本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一种复合活菌制剂和其制备方法及其应用。
背景技术：
fuller(1989年)将动物微生态制剂定义为：一种可通过改善肠道菌群平衡而对动物施加有利影响的活的微生物。动物微生态制剂是新型的生物制品，根据动物微生物学的基本原理可用于调节动物机体微生态平衡，其通过增强机体对肠道内有害微生物的抑制以及增强非特异性免疫功能来预防和治疗疾病、促进动物生长。抗生素相关性腹泻(antibiotic-associateddiarrhea，aad)是一种使用抗生素引起的常见综合征，由于肠道外感染时长期、大量应用广谱抗生素或两种以上抗生素联合应用引起的肠道菌群失调，肠道内正常菌群减少，肠道有害菌和过路菌等大量繁殖，引起的药物较难控制的肠炎。目前宠物医院对以犬为代表的宠物在治疗疾病时存在滥用抗菌药物的情况，而长期或大量应用抗生素易扰乱肠道菌群，使微生态环境被破坏，肠道菌群多样性下降；同时肠道菌群会随着药物使用期的延长而出现普遍的耐药性增强，导致抗生素相关性腹泻的可能。犬对于一般急性腹泻有较强的自愈能力，但对于抗生素相关性的慢性腹泻自愈能力较弱，病程长，短期内难以有较明显的恢复，进而直接影响犬只健康。
2013年，美国胃肠病联合会指南指出：益生菌能够有效降低aad发生率。johnston、aloysius等人研究也表明，微生态制剂可防止aad的发生，对存在抗生素相关性腹泻患者可给予益生菌治疗。补充益生菌可提高抗生素相关性腹泻患者的治愈率，可降低抗生素相关性腹泻发生率，显著缩短抗生素相关性腹泻患者病程。微生态制剂已广泛应用于治疗抗生素相关性腹泻，如整肠生、培菲康、妈咪爱等微生态制剂广泛应用于长期服用广谱抗生素引起的肠道菌群失调的防治，在临床上疗效显著，安全可靠，具有较高的临床应用价值。
但目前国内市场上犬用微生态制剂产品参差不齐，且尚无犬用微生态制剂药品，而双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌复合活菌制剂是专门针对由抗生素引起的犬肠道菌群失衡导致的腹泻疾病研发的一种四联菌复合活菌制剂，其具有改善动物肠道微生态环境，提高动物机体免疫力，增加肠道有益菌群的功效。在临床前研究中，实验室制品的效力试验研究结果表明，该制品对由抗生素引起犬肠道菌群失调所致的腹泻症状有显著的治疗效果。微生态制剂作为安全、无残留、无污染的绿色环保药物，是为了克服抗生素的负面影响而产生的，甚至在治疗某些疾病上替代抗生素，与国家提倡的“减抗”主题相一致，促进养殖业的绿色可持续发展。
技术实现要素：
为解决该问题，本发明提供一种复合活菌制剂和其制备方法及其应用。
本发明的第一个目的在于提供一种复合活菌制剂，为双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌复合活菌制剂。
优选的，所述复合活菌制剂包括动物双歧杆菌b1014菌株、副干酪乳酸杆菌l1056菌株、屎肠球菌ef1012菌株、酿酒酵母菌s1072菌株以及辅料。
优选的，所述辅料为低聚木糖和葡萄糖。
优选的，所述复合活菌制剂中复配后的双歧杆菌、乳酸杆菌应分别不低于2.0×109cfu/g，复配后的屎肠球菌和酿酒酵母菌应分别不低于2.0×108cfu/g。
本发明的第二个目的在于提供一种复合活菌制剂的制备方法，是将动物双歧杆菌b1014菌株、副干酪乳酸杆菌l1056菌株、屎肠球菌ef1012菌株和酿酒酵母菌s1072菌株分别接种至适宜的培养基中进行发酵，发酵液经高速离心得到菌泥，再加入适宜的保护剂后，分别经真空冷冻干燥制成双歧杆菌冻干粉、乳酸杆菌冻干粉、屎肠球菌冻干粉和酿酒酵母菌冻干粉，最后加辅料混合制成四联菌复合活菌制剂。
本发明的第三个目的在于提供一种复合活菌制剂制备方法中双歧杆菌冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
1)各级培养基的配置，其中，
斜面培养基：为ptyg固体培养基，ph值调至7.4，灭菌后备用；
摇瓶培养基质量百分比为：葡萄糖2.0％，酵母浸出粉0.2％，蛋白胨1.5％，l-半胱氨酸盐酸盐0.05％，氯化钠0.5％，大豆蛋白胨0.5％，碳酸钠0.2％，磷酸二氢钾0.6％，西红柿汁10％，微量盐4％，ph值调至7.4，灭菌后备用；
种子罐和发酵罐培养基质量百分比为：葡萄糖2.0％，酵母浸出粉0.2％，蛋白胨1.5％，l-半胱氨酸盐酸盐0.05％，氯化钠0.5％，碳酸钠0.2％，磷酸二氢钾0.6％，灭菌后备用；
发酵罐补料培养基质量百分比为：葡萄糖12％，酵母浸出粉1.2％，蛋白胨9.0％，l-半胱氨酸盐酸盐0.1％，氯化钠1.0％，碳酸钠0.4％，磷酸二氢钾1.2％，灭菌后备用；
微量盐配方：0.2g/lcacl2，0.48g/lmgso4，10g/lnahco3，1.0g/lkh2po4，1.0g/lk2hpo4，2.0g/lnacl；
2)摇瓶菌种扩增：分别向每支斜面试管中依次加入5ml的无菌水，各斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基中，在37℃，静置培养14-16h，备用；
3)种子罐发酵：将步骤1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤2)的摇瓶菌液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速50r/min，发酵过程中罐压0.05mpa，厌氧培养6-8h，备用；
4)发酵罐发酵：将步骤1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤3)发酵液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速50r/min，厌氧培养，罐压0.05mpa。当糖含量低于1.0％时开始补料。采用流加方式进行补料，补料参数控制：糖含量控制范围为0.6-1.0％；蠕动泵转速为120-150r/min；补料周期为100s，开度50-60s。补料结束后，其糖含量不再降低、od600值不再增长、镜检无杂菌时，发酵结束，关闭补碱系统后，开始离心，在菌泥中加入3倍质量的保护剂，混匀后，冻干、粉碎、装袋，置于4℃条件下，暂存备用。所获得的双歧杆菌冻干粉的活菌数不低于1.0×1010cfu/g。
本发明的第四个目的在于提供一种复合活菌制剂制备方法中乳酸杆菌冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
1)各级培养基的配置，其中：
斜面培养基：为ptyg固体培养基，ph值调至7.0，灭菌后备用；
摇瓶培养基质量百分比为：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，安琪蛋白胨1.0％，l-半胱氨酸盐酸盐0.05％，微量盐4％，ph值调至7.0，灭菌后备用；
种子罐和发酵罐培养基质量百分比为：葡萄糖2.0％，酵母浸出粉2.0％，安琪蛋白胨2.0％，l-半胱氨酸盐酸盐0.05％，微量盐4％，灭菌后备用；
发酵罐补料培养基质量百分比为：葡萄糖12％，酵母浸出粉12％，安琪蛋白胨12％，l-半胱氨酸盐酸盐0.1％，微量盐8％，灭菌后备用；
微量盐配方：0.2g/lcacl2，0.48g/lmgso4，10g/lnahco3，1.0g/lkh2po4，1.0g/lk2hpo4，2.0g/lnacl；
2)摇瓶菌种扩增：分别向每支斜面试管中依次加入5ml的无菌水，各斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基中，在37℃，静置培养14-16h，备用；
3)种子罐发酵：将步骤1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤2)的摇瓶菌液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速50r/min，发酵过程中罐压0.05mpa，厌氧培养6-8h，备用；
4)发酵罐发酵：将步骤1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤3)发酵液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速50r/min，厌氧培养，罐压0.05mpa。当糖含量低于1.0％时开始补料。采用流加方式进行补料，补料参数控制：糖含量控制范围为0.6-1.0％；蠕动泵转速为120-150r/min；补料周期为100s，开度50-60s。补料结束后，其糖含量不再降低、od600值不再增长、镜检无杂菌时，发酵结束，关闭补碱系统后，开始离心，在菌泥中加入3倍质量的保护剂，混匀后，冻干、粉碎、装袋，置于4℃条件下，暂存备用。所获得的乳酸杆菌冻干粉的活菌数不低于1.0×1010cfu/g。
本发明的第五个目的在于提供一种复合活菌制剂制备方法中屎肠球菌冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
1)各级培养基的配置，其中：
斜面培养基：为ptyg固体培养基，ph值调至7.0，灭菌后备用；
摇瓶和种子罐培养基质量百分比为：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，胰蛋白胨0.5％，示蛋白胨0.5％，微量盐4％，灭菌后备用；
发酵罐培养基质量百分比为：葡萄糖1.5％，酵母浸出粉1.5％，安琪蛋白胨2％，微量盐4％，灭菌后备用；
发酵罐补料培养基质量百分比为：安琪蛋白胨12％，酵母浸出粉9％，葡萄糖9％，微量盐8％，灭菌后备用；
微量盐配方：0.2g/lcacl2，0.48g/lmgso4，10g/lnahco3，1.0g/lkh2po4，1.0g/lk2hpo4，2.0g/lnacl；
2)摇瓶菌种扩增：分别向每支斜面试管中依次加入5ml的无菌水，各斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基中，在37℃，150rpm摇床培养12～14h，备用；
3)种子罐发酵：将步骤1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐中高温灭菌并冷却后，按4％的接种量接入步骤2)的摇瓶菌液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速150r/min，发酵过程中溶氧量控制在10％以上，根据溶氧加大罐压，罐压最高不超过0.1mpa，培养4-6h，备用；
4)发酵罐发酵：将步骤1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤3)发酵液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速150r/min，发酵过程中溶氧量控制在10％以上，根据溶氧加大罐压，罐压最高不超过0.1mpa。当糖含量低于1.0％时开始补料。采用流加方式进行补料，补料参数控制：糖含量控制范围为0.6-1.0％；蠕动泵转速为120-150rpm；补料周期为100s，开度50-60s。补料结束后，其糖含量不再降低、od600值不再增长、镜检无杂菌时，发酵结束，关闭补碱系统后，开始离心，在菌泥中加入3倍质量的保护剂，混匀后，冻干、粉碎、装袋，备用。所获得的屎肠球菌冻干粉的活菌数不低于1.0×1010cfu/g；
本发明的第六个目的在于提供一种复合活菌制剂制备方法中酿酒酵母菌冻干粉的制备方法，包括以下步骤：
1)各级培养基的配置，其中：
斜面培养基：为ptyg固体培养基，ph值调至6.5，灭菌后备用；
摇瓶培养基质量百分比为：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，胰蛋白胨0.5％，示蛋白胨0.5％，微量盐4％，ph值调至6.5，灭菌后备用；
种子罐和发酵罐培养基质量百分比为：葡萄糖2.0％，酵母浸出粉1.5％，安琪蛋白胨1.5％，微量盐4％，灭菌后备用；
发酵罐补料培养基质量百分比为：酵母浸出粉9％，安琪蛋白胨9％，葡萄糖12％，微量盐8％，灭菌后备用；
微量盐配方：0.2g/lcacl2，0.48g/lmgso4，10g/lnahco3，1.0g/lkh2po4，1.0g/lk2hpo4，2.0g/lnacl；
2)摇瓶菌种扩增：分别向每支斜面试管中依次加入5ml的无菌水，各斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基中，在32℃，200rpm摇床培养12～14h，备用；
3)种子罐发酵：将步骤1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐中高温灭菌并冷却后，按4％的接种量接入步骤2)的摇瓶菌液，发酵温度为32℃，ph值控制为6.5，搅拌转速200r/min，发酵过程中发酵罐的通气量最高不超过1.80m3/h，根据溶氧加大罐压，罐压最高不超过0.1mpa，培养6-8h，备用；
4)发酵罐发酵：将步骤1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤3)发酵液，发酵温度为32℃，ph值控制为6.5，搅拌转速200r/min，通气量最高不超过30.0m3/h，根据溶氧加大罐压，罐压最高不超过0.1mpa。当糖含量低于1.0％时开始补料。采用流加方式进行补料，补料参数控制：糖含量控制范围为0.6-1.0％；蠕动泵转速为120-150r/min；补料周期为100s，开度50-60s。补料结束后，其糖含量不再降低、od600值不再增长、镜检无杂菌时，发酵结束，关闭补碱系统后，开始离心，在菌泥中加入3倍质量的保护剂，混匀后，冻干、粉碎、装袋，备用。所获得的酿酒酵母菌冻干粉的活菌数不低于1.0×1010cfu/g。
本发明的第七个目的在于提供一种复合活菌制剂在对抗生素引起的犬肠道菌群失衡导致的腹泻治疗、增强犬机体免疫力、改善肠道微环境和增强肠道有益菌群等方面的应用。
本发明相比现有技术而言，具备的有益效果如下：
(1)本发明筛选出的动物双歧杆菌、副干酪乳酸杆菌、屎肠球菌，均为健康犬肠道内的原籍菌，具有促进犬生长，增强机体免疫力、调节肠道菌群平衡等益生作用；同时从水果皮中筛选酿酒酵母，可促进乳杆菌的生长，与乳杆菌协同作用维护肠道菌群平衡，增强机体免疫功能，抵抗致病菌的感染；(2)本发明的四种菌株分别通过菌种发酵，离心收获培养物，添加适宜保护剂后，经真空冷冻干燥制成冻干粉，加辅料(葡萄糖和低聚木糖)按照一定的比例混合制成的四联菌复合活菌制剂，便于保存；(3)本发明是专用于治疗由抗生素引起的犬肠道菌群失衡导致的腹泻效果显著；(4)该四联菌复合活菌制剂以治疗犬抗生素相关性腹泻为首要目标，针对性强，治疗显著；(5)具有益生作用、促进动物生长，提高机体免疫力。
具体实施方式：
下面结合具体实例对本发明做出进一步地详细阐述，所述实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。对本领域普通技术人员来说，在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
实施例1：
双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌的冻干粉制备
实施例1.1：双歧杆菌冻干粉制备步骤：
(1)各级培养基的配置，其中：
斜面培养基：为ptyg固体培养基，其质量百分比为：胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉1.0％，葡萄糖1.0％，吐温-800.1％，l-半胱氨酸盐酸盐0.05％，ph值调至7.4，灭菌后备用；
摇瓶培养基质量百分比为：葡萄糖2.0％，酵母浸出粉0.2％，蛋白胨1.5％，l-半胱氨酸盐酸盐0.05％，氯化钠0.5％，大豆蛋白胨0.5％，碳酸钠0.2％，磷酸二氢钾0.6％，西红柿汁10％，微量盐4％，ph值调至7.4，灭菌后备用；
种子罐和发酵罐培养基质量百分比为：葡萄糖2.0％，酵母浸出粉0.2％，蛋白胨1.5％，l-半胱氨酸盐酸盐0.05％，氯化钠0.5％，碳酸钠0.2％，磷酸二氢钾0.6％，灭菌后备用；
发酵罐补料培养基质量百分比为：葡萄糖12％，酵母浸出粉1.2％，蛋白胨9.0％，l-半胱氨酸盐酸盐0.1％，氯化钠1.0％，碳酸钠0.4％，磷酸二氢钾1.2％，灭菌后备用；
微量盐配方：0.2g/lcacl2，0.48g/lmgso4，10g/lnahco3，1.0g/lkh2po4，1.0g/lk2hpo4，2.0g/lnacl；
(2)摇瓶菌种扩增：分别向每支斜面试管中依次加入5ml的无菌水，各斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基中，在37℃，静置培养15h，备用；
(3)种子罐发酵：将步骤1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤2)的摇瓶菌液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速50r/min，发酵过程中罐压0.05mpa，厌氧培养6h，备用；
(4)发酵罐发酵：将步骤1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤3)发酵液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速50r/min，厌氧培养，罐压0.05mpa。当糖含量低于1.0％时开始补料。采用流加方式进行补料，补料参数控制：糖含量控制范围为0.6％；蠕动泵转速为120r/min；补料周期为100s，开度50s。补料结束后，其糖含量不再降低、od600值不再增长、镜检无杂菌时，发酵结束，关闭补碱系统后，开始离心，在菌泥中加入3倍质量的保护剂，混匀后，冻干、粉碎、装袋，置于4℃条件下，暂存备用。所获得的双歧杆菌冻干粉的活菌数不低于1.0×1010cfu/g；
实施例1.2：乳酸杆菌冻干粉制备步骤：
(1)各级培养基的配置，其中：
斜面培养基：为ptyg固体培养基，其质量百分比为：胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉1.0％，葡萄糖1.0％，吐温-800.1％，l-半胱氨酸盐酸盐0.05％，ph值调至7.0，灭菌后备用；
摇瓶培养基质量百分比为：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，安琪蛋白胨1.0％，l-半胱氨酸盐酸盐0.05％，微量盐4％，ph值调至7.0，灭菌后备用；
种子罐和发酵罐培养基质量百分比为：葡萄糖2.0％，酵母浸出粉2.0％，安琪蛋白胨2.0％，l-半胱氨酸盐酸盐0.05％，微量盐4％，灭菌后备用；
发酵罐补料培养基质量百分比为：葡萄糖12％，酵母浸出粉12％，安琪蛋白胨12％，l-半胱氨酸盐酸盐0.1％，微量盐8％，灭菌后备用；
微量盐配方：0.2g/lcacl2，0.48g/lmgso4，10g/lnahco3，1.0g/lkh2po4，1.0g/lk2hpo4，2.0g/lnacl；
(2)摇瓶菌种扩增：分别向每支斜面试管中依次加入5ml的无菌水，各斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基中，在37℃，静置培养15h，备用；
(3)种子罐发酵：将步骤1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤2)的摇瓶菌液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速50r/min，发酵过程中罐压0.05mpa，厌氧培养6-8h，备用；
(4)发酵罐发酵：将步骤1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤3)发酵液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速50r/min，厌氧培养，罐压0.05mpa。当糖含量低于1.0％时开始补料。采用流加方式进行补料，补料参数控制：糖含量控制范围为0.8％；蠕动泵转速为130r/min；补料周期为100s，开度55s。补料结束后，其糖含量不再降低、od600值不再增长、镜检无杂菌时，发酵结束，关闭补碱系统后，开始离心，在菌泥中加入3倍质量的保护剂，混匀后，冻干、粉碎、装袋，置于4℃条件下，暂存备用。所获得的乳酸杆菌冻干粉的活菌数不低于1.0×1010cfu/g；
实施例1.3：屎肠球菌冻干粉制备步骤：
(1)各级培养基的配置，其中：
斜面培养基：为ptyg固体培养基，胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉1.0％，葡萄糖1.0％，吐温-800.1％，ph值调至7.0，灭菌后备用；
摇瓶和种子罐培养基质量百分比为：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，胰蛋白胨0.5％，示蛋白胨0.5％，微量盐4％，灭菌后备用；
发酵罐培养基质量百分比为：葡萄糖1.5％，酵母浸出粉1.5％，安琪蛋白胨2％，微量盐4％，灭菌后备用；
发酵罐补料培养基质量百分比为：安琪蛋白胨12％，酵母浸出粉9％，葡萄糖9％，微量盐8％，灭菌后备用；
微量盐配方：0.2g/lcacl2，0.48g/lmgso4，10g/lnahco3，1.0g/lkh2po4，1.0g/lk2hpo4，2.0g/lnacl；
(2)摇瓶菌种扩增：分别向每支斜面试管中依次加入5ml的无菌水，各斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基中，在37℃，150rpm摇床培养13h，备用；
(3)种子罐发酵：将步骤1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐中高温灭菌并冷却后，按4％的接种量接入步骤2)的摇瓶菌液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速150r/min，发酵过程中溶氧量控制在10％以上，根据溶氧加大罐压，罐压最高不超过0.1mpa，培养5h，备用；
(4)发酵罐发酵：将步骤1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤3)发酵液，发酵温度为37℃，ph值控制为7.0，搅拌转速150r/min，发酵过程中溶氧量控制在10％以上，根据溶氧加大罐压，罐压最高不超过0.1mpa。当糖含量低于1.0％时开始补料。采用流加方式进行补料，补料参数控制：糖含量控制范围为0.8％；蠕动泵转速为140rpm；补料周期为100s，开度55s。补料结束后，其糖含量不再降低、od600值不再增长、镜检无杂菌时，发酵结束，关闭补碱系统后，开始离心，在菌泥中加入3倍质量的保护剂，混匀后，冻干、粉碎、装袋，备用。所获得的屎肠球菌冻干粉的活菌数不低于1.0×1010cfu/g；
实施例1.4：酿酒酵母菌冻干粉制备步骤：
(1)各级培养基的配置，其中：
斜面培养基：为ptyg固体培养基，胰蛋白胨0.5％，大豆蛋白胨0.5％，酵母浸出粉1.0％，葡萄糖1.0％，吐温-800.1％，ph值调至6.5，灭菌后备用；
摇瓶培养基质量百分比为：葡萄糖1.0％，酵母浸出粉1.0％，胰蛋白胨0.5％，示蛋白胨0.5％，微量盐4％，ph值调至6.5，灭菌后备用；
种子罐和发酵罐培养基质量百分比为：葡萄糖2.0％，酵母浸出粉1.5％，安琪蛋白胨1.5％，微量盐4％，灭菌后备用；
发酵罐补料培养基质量百分比为：酵母浸出粉9％，安琪蛋白胨9％，葡萄糖12％，微量盐8％，灭菌后备用；
微量盐配方：0.2g/lcacl2，0.48g/lmgso4，10g/lnahco3，1.0g/lkh2po4，1.0g/lk2hpo4，2.0g/lnacl；
(2)摇瓶菌种扩增：分别向每支斜面试管中依次加入5ml的无菌水，各斜面菌落洗下，混匀后，按1％的接种量接入摇瓶培养基中，在32℃，200rpm摇床培养14h，备用；
(3)种子罐发酵：将步骤1)种子罐发酵培养基放入种子罐中，在种子罐中高温灭菌并冷却后，按4％的接种量接入步骤2)的摇瓶菌液，发酵温度为32℃，ph值控制为6.5，搅拌转速200r/min，发酵过程中发酵罐的通气量最高不超过1.80m3/h，根据溶氧加大罐压，罐压最高不超过0.1mpa，培养8h，备用；
(4)发酵罐发酵：将步骤1)发酵罐发酵培养基放入发酵罐中，在发酵罐中高温灭菌并冷却后，按8％的接种量接入步骤3)发酵液，发酵温度为32℃，ph值控制为6.5，搅拌转速200r/min，通气量最高不超过30.0m3/h，根据溶氧加大罐压，罐压最高不超过0.1mpa。当糖含量低于1.0％时开始补料。采用流加方式进行补料，补料参数控制：糖含量控制范围为1.0％；蠕动泵转速为150r/min；补料周期为100s，开度60s。补料结束后，其糖含量不再降低、od600值不再增长、镜检无杂菌时，发酵结束，关闭补碱系统后，开始离心，在菌泥中加入3倍质量的保护剂，混匀后，冻干、粉碎、装袋，备用。所获得的酿酒酵母菌冻干粉的活菌数不低于1.0×1010cfu/g。
实施例2四联菌复合活菌制剂的动物效力试验
为了检验四联菌复合活菌制剂对由抗生素引起的犬肠道菌群失衡导致的腹泻的治疗效果，进行了动物效力试验。所用四联菌复合活菌制剂是由实施例1制备的双歧杆菌、乳酸杆菌、屎肠球菌和酿酒酵母菌四种菌种冻干粉以不同的比例混合所得，四联菌复合活菌制剂混合完成时主要成分及含量为：每克制剂活菌数含量双歧杆菌、乳酸杆菌分别不低于2.0×109cfu；屎肠球菌、酿酒酵母菌分别不低于2.0×108cfu；低聚木糖10％；其余成分为葡萄糖。10只比格犬(犬的月龄为3.5～4.0，体重5～6kg)随机分为2组，模型组和四联菌复合活菌制剂组，每组5只。10只比格犬服用抗生素溶液，用于制造抗生素相关性模型。具体方法为：经口喂服抗生素溶液(头孢氨苄)，每天2次，两次时间间隔6～8h。连续18天，抗生素诱导浓度采用梯度增加的方法，即100mg/只/次，连续2天；200mg/只/次，连续4天；250mg/只/次，连续3天；500mg/只/次，连续6天；750mg/只/次，连续3天。比格犬逐步出现大便稀湿、机敏性降低、偶有厌食或乏力、呕吐等症状，其为抗生素过量使用引起肠道菌群失调所导致腹泻的典型症状，即为抗生素相关性腹泻。
造模成功后，对犬只经口喂服四联菌复合活菌制剂，每天2次，连续7日，首次用药量加倍。四联菌复合活菌制剂组给药剂量为1.0g/只/次，正常对照组(两只)及模型组给予相同体积的纯化水。通过观察试验犬的临床症状、粪便状态及检测犬粪便微生物，结果表明，四联菌复合活菌制剂治疗后腹泻犬全部恢复，表现为粪便成型，粪便中肠球菌、乳杆菌和双歧杆菌的数量显著高于正常对照组及模型组(p<0.05)，肠杆菌数量显著低于正常对照组及模型组(p<0.05)；而模型组犬只仍呈腹泻状态。研究表明四联菌复合活菌制剂可有效治疗幼犬因抗生素引起的肠道菌群失调所致腹泻症状，犬只治愈率到达100％，并促进肠道菌群恢复至平衡状态。如表1、表2所示。
表1四联菌复合活菌制剂对试验犬治疗效果
注：粪便状态：--：成形便；+：成形但水分稍多；++：粘稠的溏稀便；+++：水样便
表2四联菌复合活菌制剂对比格犬粪便微生物数量的影响(logcfu/g，
注：*p<0.05，**p<0.01
综上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此。对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。