本发明涉及微生物发酵技术领域，更具体地，涉及一种鸭疫里默氏杆菌的发酵工艺。
背景技术
鸭疫里默氏杆菌(ra)会引起鸭疫里默氏杆菌病，是一种接触性传染性疾病，又称为鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭败血症、鸭疫综合症、鸭疫巴氏杆菌病等。多见于1-8周龄的小鸭，呈急性或慢性败血症，临诊上主要表现为眼和鼻分泌物增多、喘气、咳嗽、下痢、共济失调和头颈震颤，少数慢性病例出现头颈歪斜等症状。在病变上以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎及部分病例出现关节炎为特征，常引起小鸭的大批发病和死亡。我省自1982年郭予强首次报道本病以来，目前已成为危害肉鸭养殖业的一种最常见细菌病。
目前，鸭疫里默氏杆菌病的防控方法主要为疫苗接种和药物防治，广泛应用疫苗是预防该病的有效措施。国内已有多家灭活疫苗问世，应用于养殖生产，未见关于鸭传染性浆膜炎弱毒活疫苗研究的报道，也未见该类疫苗产品问世。
研制一种安全有效的预防鸭传染性浆膜炎的弱毒疫苗对我国养鸭业的发展具有重要意义。在疫苗制备中，抗原浓度是影响疫苗质量和免疫保护效果的关键因素，因此，优化鸭疫里默氏杆菌的培养条件提高有效抗原产量对制备疫苗非常必要。目前，鸭疫里默氏杆菌的大规发酵工艺的匮乏严重制约了鸭疫里默氏杆菌弱毒疫苗的研究和生产。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服上述现有技术的不足，提供一种培养密度高、效率高、重复性好、可操作性好的鸭疫里默氏杆菌弱毒株的发酵工艺。
本发明的第一目的是提供一种用于鸭疫里默氏杆菌弱毒株发酵培养的培养基。
本发明的第二目的是提供所述的培养基在培养发酵鸭疫里默氏杆菌弱毒株方面的应用。
本发明的第三目的是提供一种鸭疫里默氏杆菌弱毒株的发酵工艺。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明要求保护一种用于鸭疫里默氏杆菌弱毒株发酵培养的培养基，每升培养基含胰蛋白胨17～18g、大豆蛋白胨7～8g、酵母提取物7～8g、葡萄糖2～3、磷酸氢二钾2～3g、氯化钠4～6g。
优选的，每升培养基含胰蛋白胨17.5g、大豆蛋白胨7.5g、酵母提取物7.5g、葡萄糖2.5g、磷酸氢二钾2.5g、氯化钠5.0g。
一种鸭疫里默氏杆菌弱毒株的发酵工艺，包括以下步骤：
s1.制备鸭疫里默氏杆菌生产种子液；
s2.将生产种子液接种在以上所述培养基中培养，控制培养过程中溶解氧值为10～40%，发酵罐培养转速为100～200r/min，发酵时间为7～8小时。
优选地，步骤s2中，发酵罐培养，溶解氧值为20%。
优选地，步骤s2中，发酵罐培养，发酵罐培养转速为150r/min。
优选地，步骤s2中，发酵罐培养，发酵时间为8小时。
优选地，步骤s1中，制备鸭疫里默氏杆菌生产种子液的方法为：
挑选鸭疫里默氏杆菌单菌落接种于4～6%新生牛血清的以上所述培养基中，置36.5～37.5℃振荡培养16～20小时；取样，按体积比1～2%接种于4～6%新生牛血清的以上所述培养基中，调整转速为150～170r/min，置37℃振荡培养12～14小时作为种子液。
优选地，步骤s2中，将生产种子液接种在培养基中用发酵罐培养，包括以下步骤：
s21.在发酵容器（如发酵罐）中加入ph7.4～7.6的所述培养基及消泡剂，灭菌，自然降温；
s22.将发酵罐中的权利要求1所述培养基及消泡剂预热36.5～37.5℃，加入4～6%新生牛血清、1～2%种子液；
s23.培养温度为36.5～37.5℃，在发酵过程中通过调节通气量使溶氧维持在溶解氧值为10～40%，发酵罐培养转速为100～200r/min，发酵时间为7～8小时。
优选地，鸭疫里默氏杆菌为1型鸭疫里默氏杆菌。
优选地，鸭疫里默氏杆菌为鸭疫里默氏杆菌弱毒菌株。
优选地，鸭疫里默氏杆菌为1型鸭疫里默氏杆菌弱毒菌株。
最优选地，一种1型鸭疫里默氏杆菌的发酵工艺，包括以下步骤：
s1.挑选鸭疫里默氏杆菌单菌落接种于4～6%新生牛血清的所述培养基中，置36.5～37.5℃振荡培养16~20小时；按体积比1～2%接种于4～6%新生牛血清的以上所述培养基中，调整转速为150～170r/min，置36.5～37.5℃振荡培养12~14小时作为种子液；
s2.在发酵容器中加入ph7.4～7.6的所述培养基及消泡剂，灭菌，自然降温；将发酵罐中的所述培养基及消泡剂预热36.5～37.5℃，加入4～6%新生牛血清、1～2%种子液；培养温度为36.5～37.5℃，在发酵过程中通过调节通气量使溶氧维持在溶解氧值为20%，发酵罐培养转速为150r/min，发酵时间为8小时。
最优选地，包括以下步骤：
s1.挑选鸭疫里默氏杆菌单菌落接种于5%新生牛血清的所述培养基中，置337℃振荡培养16~20小时；按体积比1%接种于5%新生牛血清的以上所述培养基中，调整转速为160r/min，置37℃振荡培养12～14小时作为种子液；
s2.在发酵容器中加入ph7.4～7.6的所述培养基及消泡剂，灭菌，自然降温；将发酵罐中的所述培养基及消泡剂预热37℃，加入5%新生牛血清、1%种子液；培养温度为37℃，在发酵过程中通过调节通气量使溶氧维持在溶解氧值为20%，发酵罐培养转速为150r/min，发酵时间为8小时。
由于弱毒菌株相对于普通菌株更难培养，因此一般发酵工艺所得活菌数较低，活性较差。发明人通过对培养基的筛选及培养基的主要成分的进一步优化，得到了适合1型鸭疫里默氏杆菌的培养基及其培养方式，以及发酵工艺的严格控制，对于鸭疫里默氏杆菌弱毒菌株的发酵培养具有很好的效果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种鸭疫里默氏杆菌的发酵工艺，对1型鸭疫里默氏杆菌sg株进行发酵培养，1型鸭疫里默氏杆菌sg株在发酵8小时活菌数达到高峰，收获时每ml菌液含活菌数≥1.0×1010cfu，4℃放置2天菌液的存活率≥75%。
而且，本发酵工艺发酵培养密度高、效率高、重复性好、可操作性好、有很大的推广价值，可有效提高抗原产量和培养基的利用率，缩短生产周期，降低生产成本，减少劳动强度，提高生产效率，为鸭疫里默杆菌弱毒疫苗生产提供了一种有效可行的抗原制备工艺。本研究通过优化鸭疫里默杆菌弱毒株发酵培养条件，提高抗原产量，为研制高效疫苗打好基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
以下实施例所用材料如下：
菌株：1型鸭疫里默氏杆菌sg株，由广东省农业科学院动物卫生研究所寄生生物学研究室分离、鉴定并保存。
试剂：胰蛋白胨、酵母提取物，oxoid产品；革兰氏染色液、微量生化鉴定管、纯粹检验用培养基、大豆蛋白胨、琼脂粉，广东环凯微生物科技有限公司产品；葡萄糖、氯化钠、磷酸氢二钾，生工生物工程（上海）股份有限公司产品；新生牛血清，广州蕊特生物科技有限公司产品。
培养基的配制：
tsa培养基：胰蛋白胨17.0g、大豆蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、葡萄糖2.5g、磷酸氢二钾2.5g、氯化钠5.0g、琼脂粉20.0g，将上述物质溶于双蒸水中定容至1l，调整ph值至7.5，混匀后分装，121℃高压灭菌30分钟，待其自然冷却至40～50℃，加入5%新生牛血清，混匀后制成平板。
主要仪器：紫外可见分光光度计(型号为du®730)，购自贝克曼公司，bf型生物反应器（5l），购自广州齐志生物工程设备有限公司。
实施例1培养基筛选种子液的制备
1、菌种的复苏
取冻干保存的1型鸭疫里默氏杆菌sg株菌种，用含5%新生牛血清的tsb培养基溶解后，划线接种于tsa培养基，置37℃培养36~48小时，观察菌落形态，挑选符合标准的典型菌落。
2、种子液的制备
挑选1型鸭疫里默氏杆菌sg株典型单菌落接种于4～6%新生牛血清的tsb培养基中，置36.5～37.5℃振荡培养16～20小时。取样，按体积比1～2%接种于4～6%新生牛血清的tsb培养基中，调整转速为150～170r/min，置36.5～37.5℃振荡培养12～14小时作为种子液。
实施例2培养基筛选
1、实验操作
分别配制ph7.4~7.6的tsb培养基、p-l肉汤、改良马丁培养基，使用前加入4～6%新生牛血清、1～2%实施例1制备的种子液，140～160r/min、36.5～37.5℃振荡培养，分别从培养4小时开始每小时取样参考现行《中华人民共和国兽药典》方法用tsa培养基进行活菌计数。
2、结果
1型鸭疫里默氏杆菌sg株在tsb培养基中生长最佳，在p-l肉汤培养基中生长次之，在改良马丁培养基中生长最慢。在tsb培养基、p-l肉汤、改良马丁培养基中，sg株生长8小时活菌数分别为1.01×1010cfu/ml、0.56×1010cfu/ml、0.15×1010cfu/ml（表2）。因此确定1型鸭疫里默氏杆菌sg株生长的最适培养基为tsb培养基。
表11型鸭疫里默氏杆菌gd12株在不同培养基中的培养结果
实施例3培养基优化正交试验
1、实验操作
运用正交试验设计，选取tsb培养基中主要的4种营养成分胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖为因素，每个因素3个水平制定正交试验对tsb培养基进行优化，见表2。
表2四因素三水平正交试验表：
注：胰蛋白胨1-3分别为1.5，1.75，2.0g；大豆蛋白胨1-3分别为0.5，0.75，1.0g；酵母提取物1-3分别为0.25，0.5，0.75g；葡萄糖1-3分别为0.25，0.5，0.75g。其他成分为：磷酸氢二钾2.5g、氯化钠5.0g，将上述物质溶于双蒸水中定容至1l，调整ph值至7.5，混匀后分装，121℃高压灭菌30分钟。
采用具有在线控制ph和溶解氧（do）的5l发酵罐进行发酵培养。每次试验加入培养基（ph7.4～7.6）及消泡剂，121℃灭菌30min，自然降温。使用前预热到36.5～37.5℃，加入4～6%新生牛血清、1～2%实施例1制备的种子液。培养温度为36.5～37.5℃，初始通气量为3l/min，转速为140～160r/min，在发酵过程中通过调节通气量使溶氧维持在20%。培养10小时，自4小时开始每隔1小时取样，参考现行《中华人民共和国兽药典》方法用tsa培养基进行活菌计数。
2、实验结果
发酵不同时间各组cfu测定结果见表3，正交实验组别序号5的培养基发酵培养的菌液活菌数最高，在发酵8h可达1.22×1010cfu/ml。此组培养基配方是：每升培养基含胰蛋白胨17.5g、大豆蛋白胨7.5g、酵母提取物7.5g、葡萄糖2.5g、磷酸氢二钾2.5g、氯化钠5.0g。
表3发酵不同时间各组活菌数的测定结果：
实施例4一种鸭疫里默氏杆菌发酵培养的培养基
每升培养基含胰蛋白胨17.5g、大豆蛋白胨7.5.0g、酵母提取物7.5g、葡萄糖2.5g、磷酸氢二钾2.5g、氯化钠5.0g，调整ph值至7.5，混匀后分装，121℃高压灭菌30分钟
实施例5一种鸭疫里默氏杆菌发酵培养的培养基
每升培养基含胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨7g、酵母提取物7g、葡萄糖2g、磷酸氢二钾2g、氯化钠4g，调整ph值至7.5，混匀后分装，121℃高压灭菌30分钟。
实施例6一种鸭疫里默氏杆菌发酵培养的培养基
每升培养基含胰蛋白胨18g、大豆蛋白胨8g、酵母提取物8g、葡萄糖3g、磷酸氢二钾3g、氯化钠6g，调整ph值至7.5，混匀后分装，121℃高压灭菌30分钟。
实施例7发酵罐培养do（溶解氧）值的优化
1、实验操作
采用具有在线控制ph和溶解氧（do）的5l发酵罐进行发酵培养。按5l发酵罐加入适量实施例2的培养基（ph7.4～7.6）及消泡剂，121℃灭菌30min，自然降温。使用前预热到36.5～37.5℃，加入4～6%新生牛血清、1～2%实施例1制备的种子液。培养温度为36.5～37.5℃，初始通气量为3l/min，转速为140～160r/min，在发酵过程中通过调节通气量使溶氧分别维持在10%、20%、40%。培养10小时，自2小时开始每隔1小时取样，参考现行《中华人民共和国兽药典》方法用tsa培养基进行活菌计数。
2、实验结果
结果表明，当do值分别维持在10%、20%、40%时，sg株发酵8小时活菌数分别为1.08×1010cfu/ml、1.29×1010cfu/ml、0.97×1010cfu/ml（表4）。因此，最适1型鸭疫里默氏杆菌sg株发酵的do值为20%。
表41型鸭疫里默氏杆菌sg株在不同do值发酵培养的活菌计数结果：
实施例8发酵罐培养转速的优化
1、实验操作
采用具有在线控制ph和溶解氧（do）的5l发酵罐进行发酵培养。按5l发酵罐加入适量实施例2的培养基（ph7.4～7.6）及消泡剂，121℃灭菌30min，自然降温。使用前预热到36.5～37.5℃，加入4～6%新生牛血清、1～2%实施例1制备的种子液。培养温度为36.5～37.5℃，初始通气量为3l/min。在发酵过程中通过调节通气量使do值维持在20%，分别以转速100r/min、150r/min、200r/min进行发酵培养。培养10小时，自2小时开始每隔1小时取样，参考现行《中华人民共和国兽药典》方法用tsa培养基进行活菌计数。
2、实验结果
结果表明，结果表明，当转速为150r/min时，1型鸭疫里默氏杆菌sg株生长最佳。当转速分别为100r/min、150r/min、200r/min时，sg株发酵8小时活菌数分别为9.8×109cfu/ml、1.19×1010cfu/ml、1.01×109cfu/ml（表5）；因此，选择150r/min为1型鸭疫里默氏杆菌sg株最适发酵培养转速。
表51型鸭疫里默氏杆菌sg株不同转速发酵培养的活菌计数结果：
实施例9收获时间确定
1、实验操作
在50l发酵罐中加入10l实施例2的培养基（ph7.4～7.6）及消泡剂，121℃灭菌30min，自然降温。使用前预热到36.5～37.5℃，加入4～6%新生牛血清、1～2%实施例1制备的种子液。培养温度为36.5～37.5℃。在发酵过程中通过调节通气量使do值维持在20%，150r/min，发酵培养1型鸭疫里默氏杆菌sg株3批。培养10小时，自4小时开始每隔1小时取样，参考现行《中华人民共和国兽药典》方法用tsa培养基进行活菌计数。根据活菌计数结果确定1型鸭疫里默氏杆菌sg株发酵培养的收获时间。
2、实验结果
结果表明，3批1型鸭疫里默氏杆菌sg株培养物均在发酵8小时活菌数达到高峰，活菌数分别为1.26×1010cfu/ml、1.18×1010cfu/ml、1.21×1010cfu/ml（表6）。因发酵8小时1型鸭疫里默氏杆菌sg株生长已经到平台期，考虑到生产需要，确定发酵7～8小时为最佳菌液收获时间，且收获时每ml菌液含活菌数≥1.0×1010cfu。
表61型鸭疫里默氏杆菌sg株不同时间发酵培养的活菌计数结果：
实施例10一种鸭疫里默氏杆菌的发酵工艺
1、实验操作
在50l发酵罐中加入10l实施例2的培养基（ph7.4～7.6）及消泡剂，121℃灭菌30min，自然降温。使用前预热到36.5～37.5℃，加入4～6%新生牛血清、1～2%实施例1制备的种子液。初始通气量为3l/min，培养温度为36.5～37.5℃。在发酵过程中通过调节通气量使do值维持在20%，150r/min，发酵培养1型鸭疫里默氏杆菌株3批，发酵7～8小时收获菌液。
将收获的菌液参考现行《中华人民共和国兽药典》方法用tsa培养基进行活菌计数。将菌液降温至2～8℃保存，分别在保存第1日和第2日取样进行活菌计数。
2、实验结果
结果显示（表7），收获时每ml菌液含活菌数≥1.0×1010cfu，收获的菌液在4℃放置后细菌的活菌数会降低，4℃放置2天细菌存活率分别为收获当天活菌数的75%、77%、77%，因此，确定4℃放置2天菌液的存活率较高，均≥75%。
表7菌液收获时及4℃放置2天的活菌计数结果：