本发明属于生物技术领域，具体涉及一种丁香疫霉菌的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法。
背景技术：
丁香疫霉(phytophthoraramorum)属于卵菌门(oomycota)、卵菌纲(oomycetes)、霜霉目(peronosporales)、腐霉科(pythiaceae)、疫霉属(phytophthora)。该菌寄主分布范围广，主要分布于美国、日本、加拿大、英国、法国、德国、意大利、澳大利亚等国，在我国未有发生报道。该病菌主要通过被侵染病菌的幼成年苗、泥土和果实远距离传播。病菌主要侵染柑橘类水果、李属类水果、火棘、丁香、欧洲板栗、橡树等14个科29个属的植物，引起寄根、茎、叶、果实多种病变，是一种危害性极大的重要的植物病原菌，于2007年被列入我国进境植物检疫性有害生物名单。2011年，天津市检验检疫局首次在美国脐橙上截获丁香疫霉。被病菌侵染的柑橘类果实会逐渐褐腐、枝干流胶、根颈部脚腐和根腐，植株活性降低，出现枯萎，叶片褪绿萎蔫，最后会导致植物整株的死亡，严重影响果实产量和品质，带来重大经济损失，严重威胁世界柑橘生产。我国水果产量位居世界第一，是生产水果的大国，种植面积近1000万hm2，平均每年的产量带来的收益超过2800亿元。水果种植已成为农业生产行业致富的重要途径，对我国的农村经济和社会经济的发展起到了非常重要的作用。该疫霉一旦传入我国并定殖将对我国的水果种植业造成毁灭性的打击香疫霉可侵染樟属植物引起根部腐烂以及枝干溃疡等病害，会对樟属植物造成毁灭性打击。丁香疫霉寄主广泛，可以侵染上千种植物。据报道，丁香疫霉已经造成澳大利亚西南地区森林发生结构和植物种群变化，已经严重威胁到当地自然生态系统以及生物多样性。目前对该病害还没有有效的防治措施，加强检疫，防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。为此应加强疫情监测，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低樟树疫病引起的损失。
传统的丁香疫霉的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统的分离疫霉菌的方法采用诱捕法从土壤、灌溉水和植物材料中分离疫霉菌。为了提高诱捕效果，可在土壤溶液中加入少量抗生素和杀菌剂抑制杂菌生长。适用于做诱饵的植物材料因不同疫霉菌也有所不同，松针适合用于诱捕丁香疫霉。传统方法在丁香疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。随着分子生物学的发展，pcr技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势。普通pcr的方法已经成功用于检测丁香疫霉，虽然pcr法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时pcr法依赖精密的温度循环装置，其检测灵敏度比较高、检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。丁香疫霉的三重pcr同步分子检测方法，以热激蛋白hsp90序列为检测目标，用14种疫霉病菌的15个菌株对引物特异性进行验证，结果常规pcr和多重pcr的检测灵敏度分别为200pg和2ng，常规pcr检测低限为12pg，两者相差近10倍。pcr荧光检测和常规检测已经在进境的一些李属、柑橘属水果上进行了快速检测，同时还开展了其它寄主上丁香疫霉的测试，荧光检测和常规检测便于在口岸实验室应用和推广，特异性较好，灵敏度高。三重pcr同步分子检测方法可有效促进进境水果的快速通关，可以可靠地检测在口岸与田间的检疫性病原菌，但其缺陷在于引物多对，容易导致引物二聚体或错配，使其灵敏度下降。
环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，环介导等温扩增)是一种新的核酸扩增技术，因其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代pcr的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，64℃范围80min内，大量合成目标dna的同时伴随有副产物--白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于环介导等温扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于环介导等温扩增反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自环介导等温扩增检测技术建立以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，丁香疫霉的检测国内外均未见报道。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术中丁香疫霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种丁香疫霉的环介导等温扩增检测引物组合物。本发明的另一目的是提供上述丁香疫霉的环介导等温扩增检测试剂盒。本发明另一目的是提供上述丁香疫霉的环介导等温扩增检测方法。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于检测丁香疫霉的环介导等温扩增引物组合物，其特征在于：由正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3组成；各引物序列具体如下：
fip：5＇-gccgcggtagtagctgctagt-ttgtagtgggacacggct-3′；
bip：5＇-cgtggtgtacgacgtgacgg-cgacgcacctatcaatctcg-3＇；
f3：5＇-ctgtagagcatgctgctgat-3＇；
b3：5′-cccgcagagaaacctatgg-3＇。
所述的环介导等温扩增引物组合物在检测丁香疫霉中的应用。
一种检测丁香疫霉的环介导等温扩增试剂盒，包含体积为一次用量以上的检测溶液，其中，1ml的检测溶液包括：48mmdntps、0.8mtris-hc、0.4mmkcl、0.4mm(nh4)2so4、0.24mmmgso4、4％tritonx-100、bstdnapolymerase320单位，200mm羟基萘酚蓝、32mm正向内引物fip、32mm反向内引物bip、8mm正向外引物f3、8mm反向外引物b3；其中，各引物序列具体如下：
fip：5＇-gccgcggtagtagctgctagt-ttgtagtgggacacggct-3＇；
bip：5＇-cgtggtgtacgacgtgacgg-cgacgcacctatcaatctcg-3＇：
f3：5′-ctgtagagcatgctgctgat-3＇；
b3：5′-cccgcagagaaacctatgg-3＇。
所述的检测丁香疫霉的环介导等温扩增试剂盒在检测丁香疫霉中的应用。
一种检测丁香疫霉的方法，提取待检微生物的dna，以提取的dna为模板，利用权利要求1所述的环介导等温扩增引物组合物或权利要求3所述的环介导等温扩增试剂盒进行环介导等温扩增；观察环介导等温扩增反应溶液颜色变化，天蓝色表示检测为阳性，存在丁香疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在丁香疫霉。
所述的检测丁香疫霉的方法：提取待检微生物的dna，取2μldna溶液，加入23μl环介导等温扩增试剂盒中的检测溶液进行环介导等温扩增，环介导等温扩增反应程序为：64℃，60min，扩增产物进行颜色变化的观察。
本发明的检测丁香疫霉的方法，包括提取待检微生物的dna，以提取的dna为模板，利用所述的环介导等温扩增引物组合物进行环介导等温扩增；羟基萘酚蓝(hydroxylnaphtholblue，hnb)属于金属离子指示剂的一种。hnb是mg2+的滴定剂，其颜色随溶液ph变化而改变，因此可以通过监测环介导等温扩增反应体系中mg2+浓度的变化及溶液ph而起到颜色指示剂的作用。反应前将hnb加入到反应液中，反应体系呈紫色，反应过程中mg2+与环介导等温扩增反应的副产物p2o74-结合产生大量沉淀，溶液中mg2+浓度降低，ph发生变化，从而使hnb的颜色由紫色变为天蓝色。因此，反应结束后通过反应体系的颜色变化，来判断丁香疫霉的有无：天蓝色表示检测为阳性，存在丁香疫霉；紫色表示检测结果为阴性，不存在丁香疫霉。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点和积极效果表现在：
1)准确性高：由于传统丁香疫霉检测技术只是根据形态特征来确定检测对象，无法排除人为因素的干扰，很难区分形态相近种，检测准确性只有60-80％；而本发明选取丁香疫霉特有的基因序列设计特异性的环介导等温扩增引物，环介导等温扩增反应通过4条引物(fip、bip、f3、b3)特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性和灵敏度都比较高。
2)操作方便：本发明提供的检测丁香疫霉的环介导等温扩增方法克服了现有技术中丁香疫霉的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及pcr检测技术需要热循环仪器，无法快速检测丁香疫霉的问题。本发明检测方法在64℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到丁香疫霉，不需要复杂仪器，能较好满足对丁香疫霉的现场检测。
3)实现了恒温扩增，不像pcr法必须要热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖，只要有稳定的热源环介导等温扩增反应就可以发生，极大的扩展了环介导等温扩增使用的范围，环介导等温扩增之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在环介导等温扩增反应液中添加了甜菜碱，使双链dna处于解链的动态平衡中，在bstdna聚合酶的作用下实现扩增。
4)实用性好。普通pcr反应对产物进行凝胶电泳很容易造成产物扩散，这是实验室污染的一个主要来源；而且溴化乙锭(eb)有巨毒，可累积致癌；长期观察紫外灯也会对实验人员造成一定程度的伤害。而环介导等温扩增反应只需在恒温水浴锅中进行，反应结束之后通过hnb的颜色变化便可直接判断结果，从而增加了其在带菌的植株和土壤中检测的应用价值。
5)本发明为丁香疫霉的检测提供了新的技术平台，可用于丁香疫霉的高灵敏度快速检测，同时在出入境样品中快速准备鉴定出病原物。本发明对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。
附图说明
图1是颜色判定环介导等温扩增检测丁香疫霉的特异性显色图；图中显示第1管以及第9管显天蓝色，呈阳性；其余管显紫色，呈阴性；其中，1，9：丁香疫霉(phytophthorasyringae)；2：大豆疫霉(p.sojae)；3：寄生疫霉(p.parasitica)；4：致病疫霉(p.infestans)；5：木香疫霉(p.tentaculata)；6：草莓疫霉(p.fragariae)；7：苎麻疫霉(p.boehmeriae)；10：终极腐霉(pythiumultimum)；11：木贼镰孢菌(fusariumequiseti)；12：平头炭疽菌(colletotrichumtruncatum)；13：大丽轮枝菌(verticiliumdahliae)；14：立枯丝核菌(rhizoctoniasolani)；15：稻瘟病菌(magnaporthegrisea)；8，16：阴性对照；
图2是基于hnb颜色变化检测环介导等温扩增灵敏度；图2为颜色判定环介导等温扩增检测丁香疫霉的灵敏度显色图；25μl的反应体系中分别含有10ng、1ng、100pg丁香疫霉dna的反应管显天蓝色，呈阳性反应，25μl的反应体系中分别含有10pg、1pg、100fg、10fg丁香疫霉dna的反应管显紫色，呈阴性反应。显色结果表明环介导等温扩增反应的灵敏度达到100pg。
图3是环介导等温扩增检测结果图；
图4是人工接种发病组织验证lamp结果。hnb显色反应表明人工接种的柚子提取的dna的反应管显天蓝色，呈阳性反应，而阴性对照菌反应管和健康柚子组织dna中的反应液没有出现梯形条带(2％琼脂糖凝胶电泳检测：1.发病组织样本；2.健康组织样本；3.阴性对照)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不受以下实施例的限制。
实施例1
一种用于检测丁香疫霉的环介导等温扩增检测试剂盒，由1.6μm正向内引物fip、1.6μm反向内引物bip、0.2μm正向外引物f3、0.2μm反向外引物b3、1.8mmdntps、20mmph8.8的tris-hcl、10mmkcl、10mm(nh4)2so4、6mmmgso4、0.1％tritonx-100、bstdnapolymerase16单位、5mm羟基萘酚蓝，加入超纯水制备成25ul检测溶液。各引物序列具体如下：
fip：5＇-gccgcggtagtagctgctagt-ttgtagtgggacacggct-3′；
bip：5＇-cgtggtgtacgacgtgacgg-cgacgcacctatcaatctcg-3′；
f3：5＇-ctgtagagcatgctgctgat-3′；
b3：5′-cccgcagagaaacctatgg-3＇。
其中，正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3可直接组成用于检测丁香疫霉的环介导等温扩增检测引物组合物。
实施例2丁香疫霉环介导等温扩增反应的特异性试验
为了验证丁香疫霉的特异性引物序列，本实施例以1株丁香疫霉菌株和14种其它卵菌以及17种病原真菌为供试材料(表1)，采用ctab法提取发病组织中丁香疫霉的dna，取1μldna溶液，加入23μl实施例1制备的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行环介导等温扩增反应，反应程序为：64℃60min。
提取各供试材料的dna的具体方法如下：取少量菌丝粉，加900μl2％ctab提取液和90μl10％sds，漩涡混匀，于55℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3mnaac(ph5.2)，-20℃沉淀(＞1h)。12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或te(ph8.0)溶解沉淀(含20μg/mlrnase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。
表1用于检测丁香疫霉特异性的真菌和卵菌菌株
环介导等温扩增检测结果如图1所示，显示1株丁香疫霉菌株可观察到天蓝色的阳性反应或者琼脂糖凝胶电泳出现环介导等温扩增阶梯状的条带，其余14种卵菌以及17种病原真菌显色结果为紫色的阴性反应或者琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。证明所设计的环介导等温扩增特异性引物具有种的特异性。这说明该引物组可被用于生产实践中发病组织及土壤中丁香疫霉的快速可靠的检测鉴定。
实施例3丁香疫霉环介导等温扩增反应的灵敏度试验
为了确定环介导等温扩增检测方法的灵敏度，将提取的丁香疫霉的dna用分光光度计测定浓度(1μg/μl)后用depc水进行10倍比稀释，-70℃保存作为模板。分别取10倍比稀释后的各浓度dna稀释液1μl作为模板，加入23μl实施例1制备的检测溶液和1μl灭菌去离子水进行环介导等温扩增反应，反应程序为：64℃60min。取2μl扩增产物上样，结果如图2所示，显示琼脂糖凝胶电泳和hnb显色反应表明环介导等温扩增反应的灵敏度达到100pg的丁香疫霉的dna。
实施例4丁香疫霉环介导等温扩增反应引物特异性验证和灵敏度验证
针对丁香疫霉的环介导等温扩增引物组，共设计了8组符合条件的引物，最终筛选出1组最为特异并灵敏度极高的引物即实施例1中所使用的引物组合物(包括正向内引物fip、反向内引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3)。采用设计的其余引物(随机从剩余8组引物中选1组)，引物序列如下：fip-1：5，-gccgcggtagtagctgctagt-ttgtagtgggacacggct-3′；bip-1：5＇-cgtggtgtacgacgtgacgg-cgacgcacctatcaatctcg-3＇：f3-1：5＇-ctgtagagcatgctgctgat-3′；b3-1：5′-cccgcagagaaacctatgg-3＇。以实施例2中所采用的菌株为供试材料(1株丁香疫霉菌株和14种其它卵菌以及17种病原真菌)，环介导等温扩增检测结果如图3所示，显示剩余所选引物的特异性不高，灵敏度也较差，说明实施例1用于本发明引物组合物具有较高的特异性和灵敏度。
实施例5从带菌土样中检测丁香疫霉
采用实施例1的丁香疫霉检测试剂盒或引物组合物进行土壤中丁香疫霉检测，过程如下：
1)土壤中卵孢子的富集：取待检土壤样品40～80克，研碎，先后采用200目筛网去处较大土粒，然后经过400、500、800目筛网过滤，同时用3～10升水反复冲洗，从800目筛网上收集卵孢子，用1ml水悬浮。由于卵孢子不能透过800目筛网，这样处理可以达到使卵孢子富集的效果。
2)从微量卵孢子中提取dna：将用无菌水悬浮的卵孢子转移到1.5ml的离心管中，在12000r.min-1转速下离心5分钟，倒出液体；加入50μlctabbuffer，研磨，再加入500μlctabbuffer，水浴30分钟；加入等体积氯仿抽提，在12000r.min-1转速下离心10分钟，吸取上清；加入1/10体积的3mnaac，2倍体积的无水冰乙醇，室温沉淀30分钟，12000r.min-1转速下离心10分钟，倒干液体；加1ml70％(v/v)乙醇洗涤，12000r.min-1转速下离心10分钟，倒干液体，晾干至无酒精味；加10μl无菌双蒸水溶解，用于环介导等温扩增的模板。
3)丁香疫霉环介导等温扩增检测，包括：丁香疫霉的环介导等温扩增检测：取1μldna溶液，加入23μl的检测溶液和1μl灭菌去离子水，总体积为25μl；反应程序为：64℃60min；以hnb(羟基萘酚蓝)作为反应指示剂，扩增结束后环介导等温扩增反应体系的颜色呈现天蓝色，以此判断从带菌土样中能够产生阳性反应含有丁香疫霉。
实施例6接种柚子样品组织中丁香疫霉的环介导等温扩增检测
当用于发病组织中存在丁香疫霉时，采用naoh快速裂解法提取丁香疫霉的dna，具体过程为：取一段发病的组织样品，每毫克组织加入10μl0.5mnaoh，在研钵中充分研磨后转移至1.5ml的ep管中，12000rpm离心5min，取5μl上清液加入495μl0.1mmtris(ph8.0)，混匀后取1μl直接用于pcr反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无pcr抑制物存在。
采用上述方法提取接种丁香疫霉的发病柚子的dna，将其作为模板用于环介导等温扩增。取1uldna溶液，按实施例4的方法，进行环介导等温扩增反应。结果如图4所示，显示接种丁香疫霉的发病植株中进行环介导等温扩增，其颜色反应也呈现阳性天蓝色(样品1)；而健康植株和阴性对照呈现紫色(样品2、3)。