一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法与流程

本发明涉及一种基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法。

背景技术

腐皮镰刀菌(fusariumsolani)是植物根腐病的主要致病菌，主要对黄芪、丹参、甘草、板蓝根等产生危害。根腐病是一种真菌引起的植物病，该病会造成根部腐烂，导致植物吸收水分和养分的功能逐渐减弱，最后全株死亡，主要表现为整株叶片发黄、枯萎。腐皮镰刀菌根据其形状、厚垣孢子和长管瓶的存在确定其为大分生孢子，然而形态学鉴定不能区分不同的生物物种和具有共同形态特征而基因多样的有丝分裂菌株，如若采用传统的鉴定方法，容易出现偏差，且耗时较长。

多重pcr检测腐皮镰刀菌虽然特异性好、准确性高，然而其pcr结果需要通过琼脂糖电泳进行分析，影响因素较多。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量pcr目前已广泛应用于菌种的检测。其与常规的分离培养方法相比，具有耗时短、操作简便、特异性好的特点，且结果可直接观察，能有效避免操作过程中引起的污染。

腐皮镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌，为实现pcr反应的高度特异性，需要选择高度保守、特异的序列作为耙序列。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供高特异性的用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测腐皮镰刀菌的试剂盒。

本发明的目的之三在于提供一种用于检测腐皮镰刀菌的方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，包括以seqidno.2所示的上游引物和seqidno.3所示的下游引物。

进一步地，还包括如序列表seqidno.4所示的探针，所述探针为荧光标记探针。

进一步地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为fam，3’端标记的荧光淬灭基团为bhq。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种用于检测腐皮镰刀菌的试剂盒，包括如seqidno.2所示的上游引物和seqidno.3所示的下游引物和如序列表seqidno.4所示的探针。

进一步地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为fam，3’端标记的荧光淬灭基团为bhq。

进一步地，还包括阳性质粒的标准品，所述阳性质粒的标准品是以腐皮镰刀菌的dna为模版、经过如seqidno.2所示的上游引物和seqidno.3所示的下游引物pcr扩增回收，与pmd18-t质粒进行连接、转染后得到的。

本发明的目的之三采用以下技术方案实现：

一种用于检测腐皮镰刀菌的方法，包括以下步骤：

1)获得阳性质粒的标准品：以腐皮镰刀菌的dna为模版、经过如seqidno.2所示的上游引物和seqidno.3所示的下游引物pcr扩增回收，与pmd18-t质粒进行连接、转染后得到阳性质粒的标准品；

2)pcr鉴定：分别以待测样品的dna、阳性质粒的标准品为模板，以ddh2o为阴性对照，通过如seqidno.2所示的上游引物和seqidno.3所示的下游引物进行pcr反应检验。

进一步地，步骤2)中，pcr反应体系为：10×pcrbuffer2.5μl、dntp(2.5μm)0.5μl、上游引物(1μm)0.5μl、下游引物(1μm)0.5μl、模板0.5μl、taq酶(5u)0.5μl和ddh2o补足25μl；

pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。

进一步地，步骤2)中，pcr扩增体系包括如序列表seqidno.4所示的探针。

进一步地，pcr反应体系：2×premix10μl、上游引物(10μm)0.2μl、下游引物(10μm)0.2μl、探针(10μm)0.2μl、模板0.3μl、ddh2o补足至20μl。

pcr反应条件：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发明提供用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法，主要是以对腐皮镰刀菌高度保守的特异性的fstef1基因作为耙序列，设计如seqidno.2所示的上游引物和如seqidno.3所示的下游引物，该序列的扩增长度为215bp，其对腐皮镰刀菌具有较好的特异性，能有效地将其与同镰刀菌属的尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌区分开来；

本发明同时还提供了与如seqidno.2所示的上游引物和如seqidno.3所示的下游引物相对应的探针，该探针可应用于一步荧光法定量分析样品中腐皮镰刀菌，其具有较高的灵敏度和特异性；

基于上述上、下游引物和探针的试剂盒和方法，具有较便捷的操作性和较高的灵敏度、特异性。

附图说明

图1为实施例1耙序列的blast结果图；

图2为实施例1上下引物序列的blast结果图；

图3为实施例5的标准曲线图；

图4为实施例7的灵敏度试验曲线；

其中，a代表质粒浓度为1.00×10⁷copies/μl、b代表质粒浓度为1.00×10⁶copies/μl、c代表质粒浓度为1.00×10⁵copies/μl、d代表质粒浓度为1.00×10⁴copies/μl、e代表质粒浓度为1.00×10³copies/μl、f代表质粒浓度为1.00×10²copies/μl、g代表质粒浓度为1.00×10¹copies/μl和阴性对照。

图5为实施例7的特异性试验曲线；

其中，a标准扩增曲线为腐皮镰刀菌基因组，b代表未出现标准扩增曲线分别为尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌、阴性对照；

图6为实施例8的特异性试验结果图；

其中，泳道1-6依次为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌、阴性对照、dl2000的marker。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

本发明以高度保守、特异的fstef1基因作为耙序列，设计pcr扩增引物和探针，再采用pcr技术扩增腐皮镰刀菌fstef1基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pmd18-t中，构建出重组质粒pmd18-t-fstef1，并进行相应的pcr鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。

本发明提供一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组，该核苷酸序组包括以seqidno.1为耙序列设计的引物对：

如seqidno.2所示的上游引物；和

如seqidno.3所示的下游引物。

其中，seqidno.1耙序列如下所示：

其中，直线下划线部分的序列为seqidno.2所示的上游引物序列，而波浪线下划线部分的序列与seqidno.3所示的下游引物序列相匹配。seqidno.2所示的上游引物和seqidno.3所示的下游引物的扩增片断大小为215bp。

seqidno.1耙序列通过对ncbi数据库blast结果显示如图1，其与多种腐皮镰刀菌分离菌株的fstef1基因序列的匹配度高、相似度达100％。

上游引物和下游引物序列经ncbi中primer-blast比对结果见图2。由图2可知，此对引物对腐皮镰刀菌具有特异性。

该核苷酸序组包括如seqidno.4所示的探针序列：耙基因点下划线部分与所述探针序列相对应。

探针序列的荧光报告基团优选地可以进行如下设计：

5’端标记的荧光报告基团为fam，3’端标记的荧光淬灭基团为bhq。

该对引物和探针的扩增的目标序列如seqidno.5所示。

实施例1：模版dna的制备

要本实施例采用细菌基因组提取试剂盒提取腐皮镰刀菌标准菌株基因组dna，用作fstef1基因pcr扩增的模板。其采用的提取试剂盒可以选自北京百泰克公司生产的细菌基因组提取试剂盒，具体提取方法如下：

1)取1ml菌悬液，加入1.5ml离心管，8000r/min离心2分钟，弃上清液；

2)加入400μlbufferdigestion悬浮菌液沉淀，混匀后放入65℃水浴1h至细胞完全裂解；

3)加入200μlbufferpb混匀-20℃静置5min，离心取上清；

4)加入600μl异丙醇混匀-20℃静置5min。离心弃上清；

5)加入1ml75％乙醇-20℃静置5min，离心弃上清；

6)沉淀用75％的乙醇洗涤，干燥，得到模版dna；

7)溶于50μltebuffer中，-20℃保存。

实施例2：pcr扩增

以实施例1得到的模版dna，以seqidno.2所示的上游引物序列和seqidno.3所示的下游引物序列进行扩增，pcr反应条件为：10×pcrbuffer2.5μl、dntp(2.5μm)0.5μl、上游引物(1μm)0.5μl、下游引物(1μm)0.5μl、模板dna0.5μl、taq酶(5u)0.5μl和ddh2o补足25μl。

其中，taq酶采用北京百泰克powertaqplusdnapolymerse，pcr扩增仪为杭州朗基科学仪器有限公司mg系列96梯度pcr仪。

pcr扩增程序为：

94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。取5μl扩增产物进行2％琼脂糖电泳，检测pcr产物大小，然后采用上海生工公司生产的dna凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的pcr扩增产物，得到回收dna。

实施例3：重组质粒的构建、转化和获得

a)质粒连接

将实施例2得到的回收dna与pmd18-t(大连宝生物公司)进行连接，采用如下连接体系进行配制：pmd18-tvector1μl、回收dna4μl、solution1补足10μl。配制完成后置于16℃进行过夜连接反应，得到连接产物。

b)质粒转化鉴定

1)从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的dh5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻；

2)取步骤a)得到的连接产物10μl加入100μl的dh5α感受态细胞中；

3)42℃水浴中热休克90s，热休克后立即置冰上冷却30min；

4)向1.5mlep管中加入预冷的800μl的lb液体培养基(不含氨苄青霉素)混匀后，37℃140rpm轻摇培养1h；

5)将上述培养液8000rpm离心1min，弃上清，将细胞重悬吸收剩余涂布于含0.1ngamp的lb平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；

6)次日观察，从平板上挑取单克隆菌落于100μllb液体培养基(含氨苄青霉素)的pcr管中，37℃振荡培养2-3小时；吸取2μl作为模板进行pcr鉴定，剩余的菌液加入到20ml的lb液体培养基中进行扩摇；

pcr的鉴定反应条件如下所示：10×pcrbuffer2.5μl、dntp(2.5μm)0.5μl、上游引物(10μm)0.5μl、下游引物r(10μm)0.5μl、0.5μl、taq酶(5u)0.5μl、ddh2o补足25μl；

pcr的鉴定扩增程序：94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。

7)用seqidno.2所示的上游引物序列和seqidno.3所示的下游引物扩增上述稀释菌液，pcr产物采用2％琼脂糖凝胶电泳，通过检测pcr产物大小鉴定阳性转化子。

c)阳性重组质粒的提取：

采用百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒pmd18-t-fstef1，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。

d)获得阳性重组质粒的标准品：

1)取步骤c)得到的含有重组质粒pmd18-t-fstef1的大肠杆菌dh5α100μl转种于5ml的lb液体培养基，37℃200rpm过夜摇培；

2)取1ml培养过夜的菌液转种于10mllb液体培养基，200rpm增菌培养2-3小时，然后采用北京百泰克公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；

3)利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可见分光光度计(nd5000)对提取的质粒进行测定，测定a260、a280，根据a260/a280判断质粒的纯度；

4)质粒pmd18-t-fstef1浓度(拷贝数)计算

质粒的分子量＝2906bp×660(每对碱基的平均分子量)

测得质粒浓度为213.32ng/μl，质粒纯度a260/a280＝1.91，因在进行实时荧光定量pcr时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/μl。

质粒copies/μl＝阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数

其中阿伏伽德罗常数＝6.02×10²³copies/mol。

因此提取的质粒浓度copies/μl＝213.32×10^-9g/μl×6.02×10²³copies/mol÷(2906bp×660g/bp·mol)＝6.69×10¹⁰copies/μl

10μl质粒加无菌水定容就得到浓度为1.00×10¹⁰copies/μl的质粒，再将该质粒进行10倍比梯度稀释就可得到一系列浓度的质粒，即阳性质粒的梯度标准品，并于-20℃保存备用。

实施例4：一种用于检测腐皮镰刀菌的试剂盒

该试剂盒包括如seqidno.2所示的上游引物序列和seqidno.3所示的下游引物、如seqidno.4所示的探针，其中，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为fam，3’端标记的荧光淬灭基团为bhq。

该试剂盒包括实施例3得到的阳性质粒的标准品。

具体地，该试剂盒包括如下组分：

2×premix(2×premix为北京百泰克公司生产，全称为2×real-timepcrpremixture(probe))、终浓度为10μm的上游引物、终浓度为10μm的下游引物、终浓度为10μm的探针、实施例3步骤4)得到的阳性质粒的梯度标准品(系列浓度为：1.00×10⁷copies/μl、1.00×10⁶copies/μl、1.00×10⁵copies/μl、1.00×10⁴copies/μl、1.00×10³copies/μl、1.00×10²copies/μl、1.00×10¹copies/μl)、阳性对照(浓度为6.07×10¹⁰copies/μl的实施例3步骤3)制备的阳性重组质粒)和ddh2o，ddh2o作为试剂和阴性对照使用。

实施例5：标准曲线的绘制

以实施例3步骤4)得到的阳性质粒的梯度标准品为模版，使用如seqidno.2所示的上游引物序列和seqidno.3所示的下游引物、如seqidno.4所示的探针，进行pcr扩增，以ddh2o作为阴性对照。

pcr反应体系如下：2×premix10μl、上游引物(10μm)0.2μl、下游引物(10μm)0.2μl、探针(10μm)0.2μl、模板0.3μl、ddh2o补足至20μl。

pcr反应条件如下：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。

标准曲线的获得方法：以标准品的质粒浓度的对数为横坐标，以ct值为纵坐标得到标准曲线，结果参考图3。标准曲线原始方程为y＝ax+b，本次标准曲线的方程为y＝-3.089x+40.83。

图3为本发明标准品的标准曲线。由图3可知，标准品标准曲线光滑，相关系数高，具体为r²＝0.997，满足实时荧光定量pcr检测的要求。

实施例6：一种用于检测腐皮镰刀菌的方法

分别以待测样品dna和实施例3步骤4)得到的阳性质粒的梯度标准品(系列浓度为：1.00×10⁷copies/μl、1.00×10⁶copies/μl、1.00×10⁵copies/μl、1.00×10⁴copies/μl、1.00×10³copies/μl、1.00×10²copies/μl、1.00×10¹copies/μl)为模板，使用实施例5得到的试剂盒，进行荧光定量pcr扩增。

pcr反应体系如下：2×premix10μl、上游引物(10μm)0.2μl、下游引物(10μm)0.2μl、探针(10μm)0.2μl、模板0.3μl、ddh2o补足至20μl。

反应条件：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。绘制标准曲线，通过标准曲线和待测样品的ct值进行快速定量检测。

实施例7：方法验证

利用实施例5得到的用于检测腐皮镰刀菌的试剂盒、对实施例6得到的用于检测腐皮镰刀菌的方法进行灵敏度、特异性试验

a)灵敏度试验

分别以实施例3步骤4)得到的阳性质粒的梯度标准品(系列浓度为：1.00×10⁷copies/μl、1.00×10⁶copies/μl、1.00×10⁵copies/μl、1.00×10⁴copies/μl、1.00×10³copies/μl、1.00×10²copies/μl、1.00×10¹copies/μl)为模板，以ddh2o为阴性对照，进行pcr反应。

pcr反应条件：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果参照图4，数据显示当质粒浓度达到1.00×10²copies/μl时依然有荧光信号，当质粒浓度达到1.00×10¹copies/μl时没有荧光信号。因此本发明方法的灵敏度为1.00×10²copies/μl。

b)特异性试验

使用常见临床感染的镰刀菌微生物尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌进行特异性试验。

以实施例3步骤3)制备的阳性重组质粒为阳性模版，以尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌为测试模版，以ddh2o为阴性对照，进行pcr反应，其中pcr反应体系为：2×premix10μl、上游引物(10μm)0.2μl、下游引物(10μm)0.2μl、探针(10μm)0.2μl、模板0.3μl、ddh2o补足至20μl。

pcr反应条件：94℃预变性2分钟，94℃10秒、60℃30s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。检测结果如表1所示，

表1特异性试验结果表

结果参考图5：以基因组dna为模板仅腐皮镰刀菌检测为阳性，其余微生物均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。

实施例8：引物特异性试验

以实施例3步骤3)制备的阳性重组质粒为阳性模版，以尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌为测试模版，以seqidno.2所示的上游引物序列和seqidno.3所示的下游引物，通过2％的琼脂糖胶检测腐皮镰刀菌特异性引物探针荧光定量结果，以ddh2o为阴性对照，进行pcr反应。

pcr扩增反应条件为：10×pcrbuffer2.5μl、dntp(2.5μm)0.5μl、上游引物(1μm)0.5μl、下游引物(1μm)0.5μl、模板0.5μl、taq酶(5u)0.5μl和ddh2o补足25μl。

pcr扩增条件为：94℃预变性5min；94℃30s、50℃30s、72℃1min，30个循环；72℃10min。

图6为本发明特异性实验凝胶成像验证图。其中，泳道1-6依次为尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌、三线镰刀菌、禾谷镰刀菌、阴性对照、dl2000的marker。

结果显示：仅腐皮镰刀菌检测扩增条带为大小正确的目的条带，其余微生物均未扩增出目的条带，表明本发明具有很好的特异性。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

序列表

<110>苏州百源基因技术有限公司

<120>一种用于检测腐皮镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法

<130>0000

<141>2018-06-29

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>714

<212>dna

<213>耙序列()

<400>1

gaggacaagactcacctcaacgtcgtcgtcatcggccacgtcgactctggcaagtcgacc60

accgtaagtcaagcccccatcgcgatctgcttatctcgggtcgtggaaccccgcctggta120

tctcgggcggggtactcatcagtcacttcatgctgacaatcatctacagaccggtcactt180

gatctaccagtgcggtggtatcgacaagcgaaccatcgagaagttcgagaaggttggtga240

catctcccccgatcgcgccttgctattccacatcgaattccctcttctgcgacacgctct300

gcgcccgcttctcccgagtcccaaaaattttgcggttcgaccgtaatttttttttggtgg360

ggcatttaccccgccactcgagcgacgttggacgagccctgaaccctgcacacaaaaaac420

accaaaccctcttggcgcgcatcacgtggttcacaacagacactaacaggttcaacaata480

ggaagccgctgagctcggtaagggttccttcaagtacgcctgggtccttgacaagctcaa540

ggccgagcgtgagcgtggtatcaccatcgatattgctctctggaagttcgagactccccg600

ctactatgtcaccgtcattggtatgtcgccctcatctctctcaatcacgtctcatcacta660

acaatcaacagacgcccccggccaccgtgatttcatcaagaacatgatcactgg714

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>上游引物()

<400>2

ccctcttctgcgacacg17

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>下游引物()

<400>3

gctcagcggcttcctatt18

<210>4

<211>26

<212>dna

<213>探针()

<400>4

ctgcgcccgcttctcccgagtcccaa26

<210>5

<211>215

<212>dna

<213>目标序列()

<400>5

ccctcttctgcgacacgctctgcgcccgcttctcccgagtcccaaaaattttgcggttcg60

accgtaatttttttttggtggggcatttaccccgccactcgagcgacgttggacgagccc120

tgaaccctgcacacaaaaaacaccaaaccctcttggcgcgcatcacgtggttcacaacag180

acactaacaggttcaacaataggaagccgctgagc215