本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种鉴别铁皮石斛和霍山石斛的issr引物及其反应体系。
背景技术：
石斛类药材作为名贵中药，药用历史悠久、来源广泛,掺伪现象极为突出。其中霍山石斛和铁皮石斛因形态结构的相似性，常相互混伪。铁皮石斛(dendrobiumofficinalekimuraetmigo)为兰科石斛属最为珍稀名贵的种，药用部位为新鲜或干燥茎，具有益胃生津、滋阴清热、润肺止咳、明目强身等功效。霍山石斛(dendrobiumhuoshanensec.z.tangets.j.cheng)，又名霍石斛、霍斛、米斛、大别山石斛，是兰科植物种类最多和分布最广的属之一。铁皮石斛的生长周期缓慢，生长条件苛刻，市场需求大，因而出现了伪品。而霍山石斛名贵稀有，导致经常出现以铁皮石斛冒充的现象。因此，构建高效快捷的鉴别体系对于铁皮石斛和霍山石斛的鉴定及资源保护具有重要意义。
分子标记技术能从dna水平上反映物种的遗传差异，是研究遗传多样性的有效方法。issr是一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记，因其简便迅速、多态性高、重复性好等优点被广泛应用于动植物的品种鉴定等。但issr标记是一种随机性标记方法，不同物种甚至同一物种不同条件下其试验参数均有差异，因此建立一个科学合理的issr-pcr反应体系，探寻最佳的pcr各组分的用量，可以为进一步利用issr标记鉴别铁皮石斛和霍山石斛提供理论依据。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种优化后的鉴别铁皮石斛和霍山石斛的issr-pcr分子标记体系。
本发明具体通过以下技术方案实现：
一种鉴别铁皮石斛和霍山石斛的issr引物，所述的issr引物包括ubc817、ubc826、ubc827、ubc834、ubc842或ubc849六条特异性引物，具体为：
ubc817：cacacacacacacacaa；
ubc826：acacacacacacacacc；
ubc827：acacacacacacacacg；
ubc834：agagagagagagagagyt；
ubc842：gagagagagagagagayg；
ubc849：gtgtgtgtgtgtgtgtya。
本发明还提供了一种鉴别铁皮石斛和霍山石斛的反应体系，具体包括以下步骤：
1)采集铁皮石斛和霍山石斛的嫩叶，用于提取植物组dna；
2)采用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性；
3)采用issr-pcr反应体系对步骤(1)所提取的dna样品进行扩增。
所述的issr-pcr反应所用的引物为ubc817、ubc826、ubc827、ubc834、ubc842或ubc849。
所述的issr-pcr的扩增体系为：20μl的反应体系中含有2×taqmastermix11.5μl，模板dna35ng，引物0.4μm。
所述的issr-pcr的扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52.2～56.2℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃再延伸10min，4℃保存。
本发明还提供了上述引物ubc817、ubc826、ubc827、ubc834、ubc842和ubc849在鉴别铁皮石斛和霍山石斛中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明提供一种鉴别铁皮石斛和霍山石斛的issr引物，并在该引物的基础上建立了利用issr分子标记鉴别铁皮石斛和霍山石斛的体系，根据结果显示，该体系扩增的条带清晰稳定，具有较好的多态性特点，操作步骤较少，易于快速分析检测。
附图说明
图1为本发明issr-pcr均匀设计试验的扩增结果；其中m表示：marker；dna模板为铁皮石斛；引物为ubc834；1-12为表3的处理组合1-12；
图2为本发明2×taqmastermix作为单因素的issr-pcr扩增结果；m表示：marker；dna模板为铁皮石斛；引物为ubc834；2×taqmastermix的量从左到右依次为：12μl，10μl，8μl，6μl，4μl，2μl；
图3为本发明2×taqmastermix微调的issr-pcr扩增结果；m表示：marker；dna模板为铁皮石斛；引物为ubc834；2×taqmastermix的量从左到右依次为：10μl，10.2μl，10.4μl，10.6μl，10.8μl，11μl，11.2μl，11.4μl，11.6μl，11.8μl；
图4为本发明引物作为单因素的issr-pcr扩增结果；m表示：marker；dna模板为铁皮石斛；引物为ubc834；引物的量从左到右依次为：1μl，2μl，3μl，4μl，5μl；
图5为本发明引物微调的issr-pcr扩增结果；m表示：marker；dna模板为铁皮石斛；引物为ubc834；引物的量从左到右依次为：2.8μl，3μl，3.2μl，3.4μl，3.6μl，3.8μl，4μl，4.2μl；
图6为本发明dna作为单因素的issr-pcr扩增结果；m表示：marker；dna模板为铁皮石斛；引物为ubc834；dna的量从左到右依次为：0.5μl，1μl，1.5μl，2μl，2.5μl，3μl，3.5μl；
图7为本发明优化后鉴别铁皮石斛和霍山石斛的issr-pcr扩增结果；m表示：marker；dna模板为铁皮石斛和霍山石斛；引物从左到右依次为：ubc826，ubc827，ubc834，ubc842，ubc849，ubc817。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1issr-pcr扩增体系的建立与优化
1、dna的提取
将研钵用清水洗净晾干，加入5ml的无水乙醇后点燃，待研钵晾凉后，取采集到的铁皮石斛及霍山石斛嫩芽500mg于研钵中，倒入适量液氮，以液氮没过样品2～3cm高度为宜，研磨3～5min，然后采用试剂盒法提取石斛基因组dna。
2、issr-pcr扩增体系的建立
1)issr-pcr反应体系的均匀设计试验方案
采用u12(43)均匀设计表，pcr扩增体系的因素水平见表2。以ubc834为引物，铁皮石斛的基因组dna为模板，利用表3中的12个反应体系对issr-pcr进行优化筛选，反应体系为20μl，具体见表3。
issr-pcr扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃再延伸10min，4℃保存。
表1筛选的引物及序列
表2因素水平表(单位：μl)
表3均匀设计试验表u12(43)/单位：μ
结果如图1所示，除7、9以外，其他处理均有扩增条带。其中处理2、3有三条扩增带，其他处理均只有两条扩增条带，且处理3的条带较处理2的条带清晰，这表明处理3为较为理想的扩增条件。
2)2×taqmastermix作为单因素的issr-pcr试验方案
根据均匀设计试验结果，以ubc834为引物，铁皮石斛的基因组dna为模板，在20μl的反应体系中，设计2×taqmastermix的量分别为2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl进行issr-pcr，引物、dna及ddh2o的用量见表4。
issr-pcr扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃再延伸10min，4℃保存。
表42×taqmastermix的单因素试验表(单位：μl)
2×taqmastermix的单因素试验结果见图2，处理4、5、6有扩增条带，且处理5有三条扩增条带，这表明处理5为较为理想的扩增条件。
3)2×taqmastermix作为单因素的issr-pcr微调试验方案
根据均匀设计试验结果，以ubc834为引物，铁皮石斛的基因组dna为模板，在20μl的反应体系中，设计2×taqmastermix的量分别为10μl、10.2μl、10.4μl、10.6μl、10.8μl、11μl、11.2μl、11.4μl、11.6μl、11.8μl进行issr-pcr，引物、dna及ddh2o的用量见表5。
issr-pcr扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃再延伸10min，4℃保存。
表52×taqmastermix微调试验表(单位：μl)
2×taqmastermix微调试验结果见图3，所有处理均有扩增条带。处理8、9、10的扩增条带更清晰，为较为理想的扩增条件。
4)引物作为单因素的issr-pcr试验方案
以ubc834为引物，铁皮石斛的基因组dna为模板，在20μl的反应体系中，设计引物的量分别为1μl、2μl、3μl、4μl、5μl进行issr-pcr，2×taqmastermix、dna及ddh2o的用量见表6。
issr-pcr扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃再延伸10min，4℃保存。
表6引物的单因素试验表(单位：μl)
引物单因素试验结果见图4，所有处理均有扩增条带。处理1、2条带数较处理3、4、5，说明处理3、4、5为较为理想的扩增条件。
5)引物作为单因素的issr-pcr微调试验方案
以ubc834为引物，铁皮石斛的基因组dna为模板，在20μl的反应体系中，设计引物的量分别为2.8μl、3μl、3.2μl、3.4μl、3.6μl、3.8μl、4μl进行issr-pcr，2×taqmastermix、dna及ddh2o的用量见表7。
issr-pcr扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃再延伸10min，4℃保存。
表7引物微调试验表(单位：μl)
引物微调试验结果见图5，所有处理均有条带，且处理3、4、5、6、7条带较为清晰，为较理想的扩增条件。
6)dna作为单因素的issr-pcr试验方案
以ubc834为引物，铁皮石斛的基因组dna为模板，在20μl的反应体系中，设计dna的量分别为0.5μl、1μl、1.5μl、2μl、2.5μl、3μl、3.5μl进行issr-pcr，2×taqmastermix、dna及ddh2o的用量见表8。
issr-pcr扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53.6℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃再延伸10min，4℃保存。
表8dna的单因素试验表(单位：μl)
dna的单因素试验结果见图6，所有处理均有条带，且处理3、6、7条带更清晰，为较理想的扩增条件。
实施例2
铁皮石斛来源：大冶康之堂农业发展有限公司。
霍山石斛来源：中国中药霍山石斛科技有限公司。
采用优化后的反应体系，以ubc826，ubc827，ubc834，ubc842，ubc849，ubc817为引物，铁皮石斛和霍山石斛的dna样本为模板，进行优化体系的pcr验证。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，52.2～56.2℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环35次，72℃再延伸10min，4℃保存。
退火温度：
采用优化后的反应体系及筛选后的引物ubc826，ubc827，ubc834，ubc842，ubc849，ubc817，以铁皮石斛和霍山石斛的dna样本为模板，进行优化体系的pcr验证，结果表明，扩增条带清晰稳定，特征带明显(图7，白色方框为特征带)，说明该反应体系及所选引物适合铁皮石斛及霍山石斛的issr分析。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110>湖北省农业科学院中药材研究所
<120>一种鉴别铁皮石斛和霍山石斛的issr引物及其方法
<141>2018-07-10
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
cacacacacacacacaa17
<210>2
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
acacacacacacacacc17
<210>3
<211>17
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
acacacacacacacacg17
<210>4
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
agagagagagagagagyt18
<210>5
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gagagagagagagagayg18
<210>6
<211>18
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
gtgtgtgtgtgtgtgtya18