本发明属于医药技术领域，涉及一种木犀草素c环琥珀糖苷衍生物及药学上可接受的盐在制备心血管疾病药物方面的应用，特别涉及一种木犀草素c环琥珀酰糖苷衍生物及药学上可接受的盐在制备抗心肌缺血药物方面的应用。
背景技术：
黄酮类化合物(flavonoidscompounds)是植物次生代谢产物，广泛地存在于自然植物中，以游离态或与糖结合为苷的形式存在，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样，表现出多种多样的药理活性，能防治心脑血管系统的疾病和呼吸系统的疾病，具有抗炎抑菌、降血糖、抗氧化、抗辐射、抗癌、抗肿瘤以及增强免疫能力等药理作用。近年来，黄酮类化合物的研究进入了一个新的层次，随着对其构效关系的深入研究，发现了部分药理作用的作用机制，为其在医药、食品领域的应用提供了理论依据，加快了黄酮类化合物的开发利用。
国外研究者在研究纳豆(大豆发酵食品)等功能食品时，发现了两种新型的黄酮7位琥珀糖苷衍生物(大豆苷元-7-o-琥珀酰糖苷，染料木素-7-o-琥珀酰糖苷)，这两种7位取代的异黄酮琥珀酰糖苷衍生物具有水溶性高(相比于苷元底物，水溶性提高100倍左右)、药理活性强的特点[foodscienceandbiotechnology,2008,17(1):172-175；biologicalandpharmaceuticalbulletin,1999,22(11):1193-1201]。后来研究者们又开发了微生物转化的方法，例如本研究团队之前开发的地衣芽孢杆菌zsp01转化[biotechnologyandappliedbiochemistry,2015,62(2):255-259]，及解淀粉芽孢杆菌fj18转化[naturalproductresearch,doi:10.1080/14786419.2018.1431633]，来实现黄酮类化合物7-o琥珀糖苷取代。
然而，众多研究表明，黄酮a环c-7位氧糖苷键的形成对黄酮类化合物的抗氧化活性不利。因此开发新的黄酮其他位置取代(保留7位oh)的琥珀糖苷取代具有重要意义，例如将琥珀糖苷取代定位到木犀草素的c环3’或4’位，这样有望开发高活性、低毒的木犀草素c环琥珀糖苷衍生物。目前，国际上尚未有关于黄酮类化合物c环3’位及4’位琥珀糖苷取代的报道。如何制备高效、低毒的木犀草素c环琥珀糖苷类药物是本发明的关键所在。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题提供一种木犀草素c环琥珀糖苷化合物(3’-sgl与4’-sgl)，及其在制备治疗中风疾病药物方面的应用。
为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案是：一种木犀草素c环琥珀糖苷化合物，所述的木犀草素c环琥珀糖苷化合物具有下式(1)所示的结构：
为解决本发明的技术问题，本发明的另一技术方案是：一种治疗中风疾病药物，包括活性成分为式(1)所示的木犀草素c环琥珀糖苷化合物，以及药学上可接受的药用辅料。
优选的，包括活性成分为为式(1)所示的木犀草素c环琥珀糖苷化合物或其盐，以及药学上可接受的药用辅料组合制成临床适用的片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂。
优选的，木犀草素c环琥珀糖苷盐指木犀草素c环琥珀糖苷与盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、马来酸、烷基或芳基磺酸形成的盐。
为解决本发明的技术问题，本发明的另一技术方案是：所述的木犀草素c环琥珀糖苷化合物在制备治疗中风疾病药物的用途，所述中风疾病包括脑缺血、脑梗、脑衰竭以及脑血栓。
优选的，所述中风疾病为脑缺血。
本发明所述式(1)化合物，由地衣芽孢杆菌wnj02(保藏编号为cctccno：m2018394)在非水相中制备木犀草素c环琥珀糖苷衍生物而得，反应化学式见下式：
合成方法为：以木犀草素和糖基供体为原料，在地衣芽孢杆菌wnj02的催化作用下，木犀草素3’位或4’酚羟基发生琥珀糖基化反应，形成木犀草素c环琥珀糖苷衍生物(3’-sgl与4’-sgl)。具体分为以下步骤：
步骤(1)：将地衣芽孢杆菌wnj02，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体；
步骤(2)：以木犀草素和糖基供体为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；
步骤(3)：将步骤(1)湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤(2)的溶液中进行催化反应。
所述的磷酸缓冲溶液浓度为100～150mmol/l，ph为8.0。所述的原料溶液，其组分中，木犀草素的浓度为0.01～2g/l，糖基供体的溶液浓度为5～50g/l，非水相溶剂体积百分比为5～20％。所述的非水相溶剂选自甲醇、乙醇、乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、丙酮中的任意一种。所述的非水相溶剂为二甲基亚砜或乙醇。所述的糖基供体选自麦芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、糊精中的任意一种。所述的糖基供体为蔗糖或葡萄糖。
本发明所述木犀草素c环琥珀糖苷衍生物(3’-sgl与4’-sgl)作为新化合物，此前未有报道。
本发明研究3’-sgl与4’-sgl对脑缺血再灌注大鼠的保护作用，以此来验证式(1)所述的木犀草素c环琥珀糖苷衍生物(3’-sgl与4’-sgl)及药学上可接受的盐在制备治疗中风疾病药物方面的应用，尤其是在脑缺血疾病中的应用。方法为将28只雄性sd大鼠随机分为4组：空白组、模型组、a药、b药，每组7只。造模：右侧脑缺血再灌注模型的建立：10％水合氯醛按照3ml/kg剂量麻醉大鼠，鼠板固定大鼠，剪刀剪开颈部皮毛，钝性分离右颈部肌肉，分离右侧颈总动脉，持线钳持线提起颈总动脉近心端，接着用血管钳夹住颈总动脉近脑端，眼科剪在分离出的颈总动脉上开口，将栓线插入开口中，用细线将进入血管内的栓线系紧在血管上，拿掉近脑端的血管钳，将栓线沿着颈总动脉插入颈内动脉，再插入大脑中动脉，最后在颈总开口近心端结扎颈总动脉，2h后拔出栓线，在颈总开口近脑端结扎颈总动脉，缝合颈部皮毛，缺血再灌注模型建立完成。给药：缺血再灌注模型建立完成后，立即按照9mg/kg剂量进行大鼠尾静脉给药，模型组按照同等剂量注入生理盐水。神经评分：再灌注24h后进行大鼠神经行为评分，使用bederson评分法，此评分是是国内外引用频率最高的神经功能评分标准。分为四个功能等级，无神经损伤症状为0分；悬尾实验不能完全伸展对侧前爪为1分；前肢抵抗对侧推力能力下降为2分；向对侧转圈为3分。ttc染色法计算脑梗死体积：神经评分结束后脱臼处死，取全脑置-20℃冰箱冷冻20min，用大鼠脑模具按照1mm标准切片，随后用ttc染色剂染色，放入37℃水浴锅避光加热30min。结果：空白组无神经损伤；模型组的神经评分相比于空白组提高；给予木犀草素-3’-o-琥珀酰葡糖苷(3’-sgl)和木犀草素-4’-o-琥珀酰葡糖苷(3’-sgl)后，神经损伤降低(4’-sgl与3’-sgl效果相当，其中4’-sgl略优于3’-sgl)。空白组大鼠脑切片未出现梗死灶，切片呈现均匀红色。模型组与给药组大鼠脑切片均出现不同大小的白色梗死灶，经体积计算，给药组大鼠梗死体积明显低于模型组梗死体积(p<0.01)，但梗死灶仍然存在。木犀草素c环琥珀糖苷衍生物对脑缺血再灌注大鼠具有显著、低毒的保护作用。
有益效果：
1.本发明提供了一种新化合物即式(1)所述的木犀草素c环琥珀糖苷；
2.本发明所提供的木犀草素c环琥珀糖苷作为一种新的木犀草素c环琥珀糖苷衍生物水溶性高、毒性低在治疗中风尤其是脑缺血疾病方面具有显著疗效，为脑缺血疾病提供了新的药物选择。
附图说明
图1是木犀草素-3’-o-琥珀酰葡糖苷(3’-sgl)的1hnmr谱图。
图2是木犀草素-3’-o-琥珀酰葡糖苷(3’-sgl)的13cnmr谱图。
图3是木犀草素-3’-o-琥珀酰葡糖苷(3’-sgl)的hmbc谱图。
图4是木犀草素-4’-o-琥珀酰葡糖苷(4’-sgl)的1hnmr谱图。
图5是木犀草素-4’-o-琥珀酰葡糖苷(4’-sgl)的13cnmr谱图。
图6是木犀草素-4’-o-琥珀酰葡糖苷(4’-sgl)的hmbc谱图。
图7是木犀草素c环琥珀酰葡糖苷(3’-sgl与4’-sgl)对缺血大鼠神经评分的影响。
图8是木犀草素c环琥珀酰葡糖苷(3’-sgl与4’-sgl)对缺血大鼠梗死体积的影响(每一列为一只大鼠的6个不同剖面)。
本发明提供的地衣芽孢杆菌wnj02(bacilluslincheniformiswnj02)已经于2018年6月22日提交中国典型培养物保藏中心(简称为cctcc，位于中国武汉大学)进行保藏，保藏号为cctccno：m2018394。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
非水相中制备3’-sgl与4’-sgl的菌株的驯化选育
lb液体培养基组成为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，ph7.0；lb平板培养基组成为：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，氯化钠10g/l，琼脂粉20g/l。
筛选培养基组成为：木犀草素0.5g/l，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，氯化钠10g/l，硫酸镁0.5g/l，蔗糖20g/l，dmso10％(v/v)，初始ph7.0。
将实验室保藏的具有黄酮c-7位琥珀糖苷化的菌种(bacillusamyloliquefaciensfj18,bacilluslicheniformiszsp01)作为出发菌种，采用低温驯化手段选育能在木犀草素c环3’或4’位进行琥珀糖苷化的菌种。将冻存的菌株转接到lb平板培养基上，于30℃培养24h；挑取单克隆转接到筛选培养基上；于30℃，180r·min-1水浴振荡培养24h，分别取0，12，24h的样品进行hplc检测；挑选木犀草素转化效率高，或者生成新的产物峰(除出发菌株所能生成的7-o琥珀糖苷产物峰外)的菌种进行冻存。-80℃下冻存48h，再接入到lb平板培养基上，如此反复。经过低温冷冻驯化，获得一株能高效转化木犀草素的菌种wnj02，相比于出发菌株，该菌株经12h既能将1g/l木犀草素转化完全(原出发菌株需要24-36h才能实现)；同时，该菌株转化木犀草素的过程中，还能生成木犀草素-3’-o-琥珀酰葡糖苷和木犀草素-4’-o-琥珀酰葡糖苷两种新化合物。
该菌株在肉汤培养基中生长24h后，菌落大小直径为1.8mm～2.8mm，生长温度范围为20℃～37℃，最适生长温度为30℃，生长ph范围为7.0～9.0，最适生长ph为8.0。菌体呈短杆状，染色均匀，具运动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色表明此菌株为革兰氏阳性菌。通过16srrdna同源性鉴定及系统发育分析，鉴定此菌株为地衣芽孢杆菌，命名为地衣芽孢杆菌wnj02。
实施例2
地衣芽孢杆菌wnj02的发酵及静息细胞的制备
将地衣芽孢杆菌wnj02的发酵接种到种子培养基中：酵母膏5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl10.0g/l，ph7.0，于30℃，200rpm培养12小时。扩大培养基、发酵培养基，其组分和含量均为：蔗糖20g/l，酵母粉15g/l.kh2po41.0g/l，cacl20.8g/l。以naoh调节ph至8.0。种子液按0.5％(v/v)接种到扩大培养基、发酵培养基，于30℃，200rpm培养12小时。10000rpm离心15分钟后收集菌体细胞，以生理盐水洗涤l～2次，得地衣芽孢杆菌wnj02的静息细胞。
实施例3
将实施例2中的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、木犀草素、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为20％(v/v)，木犀草素0.5g/l，磷酸缓冲的摩尔浓度为150mmol/l，磷酸缓冲的ph8.0，蔗糖浓度为50g/l。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养12h后，10000rpm离心10分钟得反应溶液上清，hplc检测分析测得木犀草素转化率为97.2％。
产物用大孔树脂进行分离，取适量树脂，用乙醇浸泡24h后，除去树脂碎片和杂物。湿法装柱
地衣芽孢杆菌wnj02非水相中制备3’-sgl与4’-sgl的反应化学式见下式：
经核磁共振质谱分析鉴定从nmr图谱上看，获得的结构与预期产物的结构一致。以上结果证实该反应中生成了3’位及4’位琥珀酰葡萄糖基化的木犀草素，即3’-sgl与4’-sgl。
木犀草素-3’-o-琥珀酰葡糖苷(3’-sgl)的核磁共振波谱数据为：
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ：7.52-7.63(2h,m,2'and6'-h),6.93(1h,d,j＝9.2hz,5'-h),6.76(1h,s,3-h),6.43(1h,d,j＝2hz,8-h),6.14(1h,d,j＝2hz,6-h),5.03(1h,d,j＝2hz,1”-h)，4.34(1h,d,j＝10.4hz,6”-ha),3.95-4.08(1h,m,6”-hb),3.70-3.82(1h,m,2”-h),3.30-3.40(2h,m,3”and5”-h),3.10-3.20(1h,m,4”-h),2.30-2.40(2h,m,2”'-h),2.15-2.30(2h,m,3”'-h).
13c-nmr(dmso-d6,400mhz)δ：181.7(c-4),173.1(c-4”),172.0(c-1”'),164.2(c-2),163.3(c-7),161.4(c-5),157.3(c-9),150.6(c-4'),145.3(c-3'),121.7(c-6'),121.6(c-1'),116.5(c-5'),113.7(c-2'),103.7(c-10),103.2(c-3),100.6(c-1”),98.9(c-6),94.0(c-8),75.6(c-3”),73.8(c-2”),73.1(c-5”),70.1(c-4”),63.9(c-6”),28.5(c-2”',c-3”').
木犀草素-4’-o-琥珀酰葡糖苷(4’-sgl)的核磁共振波谱数据为：
1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ：7.45(2h,d,j＝9.2hz,2'and6'-h),7.15(1h,d,j＝8.4hz,5'-h),6.74(1h,s,3-h),6.44(1h,d,j＝2hz,8-h),6.14(1h,d,j＝2hz,6-h),4.88(1h,d,j＝7.2hz,1”-h)，4.34(1h,d,j＝10.4hz,6”-ha),3.90-4.10(1h,m,6”-hb),3.55-3.65(1h,m,2”-h),3.20-3.35(2h,m,3”and5”-h),3.10-3.20(1h,m,4”-h),2.50-2.60(4h,m,2”'and3”'-h).
13c-nmr(dmso-d6,400mhz)δ：181.7(c-4),173.4(c-4”),172.0(c-1”'),164.4(c-2),163.1(c-7),161.4(c-5),157.3(c-9),148.3(c-4'),146.9(c-3'),124.8(c-1'),118.4(c-6'),115.8(c-5'),113.6(c-2'),104.0(c-10),103.7(c-3),100.8(c-1”),98.9(c-6),94.0(c-8),75.6(c-3”),73.9(c-2”),73.1(c-5”),70.1(c-4”),63.6(c-6”),28.8(c-2”',c-3”')
实施例4
本发明的木犀草素c环琥珀糖苷在治疗中风疾病方面的应用
方法为将28只雄性sd大鼠随机分为4组：空白组、模型组、a药、b药，每组7只。造模：右侧脑缺血再灌注模型的建立：10％水合氯醛按照3ml/kg剂量麻醉大鼠，鼠板固定大鼠，剪刀剪开颈部皮毛，钝性分离右颈部肌肉，分离右侧颈总动脉，持线钳持线提起颈总动脉近心端，接着用血管钳夹住颈总动脉近脑端，眼科剪在分离出的颈总动脉上开口，将栓线插入开口中，用细线将进入血管内的栓线系紧在血管上，拿掉近脑端的血管钳，将栓线沿着颈总动脉插入颈内动脉，再插入大脑中动脉，最后在颈总开口近心端结扎颈总动脉，2h后拔出栓线，在颈总开口近脑端结扎颈总动脉，缝合颈部皮毛，缺血再灌注模型建立完成。
给药：缺血再灌注模型建立完成后，立即按照9mg/kg剂量进行大鼠尾静脉给药，模型组按照同等剂量注入生理盐水。
神经评分：再灌注24h后进行大鼠神经行为评分，使用bederson评分法，此评分是是国内外引用频率最高的神经功能评分标准。分为四个功能等级，无神经损伤症状为0分；悬尾实验不能完全伸展对侧前爪为1分；前肢抵抗对侧推力能力下降为2分；向对侧转圈为3分。
ttc染色法计算脑梗死体积：神经评分结束后脱臼处死，取全脑置-20℃冰箱冷冻20min，用大鼠脑模具按照1mm标准切片，随后用ttc染色剂染色，放入37℃水浴锅避光加热30min。
统计方法及软件：用左侧脑片面积减去右侧未梗死的红色脑区面积计算出ttc染色后的脑片的缺血面积，用微积分方法计算缺血体积。
结果：如下图7所示，空白组无神经损伤；模型组的神经评分相比于空白组提高；给予木犀草素-3’-o-琥珀酰葡糖苷(3’-sgl)和木犀草素-4’-o-琥珀酰葡糖苷(3’-sgl)后，神经损伤降低(4’-sgl与3’-sgl效果相当，其中4’-sgl略优于3’-sgl)。空白组的脑梗死体积为0，模型组的脑梗死体积为54.36±5.12,3’-sgl组的脑梗死体积为43.77±9.90，4’-sgl组的脑梗死体积为42.09±10.01。如下图8所示，空白组大鼠脑切片未出现梗死灶，切片呈现均匀红色。模型组与给药组大鼠脑切片均出现不同大小的白色梗死灶，经体积计算，给药组大鼠梗死体积明显低于模型组梗死体积(p<0.01)，但梗死灶仍然存在。木犀草素c环琥珀糖苷衍生物对脑缺血再灌注大鼠具有显著、低毒的保护作用。
实施例5
片剂的制备
处方(以1000片的处方量计)：
实施例3中所得3’-sgl(或4’-sgl)纯品60g；
蔗糖60g；
玉米淀粉80g；
硬脂酸镁2g。
制备方法：将活性成分与蔗糖、玉米淀粉混合，加水湿润，搅拌均匀，干燥，粉碎过筛，加入硬脂酸镁，混合均匀，压片。平均片重202mg/片，活性成分含量为60mg。
实施例6
注射液的制备
处方：(以1000支的处方量计)
实施例3中所得3’-sgl(或4’-sgl)纯品10g；
丙二醇100g；
注射用水加至1000ml。
将处方量的3’-sgl(或4’-sgl)纯品溶解于丙二醇中，加注射用水至1000ml，混合均匀，过滤，将所获得的溶液在无菌条件下分装于安瓿瓶中，制成1ml/瓶注射液，活性成分含量为10mg/ml。