本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及植物乳杆菌na136及其在缓解非酒精性脂肪肝病中的应用。
背景技术：
：非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)是指除酒精和其他明确的损肝因素所致的肝脏病理学，是胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。非酒精性脂肪肝的主要特征是甘油三酯在肝脏内堆积。甘油三酯的过量堆积造成了肥胖和一些代谢综合征。nafld从最初的非酒精性单纯性脂肪肝，可发展为非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，nash)，甚至进展到后期的肝纤维化，肝硬化以及肝癌。非酒精性脂肪肝病与小肠细菌过度生长(sibo)有关，sibo会产生大量的脂多糖(lps)损伤肝脏。这些变化的细胞因子最终导致了非酒精性脂肪肝病炎症的恶性循环。技术实现要素：本发明的目的是提供植物乳杆菌na136及其在缓解非酒精性脂肪肝病中的应用。本发明首先提供了植物乳杆菌na136。植物乳杆菌na136，全称为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)na136，已于2018年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2018112。本发明还保护植物乳杆菌na136在制备用于治疗和/或预防脂肪肝的产品中的应用。本发明还保护植物乳杆菌na136在制备用于治疗和/或预防非酒精性脂肪肝的产品中的应用。本发明还保护植物乳杆菌na136在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下(a1)至(a39)中的至少一项：(a1)降低肝脏脂肪含量；(a2)抑制肝内脂肪沉积；(a3)降低血清中游离脂肪酸的水平；(a4)降低血清中丙氨酸氨基转移酶的水平；(a5)降低血清中胰岛素的水平；(a6)降低血清中炎性因子的水平；(a7)降低血清中肿瘤坏死因子-α的水平；(a8)降低血清中白细胞介素-6的水平；(a9)降低血清中脂多糖的水平；(a10)降低血清中总胆固醇的水平；(a11)降低血清中甘油三酯的水平；(a12)降低血清中低密度脂蛋白胆固醇的水平；(a13)降低体重；(a14)降低脂肪肝患者的肝脏脂肪含量；(a15)抑制脂肪肝患者的肝内脂肪沉积；(a16)降低脂肪肝患者的血清中游离脂肪酸的水平；(a17)降低脂肪肝患者的血清中丙氨酸氨基转移酶的水平；(a18)降低脂肪肝患者的血清中胰岛素的水平；(a19)降低脂肪肝患者的血清中炎性因子的水平；(a20)降低脂肪肝患者的血清中肿瘤坏死因子-α的水平；(a21)降低脂肪肝患者的血清中白细胞介素-6的水平；(a22)降低脂肪肝患者的血清中脂多糖的水平；(a23)降低脂肪肝患者的血清中总胆固醇的水平；(a24)降低脂肪肝患者的血清中甘油三酯的水平；(a25)降低脂肪肝患者的血清中低密度脂蛋白胆固醇的水平；(a26)降低脂肪肝患者的体重；(a27)降低非酒精性脂肪肝患者的肝脏脂肪含量；(a28)抑制非酒精性脂肪肝患者的肝内脂肪沉积；(a29)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中游离脂肪酸的水平；(a30)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中丙氨酸氨基转移酶的水平；(a31)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中胰岛素的水平；(a32)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中炎性因子的水平；(a33)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中肿瘤坏死因子-α的水平；(a34)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中白细胞介素-6的水平；(a35)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中脂多糖的水平；(a36)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中总胆固醇的水平；(a37)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中甘油三酯的水平；(a38)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中低密度脂蛋白胆固醇的水平；(a39)降低非酒精性脂肪肝患者的体重。所述产品为食品、保健品或药品。本发明还保护一种用于治疗和/或预防脂肪肝的产品，其活性成分为植物乳杆菌na136。本发明还保护一种用于治疗和/或预防非酒精性脂肪肝的产品，其活性成分为植物乳杆菌na136。本发明还保护一种产品，其活性成分为植物乳杆菌na136；所述产品的功能为如下(a1)至(a39)中的至少一项：(a1)降低肝脏脂肪含量；(a2)抑制肝内脂肪沉积；(a3)降低血清中游离脂肪酸的水平；(a4)降低血清中丙氨酸氨基转移酶的水平；(a5)降低血清中胰岛素的水平；(a6)降低血清中炎性因子的水平；(a7)降低血清中肿瘤坏死因子-α的水平；(a8)降低血清中白细胞介素-6的水平；(a9)降低血清中脂多糖的水平；(a10)降低血清中总胆固醇的水平；(a11)降低血清中甘油三酯的水平；(a12)降低血清中低密度脂蛋白胆固醇的水平；(a13)降低体重；(a14)降低脂肪肝患者的肝脏脂肪含量；(a15)抑制脂肪肝患者的肝内脂肪沉积；(a16)降低脂肪肝患者的血清中游离脂肪酸的水平；(a17)降低脂肪肝患者的血清中丙氨酸氨基转移酶的水平；(a18)降低脂肪肝患者的血清中胰岛素的水平；(a19)降低脂肪肝患者的血清中炎性因子的水平；(a20)降低脂肪肝患者的血清中肿瘤坏死因子-α的水平；(a21)降低脂肪肝患者的血清中白细胞介素-6的水平；(a22)降低脂肪肝患者的血清中脂多糖的水平；(a23)降低脂肪肝患者的血清中总胆固醇的水平；(a24)降低脂肪肝患者的血清中甘油三酯的水平；(a25)降低脂肪肝患者的血清中低密度脂蛋白胆固醇的水平；(a26)降低脂肪肝患者的体重；(a27)降低非酒精性脂肪肝患者的肝脏脂肪含量；(a28)抑制非酒精性脂肪肝患者的肝内脂肪沉积；(a29)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中游离脂肪酸的水平；(a30)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中丙氨酸氨基转移酶的水平；(a31)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中胰岛素的水平；(a32)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中炎性因子的水平；(a33)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中肿瘤坏死因子-α的水平；(a34)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中白细胞介素-6的水平；(a35)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中脂多糖的水平；(a36)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中总胆固醇的水平；(a37)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中甘油三酯的水平；(a38)降低非酒精性脂肪肝患者的血清中低密度脂蛋白胆固醇的水平；(a39)降低非酒精性脂肪肝患者的体重。所述产品为食品、保健品或药品。以上任一所述食品包括但不限于：含有所述植物乳杆菌的发酵果蔬、含有所述植物乳杆菌的发酵乳、含有所述植物乳杆菌的乳酪、含有所述植物乳杆菌的含乳饮料、含有所述植物乳杆菌的乳粉或含有所述植物乳杆菌的其它食品。所述食品具体可为功能性食品，例如功能性酸奶、功能性菌剂等。以上任一所述药品包括但不限于如下剂型：胶囊、粉剂或片剂。所述药品还可包括其他药学上可以接受的赋形剂或稀释剂。制备粉剂的方法可为冷冻干燥或其它工艺。所述植物乳杆菌的建议剂量如下：每天1次，每千克体重的单次剂量为12×109cfu。本发明的发明人发现，植物乳杆菌na136有助于降低肝脏中炎症反应的发生，对于缓解非酒精性脂肪肝病具有突出优良的效果。日常摄入植物乳杆菌na136或其菌制剂，可以代替药品保护肝脏功能的完整性。本发明为临床干预和控制非酒精性脂肪肝病以及其他慢性肝病提供了新思路，具有广阔的应用前景和推广价值。附图说明图1为血清中胰岛素的检测结果。图2为肝组织he切片的照片。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。如无特殊说明，实施例中的pbs缓冲液均为ph7.0、0.1m的pbs缓冲液。固体bcp培养基：含酵母膏2.5g/l、蛋白胨5g/l、葡萄糖5g/l、溴甲酚紫0.04g/l、琼脂15g/l，余量为水；如无特殊说明，ph＝7.0。液体bcp培养基与固体bcp培养基的区别仅在于不加入琼脂。固体mrs培养基：含蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、酵母膏5g/l、kh2po42g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸钠5g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·4h2o0.05g/l、吐温-801ml/l、琼脂15g/l、葡萄糖20g/l，余量为水；如无特殊说明，ph＝6.6。液体mrs培养基与固体mrs培养基的区别仅在于不加入琼脂。基础饲料：长春市亿斯实验动物技术有限责任公司。高脂饲料(％代表g/100g)：基础饲料75％，猪油10％，蛋黄粉10％，胆固醇(食品级，郑州苍宇化工产品有限公司)5％。c57bl/6j小鼠：长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，动物许可证号：scxk(吉)-2011-0004。采用上海朗顿小鼠总胆固醇酶联免疫试剂盒(货号bpe20095)检测血清中的总胆固醇(totalcholesterol，tc)含量。采用上海朗顿小鼠甘油三酯酶联免疫试剂盒(货号bpe20754)检测血清中的甘油三酯(triglyceride，tg)含量。采用上海朗顿小鼠高密度脂蛋白胆固醇酶联免疫试剂盒(货号bpe20192)检测血清中的高密度脂蛋白胆固醇(highdensitylipoprotein，hdl-c)含量。采用上海朗顿小鼠低密度脂蛋白胆固醇酶联免疫试剂盒(货号bpe20100)检测血清中的低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoprotein，ldl-c)含量。采用上海朗顿小鼠胰岛素酶联免疫试剂盒(货号bpe20353)检测血清中的胰岛素(insulin，ins)含量。采用上海朗顿小鼠肿瘤坏死因子-α酶联免疫试剂盒(货号bpe20220)检测血清中的肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，tnf-α)含量。采用上海朗顿小鼠白细胞介素-6酶联免疫试剂盒(货号bpe20012)检测血清中的白细胞介素-6(interleukin-6，il-6)含量。采用江莱生物小鼠脂多糖酶联免疫试剂盒(货号jl20691)检测血清中的脂多糖(lipopolysaccharide，lps)含量。采用江莱生物小鼠丙氨酸氨基转移酶酶联免疫试剂盒(货号jl12668)检测血清中的丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase，alt)含量。采用江莱生物小鼠游离脂肪酸酶联免疫试剂盒(货号jl11286)检测血清中的游离脂肪酸(freefatacid，ffa)含量。果糖水溶液的制备方法：将30g果糖溶于三级蒸馏水并用三级蒸馏水定容至100ml。植物乳杆菌k25是本发明的发明人由西藏灵菇中自主分离得到。植物乳杆菌k25具有良好的耐酸、耐胆盐、细胞黏附作用，以及较好的降血脂和抗氧化功效。记载有植物乳杆菌k25的文献：植物乳杆菌k25发酵乳降低小鼠血清胆固醇的作用研究，《食品科学》，2012年第07期。实施例1、菌株的分离、鉴定和保藏一、菌株的分离样本取材：传统发酵酸菜。2016年7月，从吉林省延吉市采集传统发酵酸菜，匀浆后采用bcp培养基平板反复划线培养，挑取产黄圈的单菌落接种于mrs培养基平板上培养，采用mrs培养基平板反复划线培养纯化，得到多株纯培养的菌株。纯培养的菌株接种到液体mrs培养基进行培养，然后加入20％甘油，-80℃保存。选择标准：革兰氏染色阳性、过氧化氢酶试验阴性、吲哚反应阴性、产硫化氢试验阴性、明胶液化试验阴性、水解淀粉试验阴性和硝酸盐还原试验阴性。从纯培养的菌株中筛选出多株乳杆菌。将其中1株植物乳杆菌菌株命名为na136。二、菌株的鉴定na136的生理生化鉴定结果：革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性；不运动的杆菌；在15℃和45℃能够生长；耐受6.5％nacl；不水解淀粉，不液化明胶，不产生硫化氢；发酵葡萄糖产酸不产气；联苯胺试验阴性，吲哚试验阴性，乙酰甲基甲醇试验阳性。na136在mrs液体培养基中呈均匀浑浊生长，久置菌体呈白色沉淀。na136的最适生长温度37～42℃，适宜ph为5.0～7.0。na136的分子鉴定结果：16srdna序列如序列表的序列1所示。鉴定结果表明，na136属于植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)。三、菌株的保藏植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)na136，已于2018年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：中国，武汉，武汉大学)，保藏编号为cctccno：m2018112。植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)na136cctccno：m2018112，简称植物乳杆菌na136。实施例2、植物乳杆菌na136对非酒精性脂肪肝的缓解作用一、模型成功率检测第一组：10只8周龄(23克-24克)的雄性c57bl/6j小鼠，连续56天采用高脂饲料以及果糖水溶液进行饲喂。第二组：10只8周龄(23克-24克)的雄性c57bl/6j小鼠，连续56天采用基础饲料以及普通饮用水进行饲喂。完成上述步骤后，处死小鼠，分离肝脏，制作he染色切片(方法同步骤五)。第一组的10只小鼠，肝脂肪变性等级为s1级(脂肪含量为肝重的：5％-33％)。第二组的10只小鼠，肝脂肪变性等级为s0等级(脂肪含量为肝重的：小于5％)。结果表明，采用“连续56天采用高脂饲料以及30％果糖水溶液进行饲喂”的方法制作非酒精性脂肪肝动物模型，成功率为100％。二、分组处理60只8周龄(23克-24克)的雄性c57bl/6j小鼠，进行连续3天的适应性饲养(即试验第1天之前的3天)，然后随机分成4组，每组15只，分组处理如下(整个试验周期为试验第1天至第112天)：空白组(control)：从试验第1天至第112天，均采用基础饲料以及普通饮用水进行饲喂；试验第57天至第112天，每天灌胃一次生理盐水(每千克体重每次给予12ml无菌生理盐水)；模型组(model)：试验第1天至第56天采用高脂饲料以及果糖水溶液进行饲喂，试验第57天至第112天采用基础饲料以及普通饮用水进行饲喂；试验第57天至第112天，每天灌胃一次生理盐水(每千克体重每次给予12ml无菌生理盐水)；植物乳杆菌na136组(na136组)：试验第1天至第56天采用高脂饲料以及果糖水溶液进行饲喂，试验第57天至第112天采用基础饲料以及普通饮用水进行饲喂；试验第57天至第112天，每天灌胃一次菌液(每千克体重每次给予12ml菌液；菌液的制备方法：用pbs缓冲液悬浮植物乳杆菌na136，得到植物乳杆菌na136浓度为1.0×109cfu/ml的菌液)。植物乳杆菌k25组(k25组)：试验第1天至第56天采用高脂饲料以及果糖水溶液进行饲喂，试验第57天至第112天采用基础饲料以及普通饮用水进行饲喂；试验第57天至第112天，每天灌胃一次菌液(每千克体重每次给予12ml菌液；菌液的制备方法：用pbs缓冲液悬浮植物乳杆菌k25，得到k25浓度为1.0×109cfu/ml的菌液)。三、体重测定试验期间，每14天称量体重，结果见表1。由于连续8周采用高脂饲料以及果糖水溶液进行饲喂，模型组小鼠体重、na136组小鼠体重和k25组小鼠体重显著高于空白组小鼠。灌胃给予菌液后，na136组小鼠和k25组小鼠体重开始持续降低，第16周结束时na136组小鼠体重基本与空白组小鼠持平。第16周结束时，与模型组小鼠相比，k25组小鼠的体重降低了11.96％，na136组小鼠的体重降低了17.22％。结果表明，植物乳杆菌na136可以明显降低非酒精性脂肪肝病小鼠的体重，效果优于植物乳杆菌k25。表1植物乳杆菌na136对非酒精性脂肪肝病小鼠体重的影响空白组体重(g)模型组体重(g)k25组体重(g)na136组体重(g)初始体重23.72±1.4524.02±1.3524.02±1.3524.02±1.35第14天24.12±1.7225.24±1.2925.24±1.2925.24±1.29第28天25.07±2.2628.11±2.1828.11±2.1828.11±2.18第42天26.45±1.8129.89±1.2529.89±1.2529.89±1.25第56天27.29±2.3731.45±1.4531.45±1.4531.45±1.45第70天27.68±1.7533±1.4131.21±0.9830.54±1.65第84天27.79±2.3333.37±1.5130.92±1.3329.39±1.84第98天27.89±1.6833.99±2.3730.45±1.5428.91±2.15第112天27.81±2.5434.2±1.7730.11±1.3228.31±1.49四、血清中相关指标的检测试验结束时(试验第113天)，取各组小鼠，摘眼球取血，室温凝固60min后3000rpm离心15min，收集上清(血清)。检测血清中的总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、游离脂肪酸、丙氨酸氨基转移酶、胰岛素、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和脂多糖的含量。血清中血脂相关因子的检测结果见表2。模型组小鼠血清中tc、tg、ldl-c含量均明显高于空白组，hdl-c含量明显低于对照组，这是由于非酒精性脂肪肝病引起小鼠体内代谢紊乱。与模型组相比，na136组小鼠和k25组小鼠血清中tc、tg、ldl-c含量下降，na136组相较于k25组改善血脂水平更加明显。结果表明，植物乳杆菌na136能明显改善非酒精性脂肪肝病的血脂异常。表2植物乳杆菌na136对非酒精性脂肪肝病小鼠血脂的影响注：与模型组比较，*有显著性差异(p＜0.05)，**有极显著性差异(p＜0.01)。血清中游离脂肪酸、丙氨酸氨基转移酶的检测结果见表3。模型组小鼠的ffa和alt含量较空白组显著升高。ffa含量的升高是高脂食物诱发肥胖的显著标志，也是非酒精性脂肪肝病的重要诱因。alt含量的升高表明高脂食物导致了肝脏损伤。与模型组相比，k25组和na136组小鼠的ffa分别降低了46.41％和58.77％，经过对比发现植物乳杆菌na136可以更好的降低血清中的ffa。与模型组相比，k25组和na136组alt分别降低了21.52％和30.09％。说明植物乳杆菌na136能够有效降低ffa和alt在血清中的含量。综合以上结果，植物乳杆菌na136相较于植物乳杆菌k25在缓解非酒精性脂肪肝病中具有更明显的效果。表3血清中ffa和alt的浓度空白组模型组k25组na136组ffa(μmol/l)5.11±0.1515.21±0.518.15±0.44**6.27±0.42**alt(ng/l)14.52±2.6224.63±5.7119.33±2.56**17.22±4.73*注：与模型组比较，*有显著性差异(p＜0.05)，**有极显著性差异(p＜0.01)。血清中胰岛素的检测结果见图1。非酒精性脂肪肝病的致病原因之一就是高胰岛素血症。灌胃植物乳杆菌na136能有效缓解体内代谢紊乱，降低血清胰岛素含量(p＜0.05)。血清中各个炎症因子的浓度的结果见表4。与空白组相比，模型组小鼠血清中的tnf-α、il-6和lps水平均明显升高，说明脂多糖进入血液循环后激发机体的炎症反应，使机体炎症水平升高。与模型组相比，na136组小鼠的tnf-α、il-6和lps水平均呈不同程度降低。结果表明，植物乳杆菌na136能明显缓解脂多糖诱导的炎症反应，降低血清中炎症因子的水平，从而缓解非酒精性脂肪肝病。表4血清中各个炎症因子的浓度组别tnf-α(ng/l)il-6(pg/ml)lps(ng/l)空白组202.82±27.7333.48±6.44175.21±22.89模型组222.86±44.9151.53±3.51243.69±25.51na136组208.22±10.1836.36±8.87*182.37±37.87**注：与模型组比较，*有显著性差异(p＜0.05)，**有极显著性差异(p＜0.01)。五、肝组织he切片试验结束时(试验第113天)，取各组小鼠，处死，分离肝脏。取厚度不超过0.5cm的肝脏组织块，依次进行如下步骤：放入固定液中固定，然后用水浸泡12h，然后用75％酒精溶液浸泡l次(lh)，然后用85％酒精溶液浸泡l次(lh)，然后用95％酒精溶液浸泡，3次(每次更换溶液，每次lh)，然后用100％酒精浸泡3次(每次更换溶液，每次lh)，然后用二甲苯浸泡2次(每次更换溶液，每次lh)，然后用石蜡浸泡3次(每次更换溶液，每次2h)；然后用二甲苯浸泡2次(每次更换溶液，每次5-10min)，然后用100％酒精浸泡l次(l-2min)，然后用95％酒精溶液浸泡l次(1-2min)，然后用85％酒精浸泡1次(每次1-2min)，然后用75％酒精溶液浸泡l次(1-2min)，然后用蒸馏水洗涤；然后用mayer氏苏木素染色1min，然后温水冲洗5-10min，然后用1％盐酸乙醇(取2.75ml36％盐酸加乙醇至100ml)浸泡2s，然后用自来水冲洗30s；伊红复染1-2min，然后用自来水冲洗30s，然后用85％酒精溶液浸泡1次(1-2min)，然后用95％酒精溶液浸泡2次(每次l-2min)，然后用100％酒精浸泡2次(每次l-2min)，然后用二甲苯浸泡2次(每次5-10min)；然后用中性树胶封片。结果见图2。a为空白组，显示为正常肝脏组织，细胞内空泡表示脂滴在肝脏内的沉积。b为模型组，脂滴在肝脏中大量沉积，脂肪变性程度严重。c为na136组，与模型组相比脂滴在肝脏内的沉积程度明显降低。空白组小鼠肝脏脂肪含量(平均值)小于5％。模型组小鼠肝脏脂肪含量(平均值)约为45％。na136组小鼠肝脏脂肪含量(平均值)小于5％。结果表明，植物乳杆菌na136改善了肝脏脂肪变性程度，对非酒精性脂肪肝病的发生具有抑制作用。sequencelisting<110>吉林省农业科学院<120>植物乳杆菌na136及其在缓解非酒精性脂肪肝病中的应用<130>gncyx181112<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1050<212>dna<213>lactobacillusplantarum<400>1aaatgggcgatgaactttaagaaaatgggatctacagtataacccaccgactttgggtgt60tacaactctcatggtgtgacgggcggggtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggc120atgctgatccgcgattactagcgattccgacttcatgtaggcgagttgcagcctacaatc180cgaactgagaatggctttaagagattagcttactctcgcgagttcgcaactcgttgtacc240atccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccc300caccttcctccggtttgtcaccggcagtctcaccagagtgcccaacttaatgctggcaac360tgataataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgac420gacaaccatgcaccacctgtatccatgtccccgaagggaacgtctaatctcttagatttg480catagtatgtcaagacctggtaaggttcttcgcgtagcttcgaattaaaccacatgctcc540accgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcagccttgcggccgtactcccca600ggcggaatgcttaatgcgttagctgcagcactgaagggcggaaaccctccaacacttagc660attcatcgtttacggtatggactaccagggtatctaatcctgtttgctacccatactttc720gagcctcagcgtcagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatata780tctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttccc840agtttccgatgcacttcttcggttgagccgaaggctttcacatcaaacttaaaaaaccgc900ctgcgctcgctttacgcccaataaatccggacgacgcttgccacctacgtattaccgcgg960ctgctggcacgtaagttagccagtggcctttctggttaaataccgtcaatacctgaacag1020ttaactctcaagatatgtcctctttcaaca1050当前第1页12