本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记、引物及其应用。
背景技术：
甘蓝是十字花科芸薹属作物，包含结球甘蓝、花椰菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝和芥蓝等不同变种，是世界上主要的蔬菜栽培类型。根肿病是由芸薹根肿菌(plasmodiophorabrassicaeworonin)侵染所致，专性寄生十字花科植物根部，引起植株地上部萎蔫，叶片变黄，根生长不良，根部出现肿大的纺锤形或不规则状的根瘤状物的病害。根肿病是一种强传染性的世界性土传病害，甘蓝主产区感染面积呈现逐年加重、蔓延范围逐渐扩大的趋势，给生产上带来巨大的经济损失。因此，选育抗根肿病的甘蓝品种是解决该问题的重要途径，而实现该育种目标的前提是对甘蓝材料的根肿病抗性的有效鉴定和筛选。
目前，根肿病抗性鉴定和筛选的方法主要有两种，一种是利用根肿菌灌根接种苗期植株，该鉴定方法所需时间长，鉴定结果的准确性易受鉴定时的环境条件、温度变化等因素的干扰，为防止根肿病菌的传播，需要建立专门的鉴定圃或者鉴定设施。另一种方法是分子标记辅助选择，即利用与根肿病抗性基因紧密连锁的dna分子标记进行育种材料根肿病抗性鉴定。该方法不受环境、场地等条件限制，具有鉴定时间短、结果准确、可靠的特点。前期，本实验室结合室内接种鉴定和田间接种鉴定结果，筛选出抗根肿病甘蓝品种gz87，其中该材料室内接种鉴定的病情指数为6.25，田间病情指数为0。利用该高抗根肿病材料与和高感根肿病的甘蓝自交系杂交，构建了高密度分子标记遗传图谱，但是没有找到与根肿病抗性紧密相关的分子标记，仍然需要传统的根肿病抗性鉴定方法来评价植株抗性。
技术实现要素：
本发明的目的之一是提供一种用于甘蓝根肿病抗性鉴定的分子标记，所述分子标记可用于甘蓝抗根肿病育种材料、品种的快速鉴定以及转育根肿病抗性材料的分子辅助选择。
用于鉴定甘蓝根肿病抗性的分子标记为ccr-scar1或ccr-scar2，ccr-scar1的核苷酸序列如seqidno.1所示，ccr-scar2的核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明目的之二是提供分子标记ccr-scar1的特异性扩增引物对ccr1和分子标记ccr-scar2的特异性引物对ccr2，其中，ccr1的上游引物f-ccr1的核苷酸序列如seqidno.3所示，ccr1的下游引物r-ccr1的核苷酸序列如seqidno.4所示；ccr2的上游引物f-ccr2的核苷酸序列如seqidno.5所示，ccr2的下游引物r-ccr2的核苷酸序列如seqidno.6所示。
本发明的目的之三是提供上述分子标记和引物应用于甘蓝根肿病抗性鉴定中的方法，所述应用方法包括如下步骤：
(1)以鉴定材料的基因组dna为模板，分别利用引物对ccr1或引物对ccr2进行pcr扩增获得扩增产物；
(2)将扩增产物进行电泳分离，若存在401bp或355bp条带，则待鉴定材料具有根肿病抗性；若不存在相应条带，则待鉴定材料不具有根肿病抗性。
优选的，利用上述引物对ccr1或ccr2进行pcr扩增的反应体系如下所示：所述反应体系总体积25μl，其中模板(100ng/μl)3.0μl；引物对ccr1或ccr2(10μm)1.0μl；dntp(100mm)0.5μl；taqbuffer10×(mg2+plusbuffer)2.5μl；taqdnapolymerase(5u/μl)0.2μl；ddh2o补足25μl。
优选的，利用上述引物对ccr1进行pcr扩增的程序为：95℃3min，(95℃30s、62℃30s、72℃30s)循环7次，(95℃30s、58.5℃30s、72℃30s)循环22次，72℃10min，扩增完成后4℃保存。
优选的，上述利用引物对ccr2进行pcr扩增的程序为：95℃3min，(95℃30s，55℃30s，72℃30s)循环28次，72℃10min，扩增完成后保存在4℃条件下。
将上述分子标记ccr-scar1和ccr-scar2或/和分子标记ccr-scar1和ccr-scar2对应的引物对ccr1和ccr2在甘蓝根肿病抗性的鉴定及转育甘蓝根肿病抗性基因/位点到其他十字花科植物中的分子标记辅助鉴定筛选中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明利用该抗根肿病品种gz87、gz87与感病甘蓝材料263杂交分离后代，结合大量非抗性甘蓝材料，从100条rapd引物中筛选到两个rapd标记与根肿病抗性紧密连锁，并在此基础上成功开发出了两个稳定的scar标记，可用于根肿病抗性材料/品种的分子辅助筛选。
本发明的有益效果在于：
1.本发明开发的根肿病抗性连锁标记特异性引物对ccr1和ccr2，具有特异性强，准确性和稳定性高的特点；
2.应用引物对ccr1获得的分子标记ccr-scar1；引物对ccr2获得的ccr-scar2分子标记进行根肿病抗性检测，相对于rapd标记，明显提升材料抗性鉴定的稳定性和可靠性。
3.本发明提供的应用方法适用于甘蓝根肿病抗源的高通量筛选和转育材料抗性的精确鉴定，在十字花科植物根肿病抗性育种中具有重要的应用价值。
附图说明
图1是抗根肿病甘蓝品种gz87的特异rapd1-400条带。gz87：抗根肿病甘蓝品种；f416、201、219、222、263：感根肿病甘蓝材料。
图2是抗根肿病甘蓝品种gz87的特异rapd2-600条带。gz87：抗根肿病甘蓝品种；f416、201、219、263：感根肿病甘蓝材料。
图3是ccr-scar1分子标记辅助筛选抗根肿病甘蓝类品种和感根肿病的甘蓝类品种及材料的结果图。m为标准dna分子标记(trans2kplusdnamarker)；代号：1、8、9、10、gz87：抗根肿病结球甘蓝品种；5：抗根肿病抱子甘蓝品种；6：抗根肿病青花菜品种；7：抗根肿病花椰菜品种；2、3、4：感根肿病结球甘蓝品种；f416、263、201：感根肿病结球甘蓝材料。
图4是ccr-scar2分子标记辅助筛选抗根肿病甘蓝类品种和感根肿病的甘蓝类品种及材料的结果图。m为标准dna分子标记(trans2kplusdnamarker)；代号：1、8、9、10、gz87：抗根肿病结球甘蓝品种；5：抗根肿病抱子甘蓝品种；6：抗根肿病青花菜品种；7：抗根肿病花椰菜品种；2、3、4：感根肿病结球甘蓝品种；f416、263、201：感根肿病结球甘蓝材料。
图5是抗根肿病ccr-scar1分子标记ccr1-401与rapd1-400序列比对结果；
图6是抗根肿病ccr-scar2分子标记ccr2-355与rapd2-600序列比对结果；
图7是利用引物对ccr1进行分子标记辅助筛选抗根肿病甘蓝品种gz87与感病甘蓝材料263杂交分离群体的结果图。m为标准dna分子标记(trans2kplusdnamarker)。
图8是利用引物对ccr2进行分子标记辅助筛选抗根肿病甘蓝品种gz87与感病甘蓝材料263杂交分离群体的结果图。m为标准dna分子标记(trans2kplusdnamarker)。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行进一步的说明，本发明中所用试剂与材料无特别说明的均为通过商业途径购买获得。
实施例1：甘蓝抗根肿病特异标记的筛选与纯化
前期研究中，我们通过对大量甘蓝品种和材料的根肿病抗性鉴定，筛选出抗根肿病甘蓝品种gz87，并对其进行连续三年的室内和室外根肿病抗性鉴定，发现其根肿病抗性稳定，室内接种鉴定的病情指数为6.25，田间病情指数为0。以抗根肿病甘蓝品种gz87，感根肿病甘蓝材料f416、201、219、222、263(其中，263室内接种鉴定的根肿病病情指数为39.97)为供试材料，同时结合抗根肿病甘蓝品种gz87与感病材料(263)杂交分离后代群体，从100条rapd引物中，筛选出两条rapd引物(rapd1和rapd2)的扩增产物与根肿病抗性连锁(图1、2)。
对pcr反应体系和扩增程序进行优化。其中优化后的反应体系为：总体积为25μl，模板(100ng/μl)3.0μl；引物(10μm)1.0μl；dntp(100mm)0.5μl；taqbuffer10x(mg2+plusbuffer)2.5μl；mgcl2(25mm)1.5μl；taqdnapolymerase(5u/μl)0.2μl；ddh2o补足25μl。优化后的扩增程序为：94℃预变性3min，(94℃10s，36℃30s，72℃1min5s)循环1次，(94℃10s，36℃30s，72℃1min5s)循环40次，72℃延伸5min，4℃保存。扩增产物采用1.8％琼脂糖凝胶电泳，电压50v，电泳1h左右，在紫外凝胶成像仪中进行观察与分析。
与感病材料相比，抗根肿病甘蓝品种gz87用rapd1引物扩增出现一条约400bp的特异条带rapd1-400；用rapd2引物扩增出一条约600bp的特异性条带rapd2-600，而在感病材料中缺少这两个条带。用dna回收试剂盒对特异性片段进行回收和纯化，纯化后的rapd—pcr产物克隆于pmdtm19-tvector载体上，转化大肠杆菌感受态dh5α感受态，通过蓝白斑筛选，pcr筛选阳性克隆重组质粒后送华大基因组公司测序。
实施例2：甘蓝抗根肿病scar引物的设计与鉴定
实施例1中的克隆子测序结果显示，抗根肿病甘蓝品种中两对rapd引物扩增出的特异条带rapd1-400和rapd2-600的核苷酸序列长度分别为401bp和603bp。分别将两条核苷酸序列在ncbi(nationalcenterofbiotechnologyinformation)数据库中进行比对，没有发现同源性高的序列；在甘蓝数据库(bolbase)里进行序列比对，也无同源性高的序列。根据rapd1-400的核苷酸序列，设计了8对scar引物；根据rapd2-600核苷酸序列，设计了5对scar引物(表1)。将这13对引物在抗根肿病甘蓝品种gz87和感病甘蓝材料f416、201、219、222、263中进行筛选和鉴定，结果发现，只有引物对ccr1和ccr2可用于鉴定gz87。引物对ccr1在抗根肿病甘蓝品种gz87中扩增出401bp条带，引物对ccr2扩增出355bp条带，而感病甘蓝材料中无任何条带，说明这两个标记为显性标记(图3、4)。将引物对ccr1和引物对ccr2的pcr扩增产物ccr1-400和ccr2-355进行测序，发现获得的核苷酸序列与rapd1-400和rapd2-600的核苷酸序列匹配(图5、6)。说明筛选到的ccr1-401和ccr2-355是抗根肿病甘蓝品种gz87的特异条带。
引物对ccr1和引物对ccr2的pcr反应体系体积为25μl，其中模板(100ng/μl)3.0μl；引物对ccr1或ccr2(10μm)1.0μl；dntp(100mm)0.5μl；taqbuffer10×(mg2+plusbuffer)2.5μl；taqdnapolymerase(5u/μl)0.2μl；ddh2o补足25μl。
引物对ccr1的pcr扩增程序为：95℃3min，(95℃30s、62℃30s、72℃30s)循环7次，(95℃30s、58.5℃30s、72℃30s)循环22次，72℃10min，保存在4℃条件下。
引物对ccr2的pcr扩增程序为：95℃3min，(95℃30s，55℃30s，72℃30s)循环28次，72℃10min，保存在4℃条件下。
表1设计的scar引物序列
实施例3：甘蓝根肿病特异性scar分子标记快速鉴定抗根肿病甘蓝品种
利用引物对ccr1和引物对ccr2对8个抗根肿病甘蓝类品种(1、8、9、10、gz87：抗根肿病结球甘蓝品种；5：抗根肿病抱子甘蓝品种；6：抗根肿病青花菜品种；7：抗根肿病花椰菜品种)；8个感根肿病甘蓝品种和材料(2、3、4：感根肿病结球甘蓝品种；263、f416、201、219、222：感根肿病结球甘蓝材料)进行pcr扩增，反应体系体积为25μl，其中模板(100ng/μl)3.0μl；引物对ccr1或ccr2(10μm)1.0μl；dntp(100mm)0.5μl；taqbuffer10×(mg2+plusbuffer)2.5μl；taqdnapolymerase(5u/μl)0.2μl；ddh2o补足25μl。
引物对ccr1的pcr扩增程序为：95℃3min，(95℃30s、62℃30s、72℃30s)循环7次，(95℃30s、58.5℃30s、72℃30s)循环22次，72℃10min，保存在4℃条件下。
引物对ccr2的pcr扩增程序为：95℃3min，(95℃30s，55℃30s，72℃30s)循环28次，72℃10min，保存在4℃条件下。
取10μlpcr反应产物与1μl上样缓冲液混匀在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，用1×tae为电泳缓冲液，电压110v下电泳20分钟，凝胶分析系统进行照相分析。
在8个抗根肿病甘蓝类品种中，引物对ccr1扩增出401bp特异条带，引物对ccr2扩增出355bp特异条带，所有抗根肿病甘蓝品种中含有ccr-scar1和ccr-scar2两个标记，其余3个感病甘蓝品种和5个感病甘蓝材料中均无任何条带产生(图3、图4)。说明这两个scar标记为显性标记，可用于抗根肿病甘蓝品种的分子标记辅助筛选。
实施例4：抗根肿病甘蓝品种gz87与感根肿病材料263杂种cp分离群体的甘蓝根肿病抗性的分子标记辅助选择
以抗根肿病甘蓝品种(gz87)与感病材料(263)杂交，构建cp分离群体的无性系。利用引物对ccr1和引物对ccr2对分离群体的110个无性系进行基因型分型。反应体系体积为25μl，其中模板(100ng/μl)3.0μl；引物对ccr1或ccr2(10μm)1.0μl；dntp(100mm)0.5μl；taqbuffer10×(mg2+plusbuffer)2.5μl；taqdnapolymerase(5u/μl)0.2μl；ddh2o补足25μl。
引物对ccr1的pcr扩增程序为：95℃3min，(95℃30s、62℃30s、72℃30s)循环7次，(95℃30s、58.5℃30s、72℃30s)循环22次，72℃10min，保存在4℃条件下。
引物对ccr2的pcr扩增程序为：95℃3min，(95℃30s，55℃30s，72℃30s)循环28次，72℃10min，保存在4℃条件下。
取10μlpcr反应产物与1μl上样缓冲液混匀在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，用1×tae为电泳缓冲液，电压110v下电泳20分钟，凝胶分析系统进行照相分析。
分离群体的110个株系中，56个基因型能扩增出特异性条带，54个基因型未扩增出特异性条带，抗病标记和感病标记的比例约为1:1，说明了这两个鉴定根肿病抗性的分子标记为显性单基因分子标记(图7，图8)。
实施例5：gz87与263杂种bc1群体的甘蓝根肿病抗性鉴定
以利用分子标记ccr-scar1和ccr-scar2鉴定后的cp无性系分离群体为亲本，选单株与感病材料263进行回交，获得bc1回交群体。对bc1群体进行根肿病苗期灌根接种鉴定，统计bc1群体的根肿病病情指数。并将具有ccr-scar1和ccr-scar2标记的cp单株产生的bc1株系病情指数，无ccr-scar1和ccr-scar2标记的cp单株产生的bc1株系病情指数，和感病对照甘蓝材料263的病情指数进行方差分析，发现凡是含有ccr标记的株系平均病情指数为13.13，显著低于无ccr标记的株系的平均病情指数(32.19)和对照263的病情指数(39.97)(p<0.05)。说明了含有scar分子标记的株系为抗病株系，无scar分子标记的为感病株系，并且这两个scar标记可以用于甘蓝根肿病抗性分子标记辅助筛选。
本发明所涉及的scar标记对甘蓝根肿病具有特异性，能够用于鉴定甘蓝根肿病抗性分子标记辅助选择。这是目前国际首例有关甘蓝根肿病抗性鉴定的特异性scar分子标记。
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