可用于对水稻根部进行改良的特异表达启动子及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种水稻特异表达启动子的分离鉴定和应用。

背景技术

高等生物的生长发育是不同基因在时间和空间上有序表达和协同作用的过程。启动子是基因上游的一段核苷酸序列，通过和转录因子的相互作用进而决定了其下游基因的表达模式与表达强度。因此，启动子是一个重要的基因表达调控元件，被称为基因表达的“开关”。基因启动子主要分为三种类型：组成型启动子、组织特异性启动子与诱导型启动子。

近年来，植物基因工程的研究取得了突飞猛进的进展，已经成为作物遗传改良和基因功能研究中的一项重要方法和手段。在研究中，经常用组成型表达启动子来驱动目的基因表达。组成型启动子虽然能驱动外源基因高强度的表达，但这种超表达没有时间与空间的限制，往往打破了植株原本的生长代谢平衡，会造成大量异源蛋白的积累，造成了植物生长过程中的能量浪费，阻碍植物的正常生长，甚至导致不育和死亡。组织特异性启动子能够驱动外源基因在特定组织中表达和积累，避免植物体内不必要的营养浪费，减少对植物生长的副作用，增加转基因效果，因此具有一定的应用价值。组织特异性启动子的开发利用从而成为基因工程研究的一个热点。

根据植物组织的划分，组织特异性启动子相应的可分为根、茎、叶、花等特异性启动子。根是植物中吸收水分和营养物质的组织，其功能和形状对植物生长发育起着重要作用。目前在植物中已有少数的根特异性启动子被克隆并应用于基因功能的研究，但数目仍较少，并且在一个载体中重复使用同一个启动子易造成转基因沉默，且启动子在应用时往往受到种属差异的影响，造成效果不理想。因此，有必要去发展更多的水稻等禾谷科作物的内源性根特异型启动子，为作物遗传改良应用提供启动子储备。

技术实现要素：

本发明提供一种水稻特异表达启动子，其特征在于，所述水稻特异表达启动子提取自水稻属植物。

优选地，所述水稻特异表达启动子包含：

1)序列表中seqidno：1或2所示的dna序列；或者

2)在严格条件下与含有1)中的dna序列杂交后具有启动子功能的dna序列；或者

3)与1)或2)限定的dna序列具有70％-75％的同源性，且具有启动子功能的dna序列；或者

4)与1)或2)限定的dna序列具有75％-80％的同源性，且具有启动子功能的dna序列；或者

5)与1)或2)限定的dna序列具有80％-85％的同源性，且具有启动子功能的dna序列；或者

6)与1)或2)限定的dna序列具有85％-90％的同源性，且具有启动子功能的dna序列；或者

7)与1)或2)限定的dna序列具有90％-95％的同源性，且具有启动子功能的dna序列；或者

8)与1)或2)限定的dna序列具有95％以上的同源性，且具有启动子功能的dna序列；或者

9)在seqidno:1或2中所示的核苷酸序列中添加一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列；或者

10)在seqidno:1或2中所示的核苷酸序列中去除一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列；或者

11)在seqidno:1或2中所示的核苷酸序列中取代一个或多个核苷酸后所获得的具有启动子功能的核苷酸序列。

优选地，所述水稻特异表达启动子为水稻特异表达启动子posro5。

另一方面，本发明提供一种所述的水稻特异启动子在调控基因在水稻根特异性表达中的应用。

另一方面，本发明提供一种获取用于转基因植物培育的宿主菌的方法，其特征在于，所述方法包括将包含权利要求3所述的水稻特异表达启动子转入根癌农杆菌。

另一方面，本发明提供一种获取用于转基因植物培育的转化子的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求3所述水稻特异表达启动子posro5转入大肠杆菌xl-blue感受态细胞中，经菌落pcr筛选获得阳性克隆，将所获得的阳性克隆和植物载体构建植物表达载体，再将所述植物表达载体转入根癌农杆菌，并利用所述根癌农杆菌通过介导方法获得转基因植物细胞、组织、器官或植株。

另一方面，本发明提供一种所述的水稻特异表达启动子posro5在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将权利要求3所述的水稻特异表达启动子posro5连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育，优选地，所述待表达基因为具有改善水稻根性状。

另一方面，本发明提供一组扩增所述的水稻根特异性强表达启动子posro5的全部或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seqidno：3所述，所述反向引物的核苷酸序列如seqidno：4所示。

本发明一个实施例提供水稻根特异表达启动子posro5，该启动子来自于粳稻品种日本晴基因组中hkt2:1基因(ncbi登录号：os06g0701700)转录调控区，是一段位于转录起始位点上游1485bp的dna，序列如seqidno:1显示。

本发明还提供一种重组表达载体，其特征在于为在植物表达载体的多克隆位点插入所述的水稻根表达启动子序列得到的重组质粒，所述核苷酸序列连接于载体中待表达基因序列的上游。在一种实现方式中，所述待表达的基因为gus基因。该重组表达载体为将seqidno:1所示的序列即posro5或启动子posro5，构建于pcambia1381中得到的重组表达载体，本文中称为pcambia1381-posro5。或者待表达基因可以为任何对水稻根组织具有改善功能的基因。在本发明中，利用gus基因的表达情况来鉴定该启动子的功能。

优选地，所述待表达基因为具有改善水稻根组织性状能力的基因。

另一方面，本发明提供一种所述的水稻根表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所述应用包括：将所述水稻根表达启动子连接于载体中待表达的基因序列上游，从而构建重组表达载体；将所述重组表达载体转化到水稻细胞、组织或器官中进行培育。

进一步地，所述应用用于改良水稻生长特性，特别是根部的生长及改良。

技术效果

本发明的目的是从水稻中克隆根特异启动子posro5，并利用转基因技术进行功能验证，同时分析该基因在水稻中的组织表达模式。将本发明所述的启动子序列用于取代组成型启动子，驱动目的基因在水稻的根部位特异性表达，增加转基因的效果，避免不必要的物质能量浪费，有效改良水稻的根部特性，培育出理想的转基因水稻品种。因此该启动子在实际应用中具有显著价值。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1，表达载体pcambia1381-posro5构建。

图中，(a)为本发明对pcambia1381-posro5表达载体进行酶切验证的结果示意图。

(b)pcambia1381-posro5载体示意图，其中，posro5位于gus基因上游。

图2，对获得的posro5：：gus转基因阳性水稻植株进行gus染色结果，a、b和c分别表示幼苗的根、叶和茎。

图3为实施例2中psubs3启动子构建于pcambia1381载体质粒中的示意图；

图4为实施例2中的gus染色结果示意图；

图5为水淹处理前后的对比示意图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

根特异性表达启动子的获得及表达载体构建

(1)、启动子posro5的克隆

根据ncbi中提供的水稻品种日本晴(oryzasativalcv.nipponbare)全基因组序列，利用primer5引物设计软件依据序列表中seqidno.1所示序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点，引物序列如下：

fp：ggatccacccccttaatcaaaaacaaca

rp:gtcgacttgatgcaaaggagcaacgagc

其中ggatcc碱基为限制性内切酶bamhi的识别位点及保护碱基；gtcgac碱基为限制性内切酶sali的识别位点及保护碱基。

以水稻基因组dna为模板，采用kod高保真聚合酶进行pcr扩增。反应体系(50μl)如下。扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。

(2)、加ploya及连接t载体

回收pcr产物，为其加上polya尾并连接t载体，获得克隆载体。

加a体系：3.175μl回收产物和1.825μl的加a混合物(5×taqbuffer2μl，25mmmgcl20.5μl，100mmdatp0.5μl，taqpolymerase0.25μl)置于72℃，反应30min。

连接t载体：4μl的加a产物和1μl的t载体，置于25℃反应30min，即得到目的产物，后将产物转入大肠杆菌感受态。

(3)、转化大肠杆菌感受态细胞

①将加a连接t载体的连接液转入含100μl感受态细胞的1.5mleppendorf管中，冰上放置30min；

②42℃热激90s后，立即冰浴2min；

③加入lb液体培养基500μl，置于37℃摇床振荡培养1h(120r/min)，使细菌恢复正常生长状态；

④取上述菌液100μl涂布于含氨苄青霉素的lb筛选平板上，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿进行培养，37℃培养16～24h。

⑤挑选菌落pcr及酶切验证正确的克隆送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序分析，获得候选基因的启动子。

(4)、启动子表达载体的构建

分别用相应的双酶切后回收启动子片段和线性化处理的pcambia1381质粒。用t4连接酶连接回收的目的片段及线性化载体(1μl10×t4ligasebuffer，1μlt4ligase，2μl线性化载体，6μl目的片段)，pcr和双酶切验证菌落，获得相应启动子的表达载体。

(5)、表达载体转化根癌农杆菌eha105

①取10μl表达载体质粒dna加入从超低温冰箱取出的农杆菌感受态细胞，混匀后冰浴30min；

②用液氮速冻1min；

③加入1mllb培养基，28℃120r/min培养4h；

④4000r/min离心1min，弃上清；加150μllb培养基重悬，将菌液涂布与含50μg/mlkan和10μg/mlrif的lb固体平板；

⑤28℃培养2～3d至单菌落长出，进行菌落pcr鉴定。

⑥挑取阳性克隆，用50％甘油(1：1)保存。

农杆菌介导的水稻遗传转化

(1)愈伤组织诱导消毒后的种子用无菌水在30℃黑暗条件下浸泡过夜，用解剖刀将胚剥下置于诱导培养基上。每皿(规格为100×25mm的一次性塑料培养皿，内含50ml诱导培养基)均匀放置12个胚，在30℃黑暗条件下放置2～3周诱导愈伤组织，至长出淡黄色颗粒状愈伤。

(2)预培养从诱导培养基上挑选颗粒状、不带病斑的愈伤组织置于新的诱导培养基上，于30℃黑暗条件下培养3～5d。

(3)侵染及共培养将预培养的愈伤组织转移至50ml无菌管中，加入表达载体的农杆菌菌液浸泡20min，倒出菌液，并用无菌滤纸将残余菌液吸干。后将愈伤均匀撒在共培养培养基上，于23℃黑暗条件下培养2～3d。

(4)恢复将共培养的愈伤转移至恢复培养基上(愈伤之间尽量避免重叠)。23℃黑暗培养3～5d。

(5)筛选从筛选培养基上挑选不带菌斑颜色鲜亮呈淡黄色颗粒状的抗性胚性愈伤组织，每皿30粒接种于筛选培养基，30℃黑暗培养2～3周，至长出新的抗性颗粒状愈伤。

(6)分化每一转化事件(筛选时由一粒愈伤组织繁殖产生的所有愈伤组织)挑选三个独立的胚性愈伤到分化培养基某一区域，30℃光照培养室(16h光照/8h黑暗)条件下培养3～4周，待幼苗长出。

(7)生根每一区域挑选两棵健壮的幼苗移栽至生根培养基，30℃组织培养室光周期(16h光照/8h黑暗)培养三周左右，进行鉴定并移栽至田间。转基因水稻苗中启动子的表达特性鉴定

gus能与显色底物x-gluc反应，显现蓝色，因而可以通过组织化学染色定性的研究gus的表达水平和表达模式。

gus染色所用试剂及流程参照jefferson(jeffersonra等人.gusfusion：β-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplant[j].emboj.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，具体如下：

①染色：将待测样品浸到gus染液中，37℃保温箱中放置24h-36h。

②脱色：加入100％乙醇浸泡直至完全脱色。可用含有30％甘油和70％乙醇的溶液保存。

③在显微镜下拍照记录。

按上述方法进行gus染色，结果如图3所示(标尺＝0.2cm)，在含有posro5：：gus转基因水稻植株中，在幼苗时期，该启动子只在根部(a)表达，在叶(b)、茎(c)中没有着色。这表明posro5启动子驱动gus基因只在根部表达，由此说明，posro5启动子是根部特异表达启动子。

实施例2

本实施例中提供一种对水稻根部生长具有重大意义的启动子，其能够响应于外部水环境表达

步骤1、启动子psubs3克隆和pcambia1381-psubs3载体构建

根据ncbi中提供的水稻品种日本晴(oryzasativalcv.nipponbare)全基因组序列，依据序列表中seqidno.2的序列设计扩增引物，并根据选用的载体及靶标基因的特点，设计引物的酶切位点。用于扩增的引物为：

正向引物：ecorigaattctttactcaccgtgtcctctgtt

反向引物：hindiiiaagctttgtatctctctctggtagttag

以水稻品种日本晴dna为模板，利用正向引物、反向引物扩增启动子psubs3，按常规pcr体系，采用如下扩增程序：

95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min30s，35个从95℃预变性到72℃延伸的循环；最后72℃延伸10min。

回收pcr扩增的目的片段，目的片段长度1939bp。将其连接到pgem-t-easy载体(购自promega公司，按载体说明书中的比例混合)上，并送交invitrogen公司测序，其核酸序列如seqidno:2所示。

用hindiii和ecori对连有psubs3的pgem-t-easy载体进行双酶切，回收启动子psubs3片段。同时利用hindiii和ecori对pcambia1381进行线性化处理，将上述的psubs3片段连接至pcambia1381载体上，得到启动子psubs3与gus基因融合的植物表达载体pcambia1381-psubs3，示意图如图3所示。利用冻融法将植物表达载体pcambia1381-psubs3转入根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)eha105中。

步骤2：农杆菌介导的水稻遗传转化

成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

将转入了pcambia1381-psubs3重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照yongboduan(yongboduan，chenguangzhai，etal.anefficientandhigh-throughputprotocolforagrobacteriummediatedtransformationbasedonphosphomannoseisomerasepositiveselectioninjaponicarice(oryzasatival.)[j].plantcellreport，2012.doi10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。

共获得32株植株。提取这些植株的dna，经pcr鉴定后，获得28株阳性的pcambia1381-psubs3植株。

步骤3、psubs3启动子活性鉴定

参照jefferson(jeffersonra等人.gusfusion：β-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplant[j].emboj.，1987，6:3901-3907)等提出的方法，将需要染色的组织抽真空，然后浸入染色液中，37℃染色24小时。脱色时在37℃条件下用95％乙醇处理，至阴性对照材料呈白色。

经种子萌发21天后的阳性转基因植株组织进行染色。在正常条件下生长的水稻植株，经24小时染色后，根(a)，茎(b)，叶(c)均无gus活性，而经水淹处理1小时，经24小时染色后，在根(a)，茎(b)，叶(c)均有gus强烈表达(标尺＝5mm)。结果见图4。

提取水淹前后的14天幼苗的rna，经反转录后成cdna。利用实时荧光定量pcr检测gus基因的表达量，同时以水稻看家基因actin为对照。通过gus基因的表达变化，来反映psubs3启动子的水淹诱导活性。

rt-qpcr采用天根公司(北京)的superreal荧光定量预混液试剂盒(tiangen，sybrgreen，fp205)。以水稻actin基因作为内参基因对所用rna模板量进行定量。采用2^–δδct(δct＝ct目标基因–ct内参基因；δδct＝δct处理后–δct对照)对获得的信号和数据进行处理。每个基因做3次重复。本实验中用到的基因的定量引物为：actin-fp5’-cctgacggagcgtggttac-3’；和actin-rp，5’-ccagggcgatgtaggaaagc-3’用于actin的扩增；gus-fp，5’-tacggcaaagtgtgggtcaataatca-3’和gus-rp，5’-caggtgttcggcgtggtgtagag-3’用于gus的扩增。图5结果显示，水淹处理后，转基因植株中的gus基因的表达量是未经处理转基因植株的15.3倍，因此说明，psubs3启动子具有较强的水淹诱导活性。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

序列表

<110>安徽省农业科学院水稻研究所

<120>可用于对水稻根部进行改良的特异表达启动子及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1485

<212>dna

<213>启动子(rice)

<400>1

acccccttaatcaaaaacaacaagtgttgggacttcagttcttttctgagaagatacctg60

gctcgaaggctcatcggttcgctcattggcaccggccgtatacacggttgtccctgcccg120

tttgagaaatcgccgtacggtggctgaggcgcttcacgacagagggtggattaggaacat180

caccgccgctcttggcgtccaagctatcctggagtatttcaaactctaggacatcctcag240

atcagttcaactctcggatgagcctgactctctgacttggaggtgggagtcctcaaggga300

gtattcttctcggtcagcataccgtgctaacaagagcccatcttaggcaaaagttatgtt360

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ttgcatctatcaccaggaaaaccaaataattgagctacagattagttataccggtcttac1320

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actttgctttctcatactcgttggctcgttgctcctttgcatcaa1485

<210>4

<211>1939

<212>dna

<213>启动子(rice)

<400>4

tttactcaccgtgtcctctgttgatttttgtgatgcccaaattgtttgatttcatgatgt60

gcttagaactgttgccagtgcaagttgatttacatgtaaacctattctatgatgcatttc120

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tcttactcaaagtctcaaacgataaccacagggagaggagctagtaaaaatagctagcta1920

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<210>3

<211>28

<212>dna

<213>引物(rice)

<400>3

ggatccacccccttaatcaaaaacaaca28

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>引物(rice)

<400>2

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