

1、待融合细胞

(1)待融合的骨髓细胞：留取经确诊并经骨髓细胞学检查后剩余的淋巴细胞白血病患者的骨髓细胞，含有儿童的el/aml1(占46％)、e2a/pbx1(占20％)、bcr/ablp190、bcr/ablp210和/或mll/af4等融合基因，或成人的m-bcr/abl和/或m-bcr/abl等融合基因。

(2)骨髓瘤细胞：鼠sp2/0瘤细胞，购自sigma公司。

2、实验试剂

(1)b淋巴细胞刺激因子：购自sigma公司。

(2)dmem培养基、hat选择培养基和peg购自sigma公司；胎牛血清(fbs)购自gibco公司；dmso(二甲基亚砜)为国产分析纯试剂。

3、细胞融合方法

(1)骨髓细胞融合前的b淋巴细胞刺激因子诱导培养：在传统骨髓细胞培养基中配入25～35ng/mlb淋巴细胞刺激因子，在接种骨髓细胞后轻轻摇匀，置37℃培养24h～48h。设计该步骤的目的是以b淋巴细胞刺激因子为诱导剂，促使骨髓淋巴细胞的分化成熟，以增加淋系各期细胞数量，从而提高淋系细胞的融合率。

(2)骨髓细胞融合前的准备：经b淋巴细胞刺激因子诱导培养的骨髓细胞以dmem培养液(基础培养基)调整总细胞数到1×10⁸～2×10⁸，以台盼兰染色、相差显微镜检查活细胞数，活细胞数高于80％者为合格。

(3)骨髓瘤细胞的准备：融合前一周从液氮罐内取出冻存的骨髓瘤细胞(sp2/0)，立即放入热水解冻。融化后加入适量完全培养液，1000r/m离心3min；重复1次。将沉淀物移入细胞培养瓶中，加dmem培养液，置co2培养箱培养，3～4天进行一次传代或扩大培养，融合前24小时内调整细胞状态，保证融合前细胞形态良好、生长旺盛。融合时将sp2/0从培养瓶上吹下，转入离心管中，1000r/m离心5～10min，重复洗涤细胞2次，轻轻敲打混匀，取少量悬液计数，调整好密度，使融合时的密度为80％左右(应用最多的是sp2/0细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链，细胞的最高生长刻度为9×10⁵/ml，倍增时间通常为10～15h)。

(4)细胞融合：在37℃水浴中轻轻旋转预热离心管，取出后在无菌条件下将预热的1000μl的30％peg3000在60s内沿管壁滴加到融合管中，同时轻轻旋转离心管，之后将预热的25ml基础培养基在3～5min内也沿管壁滴加到离心管中，在加入的过程中轻轻地旋转离心管，然后静置于37℃水浴10min，以1500r/m离心5min，弃去上清，加入50mlhat培养基，适当混匀后接种到96孔培养板中，置于37℃、5％co2培养箱中培养。

4、融合细胞的筛选

观察96孔板中的细胞生长情况，7～10天后仅为有效融合的细胞能够生长，此时弃去hat培养基，更换含有ht的完全培养基，继续培养，可观察到圆形光亮的杂交细胞克隆(图1)。

5、杂交细胞的单克隆筛选和克隆化培养

(1)单克隆筛选(亚克隆法)：当融合细胞克隆生长面积达到1/10个细胞孔时，去除培养液，选择杂交细胞生长状态良好的培养孔，显微镜下标记细胞生长位置、大小，使用无菌枪头在标注的位置将细胞克隆吸取到新的有完全培养基的培养孔内，然后依次倍比稀释到后面数孔，使后面每个孔中的细胞数为0～1个，37℃，5％co2培养箱内培养约1周，显微镜下观察细胞生长情况，待后面(倒数)孔中的细胞克隆长满至孔底面积1/10以上时，选择(倒数)后面孔中的细胞再行单克隆筛选，制备单克隆杂交细胞。

(2)克隆化培养：将经亚克隆筛选的单克隆杂交细胞进行传代培养，使杂交细胞扩增到所需细胞数量，以用于筛选淋巴细胞系杂交株(淋系杂交株)。

6、淋系杂交株的筛选

上述制备的杂交株包括粒细胞系、淋巴细胞系等骨髓细胞与鼠骨髓瘤细胞融合而成的杂交瘤细胞株，需进行目标融合基因检测，筛选出淋巴细胞系杂交株或含el/aml1、e2a/pbx1、bcr/ablp190、bcr/ablp210、mll/af4、m-bcr/abl、m-bcr/abl等融合基因的杂交株。

7、淋系白血病融合基因检测质控参考株的制备

(1)准确检测淋系杂交株的融合基因：这些融合基因的检测方法可采用荧光原位杂交、免疫印迹、pcr(rt-pcr、rq-pcr、多重逆转录pcr)、fcm、基因芯片技术及全基因组测序等，以验证淋系杂交株是否含有el/aml1、e2a/pbx1、bcr/ablp190、bcr/ablp210、mll/af4、m-bcr/abl、m-bcr/abl等融合基因以及其含量。

(2)分装和冻存：根据目标融合基因的类型，分别配制、分装质控参考株，作为融合基因检测的质控参考株，置-196℃液氮中冻存备用。

8、质控参考株的稳定性监测

(1)定期检测：每隔1个月取3支冻存的质控参考株，按上述第7步进行目标融合基因的准确检测，验证目标融合基因的稳定性。

(2)质控参考株的定期培养：每隔1个月取3支冻存的质控参考株，进行复苏培养，观察细胞的存活率及传代培养情况，传5-10代后按上述第7步进行目标融合基因的检测，验证目标融合基因的稳定性，稳定者继续冻存。

9、质控参考株的应用

(1)用于融合基因检测的室内质控：①判断检测结果的准确性：选择2株质控参考株，与疑含相同目标融合基因的被测标本在相同条件下检测，如果质控参考株所含有的已知目标融合基因被检出，而不含有的目标融合基因不被检出，说明检测系统处于质控在控状态，同批次的同类目标融合基因检测结果可靠，可发出报告；②绘制基因检测的室内质控图：将参考株的目标融合基因作为阳性对照，非目标融合基因作为阴性对照，将每批次的阳性和阴性对照检测结果记录在直观的室内质控图上，以监测检测方法的稳定性及是否在控。

(2)校准检测平台：根据质控参考株的室内质量控制结果，如果发现检测系统并非处于质控在控状态，则应查找失控原因，包括校准或更换检测仪器或试剂等。

10、b淋巴细胞刺激因子的使用效果验证

分别以不含b淋巴细胞刺激因子的传统骨髓培养基和本发明含有b淋巴细胞刺激因子的骨髓培养基在其他条件相同的情况下进行骨髓细胞融合前培养、骨髓细胞融合、单克隆筛选，并对筛选的克隆进行淋系融合基因检测，以能检出el/aml1、e2a/pbx1、bcr/ablp190、bcr/ablp210、mll/af4、m-bcr/abl和/或m-bcr/abl融合基因的克隆作为淋巴细胞杂交株克隆。结果发现，经本发明含有b淋巴细胞刺激因子诱导培养的骨髓细胞的淋巴细胞系融合率明显增加。如表1所示，3例骨髓细胞标本分别经本发明所述的方法实验，结果以b淋巴细胞刺激因子诱导培养的骨髓细胞经细胞融合、克隆筛选及淋系融合基因鉴定，发现能检出相应融合基因的克隆数量总共为75个，而未以b淋巴细胞刺激因子诱导培养的骨髓细胞经细胞融合、克隆筛选及淋系融合基因鉴定，发现能检出相应融合基因的克隆数量总共为28个，两者有明显的差别，说明b淋巴细胞刺激因子能在骨髓细胞培养中刺激淋系的定向分化，并能提高淋系的融合率。

表1骨髓细胞的b淋巴细胞刺激因子(baff)诱导培养对淋巴细胞系融合率的影响