本发明涉及食品饮料和植物刺激物领域，尤其涉及一种从海藻中提取多糖和甜菜碱的方法。
背景技术：
：“海藻”是海带、紫菜、裙带菜、石花菜等海洋藻类的总称，是生长在海中的藻类。分为大型海藻和微藻两大类，大型海藻种类众多、形态丰富，包括褐藻、红藻、蓝藻和绿藻等四大门类，是植物界的隐花植物，藻类包括大量不同类型以光合作用产生能量的生物。它们一般被认为是简单的，多为细胞的丝状体、膜状体、管状体或叶状体植物即无维管束组织，没有真正根、茎、叶的分化现象；不开花，无果实和种子；无生殖胚但却有叶绿素能像高等植物那样通过光合作用合成有机物供应自身生存的需要。大型海藻生物活性物质有两大类，一类是能被消化吸收的小分子物质，具体有卤族化合物、海藻单宁、萜类化合物等；另一类是难以被消化的粘性多糖，如红藻中的琼胶、卡拉胶、褐藻糖胶、硫酸多糖等。大型海藻多糖(以下简称多糖)是由多个相同或不相同的单糖基通过糖苷键相连形成的链状聚合物，存在于海藻细胞壁及间质，约占海藻干重的50%以上，具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化等多种生物活性及药用价值。海藻中还有甜菜碱，甜菜碱是一系列物质的总称,凡是具有r-(ch3)3n+ch2coo-结构的物质都属于甜菜碱。由于三甲基的存在,甜菜碱这种季铵盐附有明显的含碱的特性。甜菜碱也是一种典型的表面活性剂。在海藻中发现的甜菜碱有甘氨酸甜菜碱(结构最简单的甜菜碱,称为三甲胺乙内酯或三甲基甘氨酸)、y-氨基丁酸甜菜碱、丙氨酸甜菜碱、高丝氨酸甜菜碱(从石纯氨酸衍生而来),石纯氨酸是由高丝氨酸和甘油形成的一种醚;另一种是从海藻中提取出的高丝氨酸甜菜碱的衍生物即1(3),2-二酰基甘油基-3(1)-0-4-(n,n,n-三甲基)高丝氨酸、δ-氨基戊酸甜菜碱、n6-三甲基赖氨酸(即昆布氨酸,它不仅是一种季胺衍生物,还是一种可形成肽键的α-氨基酸)、赖氨酸甜菜碱(其中赖氨酸的两个氮原子都被完全甲基化)、脯氨酸甜菜碱(亦称水苏碱,即脯氨酸二甲基内盐)、顺-4-羟基脯氨酸甜菜碱、反-4-羟基-β-脯氨酸甜菜碱、1,3-二甲基组氨酸、吡啶羧酸甜菜碱、葫芦巴碱(n-甲基烟酸内盐)、龙虾肌碱、n,n-二甲基-1,2,3,6-四氢吡啶-2-羟基盐(蓓豆甜菜碱)。甜菜碱物理外观为白色鳞状或棱状结晶粉末,有轻微特征气味(甜味),分子量117.15,耐高温,熔点293℃,当温度达310℃会分解。溶解度(20℃)160g/100g水,极易溶于水和甲醇等极性溶剂,溶于乙醇,微溶于乙醚。在溶液中根据ph的不同,甜菜碱有着不一样的存在形式,一般在ph<7时分子呈开环状态，ph≥7时呈环状结构。常温下容易吸湿潮解,保湿性强,性质较稳定有着很强的抗氧化性。现有技术中还有没有用于从海藻中提取多糖和甜菜碱的方法。本发明旨在提供一种从海藻中提取多糖和甜菜碱的方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明旨在提供一种从海藻中提取多糖和甜菜碱的方法。一种从海藻中提取多糖和甜菜碱的方法，包括以下步骤：s1、称取已经烘干并粉碎的海藻和水于玻璃容器中，海藻的质量与水的质量之比为1：（30-50）；s2、将步骤s1称取的玻璃容器于功率为210w-490w的微波提取60s-90s得到提取液，过滤除去提取液中的固体得到初级清液；s3、将初级清液浓缩为原来体积的三分之一，加入过量的乙醇，乙醇的浓度大于或等于80%，静置10h，过滤得到多糖和次级提取液，将多糖烘干；s4、将次级提取液ph调节至3-7，经装有732阳离子交换树脂的树脂柱吸附，直至732阳离子交换树脂对甜菜碱吸附饱和；s5、采用1%-9%的氨水对吸附饱和后的732阳离子交换树脂进行洗脱得到洗脱液，对洗脱液进行浓缩干燥，得到甜菜碱。通过微波水提取法，结合何时的海藻与水的比例、微波提取功率以及微波提取时间，将海藻中的多糖以及甜菜碱转移至初级清液中，再利用甜菜碱与多糖分别在水、乙醇中溶解度的差异，实现多糖与甜菜碱的初步分离，再将富含甜菜碱的次级溶液在特定的酸碱值范围下通过732阳离子交换树脂进行吸附，732阳离子交换树脂对甜菜碱的吸附率较高，最后采用氨水溶液进行洗脱，从而完成对甜菜碱的进一步纯化。732阳离子交换树脂对甜菜碱吸附饱和是指732阳离子交换树脂对次级提取液中的甜菜碱不再吸附，即通过装有732阳离子交换树脂的树脂柱的次级提取液中甜菜碱的浓度不再发生变化。优选的，海藻的质量与水的质量之比为1：40。海藻的质量与水的质量之比为1：40时，提取过程中传质效果好，水对多糖以及甜菜碱的提取率高。优选的，步骤s2的微波提取功率为350w。本发明通过实验发现，微波提取功率超过350w后，初步清液中的多糖含量下降，多糖在微波提取功率超过350w后发生分解；因此，微波功率采用350w，保证水对多糖较高的提取率外，避免多糖由于分解发生损耗。优选的，步骤s2微波提取75s。350w微波提取时间太长，多糖容易分解。优选的，步骤s4的ph调节至3。次级提取液的ph为3时，甜菜碱为开环状态，且次级提取液中提供大量的氢离子使甜菜碱离子化后与732阳离子交换树脂磺酸基发生交换从而被吸附，此时732阳离子交换树脂对甜菜碱的吸附率高达94%。优选的，步骤s5采用5%的氨水进行洗脱。采用5%的氨水洗脱，洗脱率高达75%，碱性条件下，氢氧根离子与被吸附的甜菜碱阳离子上的氢离子中和生成水，从而将电中性的甜菜碱分子从732阳离子交换树脂上洗脱，同时避免了现有技术中采用酸性溶液进行阳离子交换洗脱的方式，避免后续对甜菜碱纯度的检测中，甜菜碱与雷氏盐反应产生甜菜碱盐酸盐，影响测试结果的准确性。优选的，步骤s3得到次级清液后，先用717阴离子树脂进行除杂。本实验发现，717阴离子对甜菜碱的吸附率低于6.5%，且对次级提取液中的其他物质有较高的吸附率，将次级清液先通过717阴离子树脂进行吸附，降低次级清液中杂质的含量，避免杂质在使用732阳离子交换树脂吸附以及洗脱甜菜碱的过程中产生影响，提高甜菜碱的最终纯度。本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：通过微波水提取法，结合适当的海藻与水的比例、微波提取功率以及微波提取时间，将海藻中的多糖以及甜菜碱转移至初级清液中，再利用甜菜碱与多糖分别在水、乙醇中溶解度的差异，实现多糖与甜菜碱的初步分离，再将富含甜菜碱的次级溶液在特定的酸碱值范围下通过732阳离子交换树脂进行吸附，732阳离子交换树脂对甜菜碱的吸附率较高，最后采用氨水溶液进行洗脱，从而完成对甜菜碱的进一步提取纯化。具体实施方式下面将结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明。实施例1本实施例提供一种从海藻中提取多糖和甜菜碱的方法，包括以下步骤：s1、称取已经烘干并粉碎的海藻和水于玻璃容器中，海藻的质量与水的质量之比为1：30；s2、将步骤s1称取的玻璃容器于功率为210w的微波提取60s得到提取液，过滤除去提取液中的固体得到初级清液；s3、将初级清液浓缩为原来体积的三分之一，加入过量的乙醇，乙醇的浓度大于或等于80%，静置10h，过滤得到多糖和次级提取液，将多糖烘干；s4、将次级提取液ph调节至5，经装有732阳离子交换树脂的树脂柱吸附，直至732阳离子交换树脂对甜菜碱吸附饱和；s5、采用1%的氨水对吸附饱和后的732阳离子交换树脂进行洗脱得到洗脱液，对洗脱液进行浓缩干燥，得到甜菜碱。实施例2本实施例提供一种从海藻中提取多糖和甜菜碱的方法，包括以下步骤：s1、称取已经烘干并粉碎的海藻和水于玻璃容器中，海藻的质量与水的质量之比为1：40；s2、将步骤s1称取的玻璃容器于功率为350w的微波提取75s得到提取液，过滤除去提取液中的固体得到初级清液；s3、将初级清液浓缩为原来体积的三分之一，加入过量的乙醇，乙醇的浓度大于或等于80%，静置10h，过滤得到多糖和次级提取液，将多糖烘干；s4、将次级提取液ph调节至3，经装有732阳离子交换树脂的树脂柱吸附，直至732阳离子交换树脂对甜菜碱吸附饱和；s5、采用5%的氨水对吸附饱和后的732阳离子交换树脂进行洗脱得到洗脱液，对洗脱液进行浓缩干燥，得到甜菜碱。实施例3本实施例提供一种从海藻中提取多糖和甜菜碱的方法，包括以下步骤：s1、称取已经烘干并粉碎的海藻和水于玻璃容器中，海藻的质量与水的质量之比为1：50；s2、将步骤s1称取的玻璃容器于功率为490w的微波提取90s得到提取液，过滤除去提取液中的固体得到初级清液；s3、将初级清液浓缩为原来体积的三分之一，加入过量的乙醇，乙醇的浓度大于或等于80%，静置10h，过滤得到多糖和次级提取液，将多糖烘干；s4、将次级提取液ph调节至7，经装有732阳离子交换树脂的树脂柱吸附，直至732阳离子交换树脂对甜菜碱吸附饱和；s5、采用9%的氨水对吸附饱和后的732阳离子交换树脂进行洗脱得到洗脱液，对洗脱液进行浓缩干燥，得到甜菜碱。实施例4本实施例提供一种从海藻中提取多糖和甜菜碱的方法，包括以下步骤：s1、称取已经烘干并粉碎的海藻和水于玻璃容器中，海藻的质量与水的质量之比为1：40；s2、将步骤s1称取的玻璃容器于功率为350w的微波提取75s得到提取液，过滤除去提取液中的固体得到初级清液；s3、将初级清液浓缩为原来体积的三分之一，加入过量的乙醇，乙醇的浓度大于或等于80%，静置10h，过滤得到多糖和次级提取液，将多糖烘干；s4、将次级提取液ph调节至3，经装有732阳离子交换树脂的树脂柱吸附，直至732阳离子交换树脂对甜菜碱吸附饱和；s5、采用5%的氨水对吸附饱和后的732阳离子交换树脂进行洗脱得到洗脱液，对洗脱液进行浓缩干燥，得到甜菜碱。步骤s3得到次级清液后，先用717阴离子树脂进行除杂。将实施例1-4提取过程中分别测试多糖的含量、甜菜碱的含量测定，结果如表1所示。表1其中多糖的含量测定：（1）葡萄糖-苯酚硫酸标准曲线取六支试管编号，分别吸取0ml、0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml及1.0ml已配制好的0.1mg/ml标准葡萄糖溶液于25ml比色管中，再用蒸馏水补充至1.0ml，向试液中加入5%苯酚1.0ml，然后快速加入5.0ml浓硫酸（与液面垂直加入，勿接触试管壁，以便与反应液充分混合），静置10分钟，摇匀，然后将比色管放置于30℃水浴中反应20min后于490nm测吸光值(od值)，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，制定标准曲线。（2）多糖含量的测定称量样品20mg溶解并定容至100ml容量瓶中，吸取样品液0.5ml，加蒸馏水补充至1.0ml，然后加入5%苯酚1.0ml和浓硫酸5ml，静置10分钟，摇匀，然后将比色管放置于30℃水浴中反应20min后于490nm测吸光值(od值)，根据标准曲线方程计算总糖含量。样品中多糖含量以质量分数ω计，单位以克每百克(g/100g)表示，则：-----（公式1）公式1中：m1----从标准曲线上查得样品测定液中含糖量μg；v1----样品定容体积，mlm2----样品质量，gv2----比色测定时所移取样品测定液的体积，ml0.9----葡萄糖换算成葡聚糖的校正系数-----（公式2）公式2中：y—多糖提取率（%）m—多糖质量（mg）m—原料质量（mg）。测定甜菜碱含量：本实验采用比色法测定溶液中甜菜碱的含量。在无机酸存在的条件下，甜菜碱与雷氏盐反应，反应具有高度的特异性，生成的银色络合物沉淀溶于丙酮溶液形成紫色溶液，选择在525nm波长下测定其含量，在该波长下，甜菜碱浓度与吸光度呈一定的线性关系。（1）溶液配制甜菜碱标准溶液（1g/l）：准确称取0.1g甜菜碱标准品，溶于蒸馏水中，转移到100ml容量瓶中，定容，每ml该溶液中1mg甜菜碱，用于绘制标准曲线；甜菜碱标准溶液（10g/l）：精密称取甜菜碱标准品1.0g，用适量去离子水溶解并定容于容量瓶中，摇匀。即为10g/l的甜菜碱标准品溶液；雷氏盐饱和液（15g/l）：准确称取1.5g雷氏盐(四硫氰基二氨合铬酸氨)，加入100ml蒸馏水，用搅拌器搅拌溶解45min，过滤后用浓盐酸酸化到ph值为1.0（雷纳克酸季胺化合物在ph为1.0时，沉淀最完全）,用于沉淀季胺化合物，此试剂须现用现配，因为雷氏盐只有在固态时稳定；浓盐酸：用于酸化雷氏盐溶液；丙酮溶液：取分析纯丙酮及蒸馏水按体积比7:3比例混匀，配成70%的丙酮溶液，用于溶解雷纳克酸季胺化合物沉淀；乙醚洗液：取色谱纯乙醚及蒸馏水按体积比99:1比例混匀，配成99%的乙醚溶液，用于洗涤沉淀。（2）甜菜碱标准曲线的绘制取6支洁净的离心管，编号。分别加入1mg/ml的标准甜菜碱溶液1，1.5，2，2.5，3，3.5ml，依次分别加入蒸馏水2.5，2，1.5，1，0.5，0ml，再准确加入7ml雷氏盐饱和溶液，放于冰箱中于4℃冷却1h，取出后用离心机离心15min（4000r/min），弃去上清液，分别加入99%乙醚洗液5ml，混匀后离心15min，弃去上清液，待乙醚挥发干净后，用70%丙酮溶解沉淀，将溶液转移到10ml容量瓶中，定容，待测。把检测波长固定在525nm处，以丙酮溶液为参比测定其吸光度。对所测得的数据采用直线回归法计算出标准曲线的回归方程，并以吸光度为纵坐标，甜菜碱的含量为横坐标，绘制标准曲线。将ph分别为3、5、7、9、11的10mg/ml甜菜碱溶液以恒定流速通过装有2.0g阳离子树脂的层析柱（10x300mm），每5ml收集一次，测定收集液中甜菜碱的浓度，计算得到吸附率，结果如表2所示。表2ph357911吸附率/%94.7791.8090.6388.9886.01将1%、3%、5%、7%、9%氨水溶液以恒定流速通过装有2.0g吸附饱和了的732阳离子交换树脂的层析柱（10x300mm），每5ml收集一次，测定收集液中甜菜碱的浓度，计算得到洗脱率，结果如表3所示。表3氨水浓度1%3%5%7%9%洗脱率/%68.9772.0075.4977.0178.01以上为本发明的其中具体实现方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些显而易见的替换形式均属于本发明的保护范围。当前第1页12