引物对及其在鉴别桑树桑黄中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术检测技术领域，特别是涉及一种引物对及其在鉴别桑树桑黄中的应用。

背景技术

桑黄隶属于真菌界fungi、担子菌门basidiomycota、伞菌纲agaricomycetes、锈革孔菌目hymenochaetales、锈革孔菌科hymenochaetaceae、桑黄属sanghuangporus，因寄生于桑树而得名，是一种珍贵的药用真菌。桑黄子实体黄褐色，味微苦、性寒。传统中医认为桑黄具利五脏、软坚、排毒、止血和止泻等药效，可用于治疗痢疾、盗汗、血崩、血淋、脱肛和闭经等症；现代药理学研究也证实，桑黄具有抗肿瘤、降血糖、护肝、抗炎、免疫调节、抗氧化等药理作用，因此，桑黄具有极高的开发利用价值。

目前真正的桑黄仅只一种，在野外的数量很少，且只长在桑树树干，因此称之为桑黄。但是，国内桑黄无论是科学研究还是消费市场相对混杂，与野生桑树桑黄类外观类似的种类颇多，尤其以杨树桑黄和丁香桑黄最常见，其在野外的数量约为桑树桑黄的百倍，且该类别桑黄比野生桑树桑黄更容易人工培育。由于该类别桑黄也具有一定的药效性，因此，其往往充斥着市场当做桑树桑黄来使用。

由于缺乏分子层面的鉴定技术，仅从外观形态很难把杨树桑黄、丁香桑黄与野生桑树桑黄加以区别，因此，基础研究材料及市售产品普遍真假桑黄混杂不清，这不仅造成了桑黄的命名不清，普遍存在“同种异名”、“同名异种”的现象，也造成了桑黄在科学研究中的本质特性及药用功效难以精确明白，严重阻碍了桑黄新品种的选育及产业的发展。

公开号为cn106811467a的中国发明专利公开了一种引物对及其在杨黄纤孔菌与桑黄纤孔菌鉴别中的应用，引物对包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：上游引物：

5′-gagtgcgtcgggtgaagact-3′或5′-tgcgcatgtgcacggcctt-3′，

下游引物：

5′-aggaggtaacaacaactcctt-3′。

本发明引物对能够被用于鉴别杨黄纤孔菌和桑黄纤孔菌，通过对样品的基因组dna进行扩增，再进行普通的核酸胶电泳，如果有特异性的扩增条带，则待检测样品为杨黄纤孔菌，否者为桑黄纤孔菌。

公开号为cn106811507a的中国发明专利公开了一种桑黄的快速鉴定方法，其通过pcr的方法对待测样本基因组的its区域进行扩增，当获得dna长度大致为750bp大小时，对片段进行测序后，符合该专利给出的序列，判断待检测样本为桑黄。但该专利只能区别桑黄(inonotussanghuang)品种及桑黄(inonotusbaumii)品种，存在很大的使用局限性，且pcr后的片段要经过序列测定比较，步骤复杂，大大限制了其在鉴定中的使用，因此，简单、快速、有效的桑树桑黄鉴定方法刻不容缓。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种引物对及其在鉴别桑树桑黄中的应用。

引物对，包括上游引物和下游引物，核苷酸序列为：

上游引物5’-cttcgcgctcaaatccaactc-3’，

下游引物5’-gtatttaagaggagccgacccc-3’。

本发明通过对从全国各地采集到的桑树桑黄(sanghuangporussanghuang)17个品种的its序列进行测序，同时从网上下载桑树桑黄its序列，并比对了采集及自己保存的5个非桑树桑黄序列及网上下载的非桑树桑黄序列。所有桑树桑黄(its序列如seqidno.3所示)its序列完全一致，非桑树桑黄中发现了2种桑黄，分别是杨树桑黄(inonotusvaninii，its序列如seqidno.1所示)及丁香桑黄(inonotusbaumii(pilát)，its序列如seqidno.2所示)。通过对这三种桑黄的its序列进行比较分析，设计出了上述用于鉴别桑树桑黄的引物对，用该引物对pcr扩增桑黄样本的基因组dna，扩增结果经电泳检测，如果扩增出500bp的条带，则待检测样本为桑树桑黄；如果扩增出550bp的条带，则待检测样本为杨树桑黄或丁香桑黄。

本发明又提供了所述的引物对在鉴别桑树桑黄中的应用。

本发明又提供了所述的引物对在制备鉴别桑树桑黄的试剂盒中的应用。

本发明还提供了一种用于鉴别桑树桑黄的试剂盒，包含所述引物对。

所述的试剂盒，还包括阴性扩增条带分子量标准和阳性扩增条带分子量标准，所述阴性扩增条带分子量标准为550bp的dna片段，所述阳性扩增条带分子量标准为500bp的dna片段。

本发明还提供了一种鉴别桑树桑黄的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测样本的基因组dna，所述待检测样本为桑树桑黄、杨树桑黄或丁香桑黄；

(2)以所述基因组dna为模板，利用所述的引物对进行pcr扩增；

(3)pcr扩增产物进行电泳检测，

若检测结果出现500bp的条带，则待检测样本为桑树桑黄；

如检测结果出现550bp的条带，则待检测样本为杨树桑黄或丁香桑黄。

所述的方法，pcr扩增体系为：

其中，2×扩增反应mix液的成分为：80mmol/lph8.5的tris-hcl、24mmol/l的mgcl2、140mmol/l的kcl、10mmol/l的二硫苏糖醇、2mmol/l的dntp、0.4μmol/l的上游引物、0.4μmol/l的下游引物。

所述的方法，pcr扩增条件为：

94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环；72℃延伸7min。

本发明通过对多个桑黄样品的its序列进行分析比较，发现its序列存在一定区别，通过对这三种桑黄的its序列进行比较分析，设计出了所述引物对，用该引物对pcr扩增桑黄样本的基因组dna，扩增结果经电泳检测，如果扩增出500bp的条带，则待检测样本为桑树桑黄；如果扩增出550bp的条带，则待检测样本为杨树桑黄或丁香桑黄。

附图说明

图1为桑黄dna的提取及电泳检测流程图。

图2为电泳检测结果分析图，其中图a和图b中分别为不同样品，泳道ladder：dna标准分子量(从上到下依次为1500bp、1000bp、800bp、600bp、400bp、200bp)；泳道m-：即阴性扩增条带分子量标准；m+：即阳性扩增条带分子量标准；泳道s1、s2、s4、s5、s6、s7、s8、s9、s10、s11、s15、s17、s21、s22、s23、s26、skhch为桑树桑黄标本，泳道s3、s13、s19、s27、s28为杨树桑黄或丁香桑黄标本。

具体实施方式

实施例1

(1)引物的来源/设计过程

对从全国各地采集到的桑树桑黄17个品种的its序列进行测序，同时从网上下载桑树桑黄its序列，并比对了采集及自己保存的5个非桑树桑黄序列及网上下载的非桑树桑黄序列。所有桑树桑黄(序列如seqidno.3所示)its序列完全一致，非桑树桑黄中发现了2种桑黄，分别是杨树桑黄(序列如seqidno.1所示)及丁香桑黄(序列如seqidno.2所示)。

分析发现在所有序列的大致100bp左右、580bp位置有21个核苷酸为几种桑黄序列共同拥有且连续一致，符合引物设计原则，且pcr产物能够获得大小不同的片段。故设计该对引物：

上游引物：5’-cttcgcgctcaaatccaactc-3’，

下游引物：5’-gtatttaagaggagccgacccc-3’。

实施例2

(1)ctab法提取桑黄dna

取桑黄0.2g置于1.5mlep管中，加入液氮后研磨成细粉，立即加入500μl的ctab提取缓冲液(2％的ctab，100mmol/ltris-hcl(ph8.0)，20mmol/ledta-2na，1.4mol/lnacl，0.1％(v/v)的β-巯基乙醇)，60℃水浴保温1hr后，加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)抽提，轻颠倒混匀，10000r/min离心10min，吸取上清液，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀；12000r/min离心10min，弃上清，小心倾去上清液，沉淀用70％无水乙醇清洗，弃洗液，留沉淀，空气干燥。用100μl的无菌去离子水溶解样品，同时，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测dna的浓度和质量，分光光度计定量后稀释至浓度为40ng/μl后，-20℃保存备用。

(2)pcr扩增

选取了22个已经鉴定的桑黄(包括桑树桑黄及其他桑黄)基因组dna作为模板，进行pcr扩增：

pcr扩增体系：

2×扩增反应mix液：包含扩增反应缓冲液(常规pcr缓冲液，本发明中成分为：80mmol/l的tris-hcl(ph8.5)、24mmol/l的mgcl2、140mmol/l的kcl、10mmol/l的二硫苏糖醇、2mmol/l的dntp、0.4μmol/l的上游引物、0.4μmol/l的下游引物)、金属离子溶液(mg²⁺)、dntp及用于扩增目标片段的上游引物和下游引物，

上游引物：5’-cttcgcgctcaaatccaactc-3’，

下游引物：5’-gtatttaagaggagccgacccc-3’。

充分混匀后，10000r/min离心10s，置于pcr仪上扩增。

pcr扩增条件如下：

94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸40s，30次循环；72℃延伸7min；10℃保温。

(3)琼脂糖凝胶电泳鉴定

琼脂糖凝胶的配置：

精确称量0.4g琼脂粉，加入1×tae20ml，放入微波炉中充分加热溶解，加入gelred1μl，混合均匀后倒入胶室。等其凝固后使用。

点样，电泳，100v电泳40min后紫外灯下照相分析。

整个检测流程如图1中所示。

实施例3

使用实施例2方法检测多种桑黄样本。

结果如图2所示，ladder：dna标准分子量(从上到下依次为1500bp、1000bp、800bp、600bp、400bp、200bp)；m-：即阴性扩增条带分子量标准(550bp大小的标准分子量条带)；m+：即阳性扩增条带分子量标准(500bp大小的标准分子量条带)；所指编号为s1、s2、s4、s5、s6、s7、s8、s9、s10、s11、s15、s17、s21、s22、s23、s26、skhch的桑树桑黄标本扩增出了分子量为500bp的阳性dna条带，而编号为s3、s13、s19、s27、s28的杨树桑黄及丁香桑黄标本则扩增出了分子量在550bp左右的假阳性条带，很好的鉴别出了混杂在桑树桑黄中的杨树桑黄及丁香桑黄标本。

序列表

<110>杭州市农业科学研究院

<120>引物对及其在鉴别桑树桑黄中的应用

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>777

<212>dna

<213>杨树桑黄(inonotusvaninii)

<400>1

ttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattatcgagttttgaaagcgagacttgctgctg60

gcgcgaatgaatttttgcgcatgtgcacggccttcgcgctcaaatccaactctcaaaccc120

cctgtgcaccttatcatatcgcgagtcgaagttagtagtctgaggtctgtcttgtaagta180

atgagtagaagggcgaaagcgagcgagtgttgctcgttaggtaacccttcgaaaatgaaa240

gcgagcgggagtgcgtcgggtgaagacttgggcttgttgttacaaacccccccttatatt300

gtctttgtgaatgtaatgctcctcgtgggcgaaaatcaatacaactttcaacaacggatc360

tcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcaga420

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gcctgtttgagtgtcatgtttatctcaaaccgctcgtctttctttaattgaagggcttga540

ggtttggacttggaggtttactgctggccgcctttcgaagggggtcggctcctcttaaat600

acattagctgggctttggctcgcgcttacggtgtaatagttgattccgttcaccaacgag660

cgcttgcctaacgagcttgcttctaacggtccgcttggtcggacaaggagttgttgttac720

ctcctttttcttgacacctttgacctcaaatcaggtaggattacccgccgaacttaa777

<210>2

<211>736

<212>dna

<213>丁香桑黄(inonotusbaumiipilát)

<400>2

tgggagatcttatcgagttttgaagcgagacttgctgctggcgcgaatgaatttttgcgc60

atgtgcacggccttcgcgctcaaatccaactctcaaaccccctgtgcaccttattatatc120

gcgagtcgaagttagtagtctgaggtctgtcttgtaagtaatgagtagaagggcgaaagc180

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tgaagacttgggcttgttgttacaaacccccccttatattgtctttgtgaatgtaatgct300

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cgcgcttacggtgtaatagttgattccgttcaccaacgagcgcttgcctaacgagcttgc660

ttctaacggtccgcttggtcggacaaggagttgttgttacctcctttttcttgacacctt720

gacctcaaatcaggta736

<210>3

<211>738

<212>dna

<213>桑树桑黄(sanghuangporussanghuang)

<400>3

ccgtaggtgaacctgcggaaggatcattatcgagttttgaaagcgagacctgctgctggt60

gcgaaatcgcgcatgtgcacggtcttcgcgctcaaatccaactcaaacccctgtgcacct120

tatatatcgcgagtcgaagttagtagcctgaggtcttgtaagtaattagtagaagggcga180

aagcgagtcttgctcgttaggtagcctttcgaaaatgaaagcgagtgcgtcgggtgaaga240

cttcggcttgtcgttacaaaacaccttatattgtctttgtgaatgtaatgctccttgtgg300

gcgaaaataaatacaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgc360

agcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacg420

caccttgcgccccttggtattccgaggggcatgcctgtttgagtgtcatgtttatctcaa480

accgctcgtctttcttaattgaagggcttgaggtttggacttggaggtttactgctggcg540

cctttcgaggggtcggctcctcttaaatacattagctgggctttggctcgcgtttacggt600

gtaatagttgattccattcaccaacgagcgcttgcctgacgagcttgcttctagccgtcc660

gcgtcgtcggacaaggagtcacctccttcttgacacctttgacctcaaatcaggtaggat720

tacccgccgaacttaagc738

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>4

cttcgcgctcaaatccaactc21

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificial)

<400>5

gtatttaagaggagccgacccc22