一种裸花紫珠DNA条形码标准检测序列及其应用的制作方法

本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及一种裸花紫珠条形码标准检测序列及其在物种鉴定中的应用。

背景技术：

裸花紫珠(callicarpanudiflorahook.exarn.)为马鞭草科(verbenaceae)紫珠属植物，主产于我国海南，是一种海南地道药材，我国广东、广西也有分布。紫珠属植物有一百多个品种，如紫珠、大叶紫珠等。因此，对裸花紫珠的鉴定是入药的基础。目前，传统的形态学鉴定方法非常容易受到物种本身在生长过程中环境、遗传等诸多因素的影响；且在加工炮制过程中形态被严重破坏，因此，运用传统的形态学方法来鉴定裸花紫珠品种有一定的不足，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。

dna条形码技术(dnabarcoding)是通过对一个标准目的基因的dna序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。其中线粒体基因细胞色素c氧化酶1号基因(coi)由于具有较高的进化速率已成为区分物种和研究物种进化关系的一种理想基因。因此,利用coi基因对裸花紫珠进行物种鉴定是一种较好的方法。研究表明dna条形码可以广泛应用于生物的分类和鉴定，是一种简便、高效、准确的物种鉴定技术，不仅可弥补传统鉴定方法的缺陷，还因其更客观、准确，突破对以往经验的依赖，能够鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种等。运用dna条形码技术，可以很好的对裸花紫珠的品种进行快速、有效的鉴定。

目前尚未公开裸花紫珠dna条形码鉴定方法，本发明提供的一种关于裸花紫珠dna条形码标准检测序列及分子鉴定的方法，有利于实现裸花紫珠的快速准确鉴定，缩短鉴定时间。

技术实现要素：

本发明的目的为提供一种裸花紫珠dna条形码标准检测序列及其在物种鉴定中的应用，能弥补目前以形态学鉴定裸花紫珠方法存在的缺陷，提高裸花紫珠鉴定结果的准确度，易于操作、灵敏度高。本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种裸花紫珠dna条形码标准检测序列，所述条形码标准检测序列为coi基因，其序列如seqidno:1所示：

tgcagaatcccgtgaaccatcgagtctttgaacgcaagttgcgcccgaagccattaggccgagggcacgtctgcctgggcgtcacgcatcgcgtcgcccccctccagcgcacagcgctcgcgaggggggcggagactggcctcccgtgcgcctacgtcgcgcgcggccggcccaaatgcgatccctcggcgacgcacgtcacgaccagtggtggttgaacaacgctcaactctcgtgctgtcgtgcggcaccgcgtcgtccgttcgggcatcaccaacgacccaagggcgcgtgcaccgcgccttcgaccgcgaccccaggtcaggcgggatcacccgctgagtttaagcatatcaataagcggaggaaaagaaacttacgaggattcccctagtaacggcgagcgaaccgggaatagcccaacttgagaatcgggcggccacgccgtccga。

同时，本发明还提供裸花紫珠dna条形码标准检测序列在鉴定裸花紫珠中的应用。

另外，本发明提供一种裸花紫珠的dna条形码分子鉴定方法，包括如下步骤：

(1)从待测的裸花紫珠组织中分离提取dna；

(2)以步骤(1)所得的dna为模板用一对引物，通过聚合酶链式反应扩增出裸花紫珠coi基因；

(3)将步骤(2)所得聚合酶链式反应扩增出的coi基因产物用1％～2％琼脂糖电泳分离鉴定扩增产物大小，若出现明显清晰的452bp大小的条带，且无杂带，则进行测序分析；

(4)根据测序结果，进行分析比对，如果与上述的基因序列seqidno.1的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为裸花紫珠来源。

其中，步骤(2)中引物的dna的序列为：

its2f：5'-atgcgatacttggtgtgaat-3'；

its3r:5'-gacgcttctccagactacaat-3'。

其中，步骤(2)中所述聚合酶链式反应的扩增条件为94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环，72℃延伸10min。

本发明的有益效果：本发明提供了一种用于鉴定裸花紫珠的dna条形码标准检测序列及其应用，与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现裸花紫珠的分子鉴定，提高裸花紫珠鉴定结果的准确度，易于操作、灵敏度高。

附图说明

图1是用coi引物扩增裸花紫珠的电泳检测图谱，其中泳道m为dnamarker，最右侧泳道为阴性对照，泳道1,3,6,7,8,10,11,12,15,18为依次为样品1,3,6,7,8,10,11,12,15,18。

图2：测序结果截图。

图3：序列比对结果截图。

图4：blast比对结果截图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明：

实施例1：

1、裸花紫珠标本的采集：

2.dna提取：裸花紫珠鲜叶dna提取采用magenhipureplantdnaminikit，操作步骤如下：

(1)用液氮将叶片样品磨成粉末，转移120—150mg粉末至1.5ml离心管中。

(2)立即加入(65℃预热)600μlbufferplt(加入pvp-40干粉至bufferptl中，终浓度为2％(w/v)颠倒混匀；再加入2-巯基乙醇至bufferptl中，终浓度为2％)和5μlrnasesolution至样品中。剧烈涡旋混匀，65℃水浴30min，期间混匀3次。

(3)加入600μl氯仿/异戊醇(24:1)，颠倒混匀50次。

(4)室温下，12000×g离心5min。

(5)转移上清液至新的1.5ml离心管中，加入1.5倍体积的bufferpbd(已用无水乙醇稀释)至上清中，涡旋混匀15s。

(6)把gdna柱装到收集管中，转移一半体积的混合液至柱子中。12000×g离心1min。

(7)倒弃滤液把柱子装回收集管，把剩余混合液转移至柱子中。12000×g离心1min。

(8)倒弃滤液把柱子装回收集管，加入500μlbuffergw1(已用无水乙醇稀释)至柱子中。12000×g离心1min。

(9)倒弃滤液把柱子装回收集管，加入650μlbuffergw2(已用无水乙醇稀释)至柱子中。12000×g离心1min。

(10)倒弃滤液把柱子装回收集管，12000×g离心2min去除柱中残留乙醇。

(11)将柱子转移至新的1.5ml离心管中，加入50μl预热到65℃bufferae至柱子的膜中央，室温静置3min，12000×g离心1min。

(12)丢弃dna结合柱，把dna保存于-20℃。

3、引物合成：本实施例所用引物如下：

its2f：5'-atgcgatacttggtgtgaat-3'

its3r:5'-gacgcttctccagactacaat-3'

4、pcr扩增本实施例的pcr反应体系如下：

pcr反应体系为：50μl

ddh2o29.6μl

10×pcrbuffer5μl

dntpmixture4μl

taq酶0.4μl

its2f/its3r(10μm)各1μl

dna模板10μl

5、pcr反应程序为：

94℃预变性3min

94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40个循环

72℃延伸10min。

6、琼脂糖电泳验证pcr结果琼脂糖电泳显示1,3,6,7,8,10,11,12,15,18样品扩增良好，得到长度为452bp的条带清晰无杂质，(见附图1)，可直接进行测序分析。

7、基因序列测定将测序结果(见附图2)用codoncodealigner生物软件，将序列导入，将引物剪切后将序列组装，然后跟seqidno.1进行比对(见附图3)，将输出序列与ncbi上裸花紫珠its2序列进行blast比对(见附图4)，根据比对结果，1,3,6,7,8,10,11,12,15,18批的样品跟seqidno.1同源率99％，为裸花紫珠。

本发明所阐述的实施例并不是对本发明的限定，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，任何本领域技术人员根据常规手段可以预见或者微调的变化和改进，均落入本发明的保护范围内。