一种快速区分PEDV和PReoV的二重RT-PCR检测引物及试剂盒的制作方法

本发明属于动物病毒学和分子生物学技术领域，具体为针对pedv和preov二重rt-pcr的检测引物、检测试剂盒及应用。

背景技术

猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，ped)是由猪流行性腹泻病毒(pedv)引起的急性、高度接触性肠道疾病，主要以急性水样腹泻、呕吐和迅速脱水死亡为基本特征。各种年龄段的猪都能够感染发病，尤其以1-2周龄内哺乳仔猪为主要发病群体，感染发病率和死亡率甚至可高达100％。英国和比利时在20世纪70年代，各自率先报道了该病的发生，随后该病在全球多个主要养猪国家相继暴发和流行。2013年4月，美国出现ped疫情并很快蔓延至整个国家，截止2014年底，至少造成800万头新生仔猪死亡，经济损失高达18亿美元。随后不久，加拿大、墨西哥、多米尼克等与美国相邻的北美国家和欧洲的德国等地也暴发了ped疫情。中国自2010年十月份也暴发了ped疫情，造成超过百万头哺乳仔猪的死亡，损失极其惨重。

20世纪50年代呼肠孤病毒的首次发现，证实了dsrna病毒可以作为稳定的生命形式存在于自然界中。呼肠孤病毒(reovirus)系呼肠孤病毒科(reoviridea)正呼肠孤病毒属(orthoreovirus)成员主要感染人和哺乳动物，如猪、牛、犬、猫、鼠等以及禽的呼吸道或消化道，对动物具有广泛的致病性。

猪呼肠孤病毒(porcinereovirus，preov)属呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属成员，是哺乳动物呼肠孤病毒(mammalianreovirus，mrv)的一种，为分节段的双链rna病毒，无囊膜，具有特征性的20面体对称双层衣壳结构，完整的病毒粒子直径为76nm左右，病毒经口感染或经呼吸道感染。目前报道的preov共有3个血清型，其中1型由kasza和mcferran于1970年分别分离报道；3型由robl于1971年分离报道；2型由fukutomi于1996年在日本首次分离报道；所有的猪几乎都可检测到3种血清型的抗体。我国曾志勇2006年在国内首次从猪体内分离到了3型哺mrv，sc-a株；随后，zhang等2007年也分离到了一株3型mrv，mrv-hlj/2007株；kwon等2011年从南韩地区78个猪场237份腹泻样品中检出了45份3型mrv阳性(检出率达19％)，并且从阳性病料中分离到了10株3型mrv；narayanappa等2015年用美国分离到的preov感染新生仔猪，发现仔猪出现严重腹泻，并且死亡率高达100％。从患有呼吸道疾病或胃肠道疾病的猪、临床健康的猪、流产胎儿等都可分离到呼肠孤病毒。另外，健康猪群体内也会存在猪呼肠孤病毒。利用preov感染未吃初乳初生仔猪会引起猪的体温升高以及腹泻等症状。上述报道说明，preov在猪群中流行广泛，且对猪具有一定程度的致病作用。

2010年以来，顽固性仔猪腹泻的发生与流行呈持续上升趋势，已成为猪场损失最为重要的原因之一，其中尤其以病毒性腹泻的危害最为严重。而pedv和preov都是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原。临床上仅出现猪腹泻症状，而无其它表现时，难以区分是由pedv还是preov引起猪的腹泻，或者是由pedv和preov混合感染引起猪的腹泻，因此有必要建立pedv和preov二重rt-pcr检测方法，为临床上及时准确地对猪腹泻病因进行调查和监测提供技术支持，从而有效地防控猪腹泻病的发生与流行。

技术实现要素：

本发明的目的是解决上述技术问题，提供一种快速区分pedv和preov的二重rt-pcr检测引物及试剂盒，该试剂盒能够快速区分pedv和preov，灵敏感高、特异性强，从而为有效防控pedv和preov病毒病的发生和流行提供技术支持。为实现本发明目的所使用的技术方案为：

一种快速区分pedv和preov的二重rt-pcr检测引物，所述二重rt-pcr检测引物包括pedvrt-pcr检测引物和preovrt-pcr检测引物；所述pedvrt-pcr检测引物由具有seqidno:1所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno:2所示核苷酸序列的下游引物组成；所述preovrt-pcr检测引物由具有seqidno:3所示核苷酸序列的上游引物和具有seqidno:4所示核苷酸序列的下游引物组成。

优选的，所述pedvrt-pcr检测引物是依据pedv的n基因进行设计，扩增的目的片段大小为458bp；所述preovrt-pcr检测引物是preov的s2基因进行设计，扩增的目的片段大小为974bp。

优选的，所述二重rt-pcr检测引物在制备猪流行性腹泻病毒和猪呼肠孤病毒鉴别检测试剂盒的应用。

本发明还提供一种快速区分pedv和preov的二重rt-pcr检测试剂盒，所述二重rt-pcr检测试剂盒包括具有seqidno:1、seqidno:3所示核苷酸序列的上游引物以及具有seqidno:2、seqidno:4所示核苷酸序列的下游引物。

优选的，所述二重rt-pcr检测试剂盒还包括primestarhr缓冲液、cdna模板和灭菌水。

优选的，所述的二重rt-pcr检测试剂盒中，包括rt反应体系和pcr反应体系；所述rt反应体系为：采用20μl体系，rna模板14μl，5×primescripttm缓冲液4μl，rtenzymemix1.0μl，反转录引物oligo18t1.0μl；所述pcr反应体系为：采用25μl体系，灭菌水7.5μl，primestarhr(premix)12.5μl，25μmol/lpedv和preov上下游引物各0.5μl，模板3.0μl。

优选的，所述所述二重rt-pcr检测试剂盒的最佳退火温度为58℃。

优选的，所述的二重rt-pcr检测试剂盒中rt反应条件为：37℃20min，85℃30s；pcr反应条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃复性5s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min。

优选的，所述rt-pcr检测试剂盒的seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3和seqidno:4所示引物使用浓度为25μmol/l。

本发明的有益效果为：

本发明提供的pedv和preov的二重rt-pcr检测试剂盒采用二重rt-pcr扩增，两种病变相似且同为rna病毒的病毒一次检测，检测总时间控制在2小时左右，其检测方法易于操作、方便快捷，能达到快速检测的目的。本发明能彻底解决pedv和preov引起的类似症状但病原不同的诊断问题，适合猪场快速检测，亦适用于流行病学调查。

本发明提供了两对针对pedv和preov的特异性引物，pedv-p1/pedv-p2为pedv特异性扩增引物组，preov-p1/preov-p2为preov特异性扩增引物组，利用其制成的二重rt-pcr检测试剂盒能快速、特异的检测出pedv和preov中的单一病毒以及二者的混合病毒，pedv-出现458bp一个条带，preov出现974bp一个条带，pedv、preov两种病毒混合样品出现458bp、974bp两个条带。

本发明的pedv和preov的二重rt-pcr检测试剂盒对pedv的检测极限为10^0.92tcid50/ml，对preov的检测极限为10^3.10tcid50/ml，表明本发明的pedv和preov的二重rt-pcr检测试剂盒在检测pedv和preov时具有较高的灵敏度。本发明的pedv和preovrt-pcr鉴别检测试剂盒既能缩短诊断时间、节约诊断试剂，又能降低使用成本。

本发明提供的pedv和preovrt-pcr鉴别检测试剂盒在6个月内检测结果一致，表明本发明pedv和preovrt-pcr鉴别检测试剂盒具有很高的稳定性。田间试验证明本发明所得的pedv和preovrt-pcr鉴别检测试剂盒实用性和适用性良好。

附图说明

图1是目的基因的rt-pcr扩增结果，其中m：dna分子质量标准dl2000；1：pedv阳性组织样本；2：preov阳性组织样本；3：pedv/preov双阳性组织样本；4：阴性对照。

图2是本发明二重rt-pcr检测试剂盒不同退火温度结果，其中m：dna分子质量标准dl2000；1：50.0℃；2：50.7℃；3：51.5℃；4：52.6℃；5：53.8℃；6：54.6；7：55.6℃；8：56.8℃；9：58.0℃；10：60.0℃。

图3是本发明二重rt-pcr检测试剂盒特异性试验结果，其中m：dna分子质量标准dl2000；1：pedv/preov双阳性组织样本；2：csfv；3：prrsv；4：tgev；5：pdcov；6：jev；7：ppv；8：prv；9：pcv2；10：ttv；11：阴性对照。

图4是本发明二重rt-pcr检测试剂盒敏感性试验结果，其中m：dna分子质量标准dl2000；1-7：pedv的tcid50分别为10^5.92tcid50/ml、10^4.92tcid50/ml、10^3.92tcid50/ml、10^2.92tcid50/ml、10^1.92tcid50/ml、10^0.92tcid50/ml、10^-0.08tcid50/ml；1-7：preov的tcid50分别为10^7.10tcid50/ml、10^6.10tcid50/ml、10^5.10tcid50/ml、10^4.10tcid50/ml、10^3.10tcid50/ml、10^2.10tcid50/ml、10^1.10tcid50/ml；8：阴性对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例

1材料与方法

1.1病毒及临床样品

猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪呼肠孤病毒(preov)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪丁型冠状病毒(pdcov)、猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪乙型脑炎病毒(jev)、猪细小病毒(ppv)、猪伪狂犬病病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)及猪细环病毒(ttv)均由本实验室保存提供。临床样品采自广西各地养猪场猪腹泻粪便及拉稀仔猪肠道样品，剪取组织样品约0.5g-1.0g，置于灭菌研钵中，充分研磨成匀浆，加入灭菌的1mol/lpbs溶液配成1：5乳悬液，反复冻融3次。10000r/min离心5min，收集上清液，转入1.5ml离心管中编号供rna抽提或者-20℃保存备用。

1.2主要试剂

反转录试剂盒(primescriptrtreagentkit)、primestarhr(premix)、dl2000dnamarker均为大连宝生物工程有限公司产品；病毒基因组rna/dna快速抽提试剂盒为axygen生物科技有限公司产品。

1.3引物的设计与合成

根据genbank上登录的pedvn基因和preovs2基因序列，利用megalign(dnastar)，primerpremier7.0软件针对pedvn基因和preovs2基因的保守区域分别设计一对特异性引物pedv-p1/pedv-p2和preov-p1/preov-p2。pedv上游引物pedv-p1：5’-ctcagaacagaggaggcaataa-3’，pedv下游引物pedv-p2：5’-agccacattaccaccaaaga-3’，pcr扩增目的片段大小为458bp。preov上游引物preov-p1：5’-tcgcgctgcgttcctattcaagac-3’，preov下游引物preov-p2：5’-gctggttaccagctctrccrgtcc-3’，pcr扩增目的片段大小为974bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.4病毒rna/dna的提取

猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪呼肠孤病毒(preov)、猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪丁型冠状病毒(pdcov)、猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪乙型脑炎病毒(jev)、猪细小病毒(ppv)、猪伪狂犬病病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)及猪细环病毒(ttv)及处理好的组织病料，按照axyprepbodyfluidviralrna/dnaminiprepkit使用说明书进行rna/dna提取，所获得的rna/dna用于下一步的rt-pcr或pcr反应或置于-20℃保存。

1.5反转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)

反转录合成cdna：按照rt(反转录)试剂盒说明，采用20μl体系：rna模板14μl，5×primescripttm缓冲液4μl，rtenzymemix1.0μl，反转录引物oligo18t1.0μl，按以下程序进行反转录反应：37℃20min，85℃30s，12℃保存。

pcr反应体系25μl，灭菌水7.5μl，primestarhr(premix)12.5μl，25μmol/lpedv和preov上下游引物各0.5μl，模板3.0μl。按照下列条件进行扩增：98℃预变性3min；98℃变性10s，58℃复性5s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸10min，pcr总反应时间约为77分钟。取扩增产物10μl于10g/l琼脂糖凝胶中电泳，并观察结果。

1.6二重rt-pcr检测方法特异性试验

以制备好的猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪丁型冠状病毒(pdcov)、猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪乙型脑炎病毒(jev)、猪细小病毒(ppv)、猪伪狂犬病病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)及猪细环病毒(ttv)cdna、dna以及pedv、preov和pedv/preov混合阳性材料cdna为模板，用所建立的方法进行扩增，以验证该方法的特异性。

1.7二重rt-pcr检测方法敏感性试验

1.7.1pedv、preov阳性模板的制备

将pedv(10^7.22tcid50/ml)病毒液和preov(10^8.44tcid50/ml)病毒液1：1混合，然后10倍系列稀释至10^-7(即度pedv稀释到10^-0.08tcid50/ml；preov稀释到10^1.10tcid50/ml；)，各稀释后的不同浓度的病毒液按照axyprepbodyfluidviralrna/dnaminiprepkit使用说明书进行rna提取，所获得的rna用于下一步的rt-pcr。

1.7.2二重rt-pcr检测方法敏感性试验

将上述所得的rna作为rt-pcr反应模板，用所建立的二重rt-pcr检测方法进行反应，测定所建立的二重rt-pcr检测方法的敏感性。

1.8二重rt-pcr检测方法重复性试验

以建立的二重rt-pcr检测方法，对pedv、preov双阳性样品重复检测3次，以验证结果的可靠性。

2结果

2.1二重rt-pcr扩增

以pedv阳性rna、preov阳性rna、pedv/preov双阳性混合rna为模板，按照1.5中的反应体系和反应程序进行二重rt-pcr反应。电泳结果显示(见图1)，所建立的二重rt-pcr方法能够检测出pedv阳性、preov阳性及pedv/preov双阳性材料，扩增出pedv目的基因约458bp，扩增出preov目的基因约974bp，均与预期目的片段大小相符。将扩增出的pedv和preovpcr产物送上海生物工程有限公司进行测序，将测序结果放在ncbi上进行blast确定为pedv和preov特异性片段。

2.2二重rt-pcr检测方法最佳退火温度

为获得该反应最佳扩增效果，在50-60℃的温度范围内设10个温度梯度进行二重rt-pcr扩增，发现58℃时两个条带均最明显，确定了最佳退火温度为58℃(见图2)。

2.3二重rt-pcr检测方法特异性试验结果

试验结果显示(见图3)，本研究建立的二重rt-pcr鉴别检测方法能特异地检测出pedv、preov，而对猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪丁型冠状病毒(pdcov)、猪瘟病毒(csfv)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(prrsv)、猪乙型脑炎病毒(jev)、猪细小病毒(ppv)、猪伪狂犬病病毒(prv)、猪圆环病毒2型(pcv2)及猪细环病毒(ttv)的检测结果均无条带，表明所建立的方法具有较好的特异性。

2.4二重rt-pcr检测方法敏感性试验

结果显示，该二重rt-pcr检测方法对pedv、preov的检测极限分别为10^0.92tcid50/ml、10^3.10tcid50/ml(见图4)。

2.5二重rt-pcr检测方法重复性试验结果

以建立的二重rt-pcr检测方法，对pedv、preov双阳性样品重复检测3次，结果在458bp和974bp处，均得到了清晰可见的目的条带，说明建立的二重rt-pcr检测方法具有很好的稳定性。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110>广西壮族自治区兽医研究所

<120>一种快速区分pedv和preov的二重rt-pcr检测引物及试剂盒

<141>2018-07-10

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequencelatin)

<400>1

ctcagaacagaggaggcaataa22

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequencelatin)

<400>2

agccacattaccaccaaaga20

<210>3

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequencelatin)

<400>3

tcgcgctgcgttcctattcaagac24

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequencelatin)

<400>4

gctggttaccagctctrccrgtcc24