一种快速准确鉴定杂草稻与栽培稻的分子检测方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速准确鉴定杂草稻与栽培稻的分子检测方法。

背景技术

杂草稻是一种混生于稻田中，与栽培稻相伴而生的，在形态上介于野生稻和栽培稻之间的稻属植物。杂草稻对环境具有很强的适应能力，尤其是在稻田中，严重危害水稻生产。目前，在世界主要水稻产区均有发现杂草稻，在美国，由于杂草稻长时间与水稻竞争生长，造成水稻减产多达80%。杂草稻与栽培稻相比具有抽穗早，落粒性强的特点，因此在相同环境条件下，杂草稻成熟落粒的时间更早，造成田间杂草稻的基数逐年扩大。成熟的杂草稻植株比栽培稻分蘖数多，植株更大，根系更发达，在田间与栽培稻争夺养分，水分及光照，造成水稻减产。此外，杂草稻稻谷的种皮或籽粒为红色，成熟度也与栽培稻不同，如果在收获时混入，将直接影响稻米的品质，造成农民的经济损失。近年来随着我国水稻轻型栽培方式的推广，水稻旱直播，水直播及稻麦轮作稻田面积逐年增加，杂草稻的危害情况也越来越严重，我国各主要稻区均有杂草稻的大面积发生的报道，现已成为水稻田中重要的恶性杂草。

由于杂草稻与栽培稻生长周期相近，形态及遗传学背景相似，因此很难筛选到具有高选择性，能够特异性防治杂草稻的化学除草剂，因此最有效的防治杂草稻的方法就是进行预防性控制，即在稻种或秧苗期发现杂草稻植株并及时清理。然而，传统的杂草稻鉴定方法主要是基于株型，分蘖数，粒型等生物学性状的分析，只有到分蘖后期，杂草稻才会表现出比栽培稻植株更高，分蘖数更多，植株的叶鞘，叶舌，颖壳，种皮等部位常表现为红褐色等表型特征，而且有些杂草稻的颖壳颜色与栽培稻十分相似。因此传统的表型鉴定方法存在鉴定标准不明确，个体差异大以及鉴定时间迟等方面的不足，这就需要一种可以在种子萌发期或幼苗期进行快速准确区分杂草稻与栽培稻的方法，从根本上减少稻田中杂草稻的数量。

snp位点是指基因组内单个碱基的插入，转移，颠换，缺失或小片段序列的突变等，常见的突变形式有c→t，c→a，c→g，t→a，它变异来源丰富，分布于整个基因组中，利用不同生物型snp位点的差异，可以建立分子标记方法达到准确鉴定物种的作用。前期研究通过对155个杂草稻与76个栽培稻样本的全基因组测序，筛选出大量snp位点，我们通过再次验证比对确定了3个在杂草稻和栽培稻中都存在的snp位点，基于这些snp位点利用巢式pcr与dcaps方法建立分子标记体系，从分子水平上准确快速地区分杂草稻与栽培稻。

巢式pcr的特点是使用两对pcr引物扩增完整的dna片段。第一对pcr引物扩增片段的方法与普通pcr相似。第二对引物称为巢式引物，即结合在第一次pcr产物内部，使得第二次pcr扩增片断短于第一次扩增，大大提高了pcr反应的特异性与灵敏度。dcaps技术的原理是，根据不同生物型中snp位点的差异，在引物中人为引入错配碱基，使扩增的序列在一种生物型中具有相应的限制性内切酶酶切位点，而另一种生物型中没有，pcr产物酶切后，通过电泳图谱分析可以知道是否存在snp位点。巢式pcr与dcaps技术的结合使用，可以高效准确地定位杂草稻与栽培稻中的snp位点，从而达到鉴定区分杂草稻与栽培稻的目的。该方法的建立可以在水稻种子萌发或幼苗期就快速准确的鉴定杂草稻与栽培稻，从而在早期进行预防性防除，有效地保障栽培稻的正常生长。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种快速准确鉴定杂草稻与栽培稻的分子检测方法的技术方案。

所述的一种快速准确鉴定杂草稻与栽培稻的分子检测方法，其特征在于利用巢式pcr及dcaps分子标记方法对杂草稻与栽培稻snp位点的检测，具体包括以下步骤：

1）提取水稻基因组dna样本；

2）对水稻基因组dna进行巢式pcr扩增；

3）以pcr产物为底物，用相应的限制性内切酶进行酶切反应；

4）通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物鉴定杂草稻与栽培稻。

所述的一种快速准确鉴定杂草稻与栽培稻的分子检测方法，其特征在于所述的步骤2）中巢式pcr的第一轮pcr反应是以snp-f/snp-r为扩增引物，以水稻基因组dna为底物，扩增含有snp位点的dna片段，第二轮pcr反应是以第一轮pcr产物为底物，根据各个snp位点设计含有酶切位点的特异性引物snp1-smai-f/snp1-smai-r、snp2-stui-f/snp2-stui-r和snp3-scai-f/snp3-scai-r，扩增含有特异性酶切位点的dna片段；所述的snp-f的核苷酸序列如seqidno.1所示，snp-r的核苷酸序列如seqidno.2所示，snp1-smai-f的核苷酸序列如eqidno.3所示，snp1-smai-r的核苷酸序列如seqidno.4所示，snp2-stui-f的核苷酸序列如seqidno.5所示，snp2-stui-r的核苷酸序列如seqidno.6所示，snp3-scai-f的核苷酸序列如seqidno.7所示，snp3-scai-r的核苷酸序列如seqidno.8所示。

所述的一种快速准确鉴定杂草稻与栽培稻的分子检测方法，其特征在于所述的步骤3）中用于酶切的限制性内切酶具有特异性，snp1位点采用smai限制性内切酶，酶切位点为ccc^ggg，snp2位点采用stui限制性内切酶，酶切位点为agg^cct，snp3位点采用scai限制性内切酶，酶切位点为agt^act。

所述的一种快速准确鉴定杂草稻与栽培稻的分子检测方法，其特征在于所述的步骤4）中电泳结束后通过凝胶成像仪观察结果，若有100bp单一条带的样本为栽培稻，若有两条50bp的条带，一条50bp条带，弥散状条带的样本为杂草稻。

本发明的有益效果是：（1）本发明相对于传统的表现鉴定方法，可以在水稻幼苗期就进行鉴定，达到早发现早防除杂草稻的目的。（2）本发明采用巢式pcr方法对snp位点进行扩增，保证了扩增反应的特异性和灵敏度，得到的pcr产物可直接用于限制性内切酶酶切反应，最后再进行电泳观察，整个过程不超过6个小时，且需要的仪器和试剂都容易获得且价格低廉，操作简便。（3）本发明针对3个snp位点设计了3对特异性引物，采用检测结果的三重认证来保证结果的准确性。

附图说明

图1为利用dcaps技术对snp1的检测，m，dl2000marker；泳道1，2，3，5，7为栽培稻，泳道4，6，8为杂草稻；

图2为利用dcaps技术对snp2的检测，m，dl2000marker；泳道1，2，3，5，7为栽培稻，泳道4，6，8为杂草稻；

图3为利用dcaps技术对snp3的检测，m，dl2000marker；泳道1，2，3，5，7为栽培稻，泳道4，6，8为杂草稻。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：一种快速准确鉴定杂草稻与栽培稻的分子检测方法，该方法利用dcaps分子标记方法对杂草稻与栽培稻snp位点的检测，具体包括以下步骤：

1）提取待测样本基因组dna样本；

2）进行巢式pcr扩增；

3）用相应的限制性内切酶对pcr产物进行酶切；

4）通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物鉴定杂草稻与栽培稻，具体为若有100bp单一条带的样本为栽培稻，若有两条50bp的条带，一条50bp条带，弥散状条带的样本为杂草稻。

试验例1：

1.根据杂草稻和栽培稻的4个snp位点设计第一轮扩增引物snp-f及snp-r，所得产物长度为337bp，包含3个snp位点，其中后三个位点可以用于建立分子标记体系，该片段序列信息如下：

栽培稻：

tacttcacccgatccttttttaggacactaatgcctcactaacatgtggacctagggatgcaagcagggctagcaagtgggcttttttagcccccttatttcacttctagttcattttttcttctaaattttgtactaccatatgagaaattaactagcaagtgggtttttatgcaggtatgtagcggtactaactacttgcatccctatgtgggccccatatgtgcgttatgcacttgcttgagcatataaatttctgaaacagaattttcatatggctttgactactttcagttagtgtgtgttggtaatatctcataacgatagtagtccatgt。

杂草稻：

tacttcacccgatccttttttaggacactaatgcctcactaacatgtggacctagggatgcaagtggggctagcaagtgggcttttttagcccccttatttcacttctagttcattttttcttctaaattttgtactactatatgagaaattaattagcaagtgggtttttatgtaggtatgtagcggtactaactacttgcatccctatgtgggccccatatgtgcgttatgcacttgcttgagcatataaatttctgaaacagaattttcatatggctttgactactttcagttagtgtgtgttggtaatatctcataacgatagtagtccatgt。

利用软件dcapsfinders2.0及primerprimer5.0，针对三个snp位点的含有酶切位点的特异性上游引物及其下游引物，分别为

snp1-smai-f/snp1-smai-r，

snp2-stui-f/snp2-stui-r，

snp3-scai-f/snp3-scai-r。

引物序列具体如下表：

。

2.选取水稻样本共8个，选取生长至3-4叶期的叶片组织，进行基因组dna提取，根据天根新型植物基因组dna提取试剂盒（dp320）具体的提取方法如下：

（1）处理材料：取植物新鲜组织100mg加入液氮充分碾磨，加入400μl缓冲液lp1和6μlrnasea(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min；

（2）加入130μl缓冲液lp2，充分混匀，旋涡振荡1min，12,000rpm离心5min，将上清移至新的离心管中；

（3）加入1.5倍体积的缓冲液lp3，立即充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀；

（4）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱cb3中（吸附柱放入收集管中），12,000rpm离心30s，倒掉废液，吸附柱cb3放入收集管中；

（5）向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中，如果吸附柱膜呈现绿色，向吸附柱cb3中加入500μl无水乙醇，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱cb3放入收集管中；

（6）重复操作步骤（5）；

（7）将吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱cb3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

（8）将吸附柱cb3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μl无菌超纯水，室温放置2min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存。

3.巢式pcr扩增

（1）第一轮pcr反应体系：

基因组dna（20ng/μl）0.5μl

上游引物snp-f（10μmol/l）0.5μl

下游引物snp-r（10μmol/l）0.5μl

2×specificpcrtaqmix10μl

ddh2o8.5μl

反应条件：预变性94℃、5min；变性94℃，30s，退火51.5℃，30s，延伸72℃、20s，30个循环；最后72℃延伸10min。

（2）第二轮pcr反应体系：

稀释400倍的第一轮pcr产物0.5μl

上游引物（10μmol/l）0.5μl

下游引物（10μmol/l）0.5μl

2×specificpcrtaqmix10μl

ddh2o8.5μl

反应条件：预变性94℃、5min；变性94℃，30s，退火51.5℃，20s，延伸72℃、20s，30个循环；最后72℃延伸10min。

4.pcr产物酶切反应：

pcr产物5μl

10×buffer2μl

bsabuffer2μl（smai酶切反应需加）

内切酶1μl

ddh2o补足至20μl

酶切反应条件为37℃，反应1小时后，加2μl10×loadingbuffer终止反应。

5.酶切产物电泳检测

酶切产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，电泳40min，恒定电压100v。电泳结束后通过凝胶成像仪观察结果，大小为100bp左右的单一条带为栽培稻，没有单一100bp条带（两条50bp的条带，一条50bp条带，弥散状条带）的样本为杂草稻，图1，图2，图3的结果均表明水稻样本1,2,3,5,7为栽培稻，水稻样本4,6,8位杂草稻。

序列表

<110>中国水稻研究所

<120>一种快速准确鉴定杂草稻与栽培稻的分子检测方法

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>1

tacttcacccgatccttt18

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>2

acatggactactatcgtta19

<210>3

<211>44

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>3

aggacactaatgcctcactaacatgtggacctagggatgcccgg44

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>4

gttagtaccgctacatacc19

<210>5

<211>51

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>5

agcccccttatttcacttctagttcattttttcttctaaattttgtaggcc51

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>6

gttagtaccgctacatacc19

<210>7

<211>56

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>7

tttcacttctagttcattttttcttctaaattttgtactaccatatgagaaagtac56

<210>8

<211>19

<212>dna

<213>引物(primer)

<400>8

gttagtaccgctacatacc19