本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种用于检测四种常见根结线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法。
背景技术：
根结线虫(meloidogynespp.)是一类严重危害农业生产的植物线虫，能寄生蔬菜、果树、花卉和杂草等几乎所有维管植物，每年在世界范围内造成的农业损失高达百亿美元。目前，已报到的根结线虫已超过100个种，其中，危害较为严重的主要为南方根结线虫(m.incognita)、爪哇根结线虫(m.javanica)、花生根结线虫(m.arenaria)、北方根结线虫(m.hapla)和象耳豆根结线虫(m.enterolobii)。近年来，随着我国种植结构的调整和设施蔬菜种植规模的扩大，特别是蔬菜大棚连作、四季重茬现象严重，导致根结线虫危害日趋严重。由于高毒化学农药的禁用以及抗病品种单基因抗性易丧失等问题的出现，使根结线虫的防治面临重大挑战。因此，快速准确鉴定根结线虫的种类对根结线虫病的测报、选择积极的防治策略提供有效手段。
根结线虫种类鉴定常用手段主要包括传统的形态学鉴定、基于蛋白的同工酶鉴定技术和基于dna的分子检测技术。形态学鉴定主要以雌虫会阴花纹、二龄幼虫头部和尾部作为重要的分类形状，该方法耗时长、需要较强的专业技能，难以推广使用。同工酶鉴定技术通过酯酶和苹果酸脱氢酶的酶谱表型来区分根结线虫不同种类，该方法只适用于鉴定雌虫，不使用于二龄幼虫和其它龄期根结线虫的鉴定，此外，该技术操作复杂、耗时长的不足也极大限制其应用。基于dna的分子检测技术是根结线虫最常用的检测手段，主要包括随机扩增多态性dna技术(rapd)、特异引物pcr技术、实时荧光定量pcr技术(real-timepcr)和环介导等温扩增技术(lamp)。pcr技术和real-timepcr技术具备准确、高效、灵敏度高的特点，同时可实现对根结线虫的定量检测，但该技术对仪器设备、实验条件、人员专业素质要求较高的缺点。lamp技术可在65℃恒温1h完成检测反应，对仪器设备要求较低，但其反应体系需要6条引物，且易出现假阳性。鉴于此，继续开发精确、高效、对仪器设备要求低的根结线虫检测技术具有重要的实践价值。
重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，rpa)是一种新型的恒温扩增技术，其反应过程包括三种核心酶：重组酶(recombinase)、单链结合蛋白(ssb)和dna聚合酶(ploymerase)。具体反应原理为：1)重组酶在atp的参与下rpa引物结合形成核蛋白微丝，核蛋白微丝可向模板dna移动，将引物序列与模板dna序列进行比对；2)当引物与模板dna发生碱基互补配对时，核蛋白微丝与模板dna发生重组反应，并在单链结合蛋白的作用下，模板dna解链；3)在dna聚合酶的作用下，发生dna的指数级扩增，形成新的dna扩增产物。rpa技术只需一对30bp-35bp的引物，在37℃-45℃恒温反应20min即可完成扩增反应，检测时间较用常用分子检测手段大大降低。目前，rpa技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和动物寄生线虫的快速检测中，但尚未见其根结线虫检测方面的报道。
技术实现要素：
1、要解决的问题
针对四种常见根结线虫尚无有效运用rpa技术进行检测的问题，本发明提供一种用于检测四种常见根结线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法，它可以显著高检测效率，为四种常见根结线虫的早期诊断和现场快速检测提供新技术。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种用于检测四种常见根结线虫的rpa引物，
所述的rpa引物为如下四组所示，
用于检测南方根结线虫的rpa引物对：
(a)seqidno：1和seqidno：2；
用于检测爪哇根结线虫的rpa引物对：
(b)seqidno：3和seqidno：4；
用于检测花生根结线虫的rpa引物对：
(c)seqidno：5和seqidno：6；
用于检测象耳豆根结线虫的rpa引物对：
(d)seqidno：7和seqidno：8。
优选地，a组中seqidno：1和seqidno：2组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。
优选地，b组中seqidno：3和seqidno：4组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。
优选地，c组中seqidno：5和seqidno：6组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。
优选地，d组中seqidno：7和seqidno：8组成的引物对所获得的电泳条带如图1所示。
一种用于检测四种常见根结线虫的试剂盒。
一种用于检测四种常见根结线虫的检测方法，
包括以下步骤：
(1)提取样品中的dna；
(2)以步骤(1)提取的dna作为待检测dna模板，采用上述所述的rpa引物进行rpa扩增反应；
(3)分析rpa扩增产物。
优选地，步骤(2)中rpa扩增反应的反应体系以50μl计为：
优选地，步骤(2)中rpa扩增反应的反应条件为：37℃-45℃(具体应用时，可以选择37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等数值)下反应20min，随后冰上终止反应。
优选地，步骤(3)中分析rpa扩增产物的方法为利用琼脂糖凝胶电泳技术分析。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明rpa引物、试剂盒及检测方法，为四种常见根结线虫的检测提供了新技术，首次将rpa技术应用到四种常见根结线虫的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、检测效率高、对仪器设备要求较低的特点，对根结线虫病的现场检测、早期诊断和指导科学施药具有重要意义；其中rpa引物分别基于四种常见根结线虫scar序列设计，可稳定扩增且特异性较高，实现四种常见根结线虫的检测准确率高；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测灵敏度，同时可在常温下和20min内完成对四种常见根结线虫dna的恒温扩增，检测效率远高于较传统生理生化检测方法甚至pcr检测方法，解决了现有常规技术存在检测方法所需时间较长、对仪器设备依赖性高、检测结果假阳性高的现象。由此可见，建立的四种常见根结线虫rpa检测方法操作简单且结果易判定，为四种常见根结线虫的现场检测或快速检测提供有力技术支持。
附图说明
图1为实施例2四种常见根结线虫rpa检测方法建立的检测结果图；
图2为实施例3四种常见根结线虫rpa引物的特异性检测结果图；
图3为实施例4四种常见根结线虫rpa检测方法的灵敏度检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
以下实施例中使用的rpa反应管以及反应缓冲液购自英国twistdx公司，商品编号tabas03kit；其中，重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶以rpa冻干粉状态存在于rpa反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个rpa扩增反应在rpa反应管中进行。
实施例1
四种常见根结线虫rpa引物的设计和筛选
以已报道的四种常见根结线虫scar序列为靶基因，依据rpa引物设计原则，设计可用于rpa试剂盒(twistampbasic)的rpa引物。将四种常见根结线虫dna分别用于rpa引物的筛选，获得扩增效率高、灵敏度和特异性最好的四组rpa引物对，它们的序列如下：
用于检测南方根结线虫的rpa引物对：
上游引物mi-rpa-f(seqidno.1)：5’-gtatcattatgaagctaagactttgggctacaa-3’；
下游引物mi-rpa-r(seqidno.2)：5’-tcatcacaacaaccaatacaaacatcccgcta-3’；
用于检测爪哇根结线虫的rpa引物对：
上游引物mj-rpa-f(seqidno.3)：5’-gtgcgcgattgaactgagcccagactgaaacga-3’；
下游引物mj-rpa-r(seqidno.4)：5’-tatttttcaattggcctccttgagtgggcttat-3’；
用于检测花生根结线虫的rpa引物对：
上游引物ma-rpa-f(seqidno.5)：5’-gaaatttgaatgctatgccatcaggagatgtg-3’；
下游引物ma-rpa-r(seqidno.6)：5’-atacagtatctactcttctccactcgcaggaa-3’；
用于检测象耳豆根结线虫的rpa引物对：
上游引物me-rpa-f(seqidno.7)：5’-ttgccattgataacttttgtgaaagtgccgctg-3’；
下游引物me-rpa-r(seqidno.8)：5’-gaaatgaaacatcagttcaggcaggatcaacc-3’。
实施例2
四种常见根结线虫rpa检测方法的建立
本实施例的用于检测四种常见根结线虫的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取样品中的dna：挑取单条根结线虫2龄幼虫，置于含有20μl裂解缓冲液的200μlpcr管中，随后在液氮中冷冻1min，95℃水浴2min，重复3次，最后65℃温育1.5h，95℃处理10min，14000rpm离心1min，取上清于-20℃保存备用；本实施例所述的样品分别为所述样品分别为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫和象耳豆根结线虫；
(2)以步骤(1)提取的dna作为待检测dna模板，采用实施例1中所述的rpa引物，在rpa反应管中进行rpa扩增反应；
步骤(2)中rpa扩增反应的反应条件为：38℃下反应20min，随后冰上终止反应；
步骤(2)中rpa扩增反应的反应体系以50μl计为：
(3)分析rpa扩增产物；向上述rpa扩增产物中加入50μl氯仿溶液，充分混匀，12000rpm离心2min；取5μl离心后的上清液于2％琼脂糖凝胶电泳检测，观察rpa扩增产物的条带特征。
如图1所示，图1中的标号“1”指的是南方根结线虫的条带特征(332bp处)，图1中的标号“2”指的是爪哇根结线虫的条带特征(266bp处)，图1中的标号“3”指的是花生根结线虫的条带特征(356bp处)，图1中的标号“4”指的是象耳豆根结线虫的条带特征(258bp处)；本实施例还进行阴性对照模板的试验；其中阴性对照模板的试验中的待检测dna模板替换为ddh2o，其他内容同上述用于检测四种常见根结线虫的检测方法，图1中的标号“5”指的是阴性对照模板的检测结果图，可见没有出现任何条带，则表明该样品中不含有四种常见根结线虫。
上述图1的检测结果图表明本发明rpa引物可稳定扩增。
实施例3
四种常见根结线虫rpa引物的特异性检测
本实施例的用于检测四种常见根结线虫的检测方法同实施例2，不同在于：
所述的样品分别为南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、象耳豆根结线虫、北方根结线虫、腐烂茎线虫、大豆孢囊线虫。
如图2所示，图2中的标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”指的是南方根结线虫6个群体的检测结果，图2中的标号“7”、“8”、“9”、“10”、“11”指的是爪哇根结线虫5个群体的检测结果，图2中的标号“12”、“13”、“14”、“15”、“16”指的是花生根结线虫5个群体的检测结果，图2中的标号“17”、“18”、“19”、“20”指的是象耳豆根结线虫4个群体的检测结果，图2中的标号“21”、“22”、“23”、“24”、“25”、“26”指的是a组rpa引物对爪哇根结线虫、花生根结线虫、象耳豆根结线虫、北方根结线虫、腐烂茎线虫、大豆孢囊线虫的检测结果，图2中的标号“27”、“28”、“29”、“30”、“31”、“32”指的是b组rpa引物对南方根结线虫、花生根结线虫、象耳豆根结线虫、北方根结线虫、腐烂茎线虫、大豆孢囊线虫的检测结果，图2中的标号“33”、“34”、“35”、“36”、“37”、“38”指的是c组rpa引物对南方根结线虫、爪哇根结线虫、象耳豆根结线虫、北方根结线虫、腐烂茎线虫、大豆孢囊线虫的检测结果，图2中的标号“39”、“40”、“41”、“42”、“43”、“44”指的是d组rpa引物对南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、腐烂茎线虫、大豆孢囊线虫的检测结果。
上述图2的检测结果图表明，用于检测四种常见根结线虫的rpa引物中a组、b组、c组、d组分别仅对南方根结线虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、象耳豆根结线虫有特异性扩增，这表明本发明rpa引物特异性较高。
实施例4
四种常见根结线虫rpa检测方法的灵敏度检测
本实施例的用于检测四种常见根结线虫的检测方法同实施例2，不同在于：
(1)所述的样品为南方根结线虫
制备南方根结线虫单条幼虫dna提取液20μl，取1μl作为初始浓度并以100计，按10倍梯度依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4和10-5后，进行rpa反应；其中初始浓度100相当于1/20单条幼虫dna。
如图3中(a)所示，其标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”分别指的是不同浓度(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)南方根结线虫dna的检测结果。
上述图3中(a)的检测结果图表明，南方根结线虫的检出限为1/200条幼虫。
(2)所述的样品为爪哇根结线虫
制备爪哇根结线虫单条幼虫dna提取液20μl，取1μl作为初始浓度并以100计，按10倍梯度依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4和10-5后，进行rpa反应；其中初始浓度100相当于1/20单条幼虫dna。
如图3中(b)所示，其标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”分别指的是不同浓度(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)爪哇根结线虫dna的检测结果。
上述图3中(b)的检测结果图表明，爪哇根结线虫的检出限为1/200条幼虫。
(3)所述的样品为花生根结线虫
制备花生根结线虫单条幼虫dna提取液20μl，取1μl作为初始浓度并以100计，按10倍梯度依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4和10-5后，进行rpa反应；其中初始浓度100相当于1/20单条幼虫dna。
如图3中(c)所示，其标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”分别指的是不同浓度(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)花生根结线虫dna的检测结果。
上述图3中(c)的检测结果图表明，花生根结线虫的检出限为1/20条幼虫。
(4)所述的样品为象耳豆根结线虫
制备象耳豆根结线虫单条幼虫dna提取液20μl，取1μl作为初始浓度并以100计，按10倍梯度依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4和10-5后，进行rpa反应；其中初始浓度100相当于1/20单条幼虫dna。
如图3中(d)所示，其标号“1”、“2”、“3”、“4”、“5”、“6”分别指的是不同浓度(100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5)象耳豆根结线虫dna的检测结果。
上述图3中(d)的检测结果图表明，象耳豆根结线虫的检出限为1/20条幼虫。
由实施例4可知，本发明的(试剂盒和)方法具有较高的检测灵敏度。
综上所述，由实施例1-4可见，本发明rpa引物、试剂盒及检测方法，为四种常见根结线虫的检测提供了新技术，首次将rpa技术应用到四种常见根结线虫的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、检测效率高、对仪器设备要求较低的特点，对根结线虫病的现场检测、早期诊断和指导科学施药具有重要意义；其中rpa引物分别基于四种常见根结线虫scar序列进行设计，可稳定扩增且特异性较高，实现四种常见根结线虫的检测准确率高；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测效率，可在38℃和20min内完成对四种常见根结线虫dna的恒温扩增，检测效率远高于较传统生理生化检测方法甚至pcr检测方法，解决了现有常规技术存在检测方法所需时间较长、对专业技能要求高、检测结果假阳性高的现象；本发明建立的四种常见根结线虫rpa检测方法操作简单且对仪器设备要求低，不需任何pcr仪，为四种常见根结线虫的现场检测或快速检测提供有力技术支持。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
序列表
<110>安徽农业大学
<120>一种用于检测四种常见根结线虫的rpa引物、试剂盒及检测方法
<141>2018-07-04
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>33
<212>dna
<213>线虫(caenorhabditiselegans)
<400>1
gtatcattatgaagctaagactttgggctacaa33
<210>2
<211>32
<212>dna
<213>线虫(caenorhabditiselegans)
<400>2
tcatcacaacaaccaatacaaacatcccgcta32
<210>3
<211>33
<212>dna
<213>线虫(caenorhabditiselegans)
<400>3
gtgcgcgattgaactgagcccagactgaaacga33
<210>4
<211>33
<212>dna
<213>线虫(caenorhabditiselegans)
<400>4
tatttttcaattggcctccttgagtgggcttat33
<210>5
<211>32
<212>dna
<213>线虫(caenorhabditiselegans)
<400>5
gaaatttgaatgctatgccatcaggagatgtg32
<210>6
<211>32
<212>dna
<213>线虫(caenorhabditiselegans)
<400>6
atacagtatctactcttctccactcgcaggaa32
<210>7
<211>33
<212>dna
<213>线虫(caenorhabditiselegans)
<400>7
ttgccattgataacttttgtgaaagtgccgctg33
<210>8
<211>32
<212>dna
<213>线虫(caenorhabditiselegans)
<400>8
gaaatgaaacatcagttcaggcaggatcaacc32