临床用脂肪干细胞检测体系的制作方法

本发明属于人体干细胞，特别涉及脂肪干细胞检测。
背景技术：
脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，adscs)、adsc多能细胞是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。主要恢复组织细胞的修复功能，促进细胞的再生，恢复年轻面容的同时，身体机能也得到充分改善，有效改善亚健康、早衰等疾病，由内而外真正的有效抵抗衰老。svf(stromalvascularfraction)，中文名血管基质组分，是通过通过抽脂、消化、离心等步骤，从脂肪组织中分离出的多种细胞混合物形成的细胞团。svf中包含数量丰富的间充质干细胞(ascs)、高浓度血小板血浆(prp)、生长因子、红细胞、白细胞、淋巴细胞、单核细胞等。研究发现，新鲜分离的svf中的各种细胞之间有一种协同效应，他们之间相互影响并通过自分泌，增加组织的修复能力和创面愈合能力，安全性、有效性极高。svf来源的脂肪干细胞建立的临床用脂肪干细胞库目前研究较少质量不稳定，如何检测脂肪干细胞的效用及安全性等是目前急需解决的问题。技术实现要素：为了解决上述现有各种方法的不足，本发明的目的是提供一种临床用脂肪干细胞检测体系，该检测体系包括：扩增曲线的建立、细胞周期检测、细胞流式检测、感染性疾病检测、脂肪干细胞分化能力检测、细胞旁分泌检测和动物安全性检测中任一种或多种组合。根据本发明的一方面，提供了一种临床用脂肪干细胞检测体系，其中上述扩增曲线的建立方法为：mtt试剂配制；培养脂肪干细胞：取扩增进入平台期的p2代脂肪干细胞，96孔板中，置于二氧化碳培养箱中培养，培养至第三天换液一次；每隔24h对干细胞进行mtt检测，共检测5天；每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，继续培养4h；终止培养，小心吸去孔内培养液；每孔加入150ul二甲基亚砜，晃动10分钟，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值。根据本发明的一方面，提供了一种临床用脂肪干细胞检测体系，其中上述细胞周期检测方法为：取p2代脂肪干细胞，培养3天后，细胞汇合度约为90％，用70％冰乙醇固定后的1×105(100μl)，pbs洗两次，加入pi染液(含rnase)300μl，混匀，避光孵育30分钟，流式细胞仪检测。根据本发明的一方面，提供了一种临床用脂肪干细胞检测体系，其中上述细胞流式检测方法为：检测细胞免疫表型标志物有：阴性指标cd34、cd45、cd14和hla-dr；阳性指标cd105、cd49d、cd73、cd90；将收获的细胞用pbs悬浮，吹打均匀后转移至15ml离心管中，标明信息，每种标志物均取1×105细胞(100μl)，加入抗体20μl，混匀，避光孵育30分钟，pbs洗两次，流式细胞仪检测。根据本发明的一方面，提供了一种临床用脂肪干细胞检测体系，其中上述脂肪干细胞分化能力检测包括：成脂实验、成骨实验和成软骨实验，检测脂肪干细胞诱导分化为脂、骨、软骨的生物学效力。根据本发明的一方面，提供了一种临床用脂肪干细胞检测体系，其中上述细胞旁分泌检测方法为：取各代细胞，使用流式细胞仪检测分泌蛋白的含量。每孔加标准品或样品100μl，37℃孵育90分钟；弃去液体，每孔加入生物素化抗体工作液100μl，37℃孵育1小时；洗板3次加酶结合物工作液100μl，37℃孵育30分钟。洗板5次，每孔加底物溶液100μl，37℃避光孵育15分钟左右，加终止液50μl，用酶标仪检测egf、bfgf、tgf-β1细胞因子含量(mean±sd)。附图说明图1、为本发明一实施例脂肪干细胞生长曲线图；图2、为本发明一实施例p2代脂肪第三天细胞周期检测图；图3、本发明一实施例流式指标检测结果图；图4、本发明一实施例成脂实验(×4)结果显微照片；图5、本发明一实施例成骨实验(×4)结果显微照片；图6、本发明一实施例成软骨实验(×20)结果显微照片；图7、本发明一实施例制备的hadsc对各剂量组小鼠体温的影响图；图8、为本发明一实施例睾酮和il-2的标准曲线图；图9、为本发明一实施例肝脏组织he染色×100(雌性对照组)显微照片；图10、为本发明一实施例肾脏组织he染色×100(雌性对照组)显微照片；图11、为本发明一实施例脾组织he染色×100(雌性对照组)显微照片；图12、为本发明一实施例卵巢组织he染色×100(雌性对照组)显微照片；图13、为本发明一实施例脏组织he染色×100(雄性对照组)显微照片；图14、为本发明一实施例肾脏组织he染色×100(雄性对照组)显微照片；图15、为本发明一实施例脾脏组织he染色×100(雄性对照组)显微照片；图16、为本发明一实施例睾丸组织he染色×100(雄性对照组)显微照片；图17、为本发明一实施例肝脏组织he染色×100(雌性适剂量组)显微照片；图18、为本发明一实施例肾脏组织he染色×100(雌性适剂量组)显微照片；图19、为本发明一实施例脾脏组织he染色×10(雌性适剂量组)显微照片；图20、为本发明一实施例卵巢组织he染色×100(雌性适剂量组)显微照片；图21、为本发明一实施例肝脏组织he染色×100(雄性适剂量组)显微照片；图22、为本发明一实施例肾脏组织he染色×100(雌性适剂量组)显微照片；图23、为本发明一实施例脾脏组织he染色×100(雌性适剂量组)显微照片；图24、为本发明一实施例睾丸组织he染色×100(雌性适剂量组)显微照片；图25、为本发明一实施例肝脏组织he染色×100(雌性高剂量组)显微照片；图26、为本发明一实施例肾脏组织he染色×100(雌性高剂量组)显微照片；图27、为本发明一实施例脾脏组织he染色×100(雌性高剂量组)显微照片；图28、为本发明一实施例卵巢组织he染色×100(雌性高剂量组)显微照片；图29、为本发明一实施例肝脏组织he染色×100(雄性高剂量组)显微照片；图30、为本发明一实施例肾脏组织he染色×100(雄性高剂量组)显微照片；图31、为本发明一实施例脾脏组织(雄性高剂量组)显微照片；图32、为本发明一实施例睾丸组织he染色×100(雄性高剂量组)显微照片；图33、为本发明一实施例肝坏死he染色×100(雌性适剂量组)显微照片；图34、为本发明一实施例肝坏死he染色×100(雌性适剂量组)显微照片。具体实施方式下面结合附图对本发明作进一步的说明。构建临床应用的脂肪干细胞制备及检测体系实施例1脂肪干细胞细胞库的建立一、培养体系1、脂肪运输过程及客户筛选；适应症筛查要求医院须与顾客签署知情同意书，一式3份。顾客、医疗机构各一份，另一份随标本送交实验室。信息采集顾客个人信息采集：医院以询问和填表方式征询顾客个人信息、过往治疗史、家族遗传史，以及是否有传染病史及造血或免疫系统的异常情况等信息。体检信息。客户体检信息应包括如下项目：hiv-1/2抗体(爱滋病抗体)、hbsag(乙肝表面抗原)、抗-hcv(丙型肝炎抗体)、alt(转氨酶)、梅毒螺旋体抗体。检测方法分别执行卫生部现行检测标准。2、脂肪组织处理方法；自体脂肪干细胞制备工序开始前准备环境：制备人员应对细胞操作间和超净台提前进行紫外消毒，照射时间不少于30分钟。净化空调风机开启时间不少于30分钟。检查环境监测报告是否在有限期内。检查洁净环境的温湿度、压差是否在规定范围，且有毒操作压差应呈现相对负压。物料：制备用器械、试剂及耗材依各工序要求到仓库领取。并依据指令对其品名、来源、批号、质量、数量等进行核对，签字确认后，按要求进入洁净区。记录表格：准备制备工序所需的相关记录表格，按物料要求进入洁净区。人员：登记后进入洁净区。设备：完好并经清洁、消毒。计量器具在检定有效期内。脂肪干细胞制备取出预冷的冻存盒、冻存液以及贴好标签的冻存管。加适量体积的冻存液至含有细胞的离心管中，轻轻沿管壁缓缓滴入10滴，轻轻晃动离心管混匀细胞，再加入余下的冻存液。每冻存管加入1.5ml冻存液。旋紧管盖置于已预冷的加入异丙醇的程序降温和中，迅速置入-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐。冻存液的组成：dmso滴加入无血清培养基，配制成10％dmso浓度的细胞冻存液。3、svf细胞获得方法；配制脂肪组织消化剂溶液：根据脂肪标本的量，配制一定体积的人脂肪组织消化剂溶液，0.22μm无菌过滤器过滤除菌，待用。脂肪组织消化剂的成分为：胶原酶ⅳ，胰酶-edta复合体，α1-抗胰蛋白酶和二甲亚砜。qc检测：qc从标本中取少许废液于2ml冻存管留样冻存，另取一营养琼脂培养皿，加少量标本废液做无菌检测。洗涤脂肪组织：向脂肪标本储液瓶中加入标本洗涤液，重复3～4次，直到洗出的废液澄清为止。标本洗涤液的组成为：1000u的庆大霉素配制成的500mlpbs溶液。消化脂肪组织：将洗涤后的脂肪均等的分装到50ml离心管中，每个管中加入等量的人脂肪组织消化酶，无菌情况下置入37℃恒温振荡培养箱中消化30～60min。分离脂肪细胞：将消化好的脂肪放入离心机，以1100rmp离心10min，去除上层油脂、脂肪及废液，用dmem悬浮细胞，用100μm的滤网过滤掉余下的脂肪组织。吸取少许过滤后的细胞悬液，用血细胞计数仪计数，将过滤后的细胞按冻存和接种需要量分装到不同离心管中，以1100rpm离心8分钟。细胞计数公式：n＝wbc值×106×稀释倍数。4、干细胞培养方法；完全培养基的组成为：胰岛素、氢化可的松、甲状旁腺激素、雌二醇、睾酮、血小板衍生生长因子-ab、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、l-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、白血病抑制因子、l-抗坏血酸、生物素、地塞米松、胰岛素样生长因子和人干细胞生长因子组成，并溶于dmem/f12细胞培养基中。细胞接种培养：将接种部分的细胞弃去上清，留少量原液，用手指轻弹悬浮细胞。再按接种瓶数加适量完全培养基悬浮细胞，分装入3个t75培养瓶中，并再在每个培养瓶中加入适量完全培养基，旋紧培养瓶盖，置入37℃、5％co2培养箱培养。接种的培养瓶上标记抽脂人姓名、编码及日期，置37℃、5％co2、饱和湿度培养箱培养；培养3天后，移液管吸弃上层培养基，加入新完全培养基；培养6天后置于倒置式显微镜观察，如细胞达到80％汇合状态，则拍照。如未达到80％汇合状态，则更换培养基，一边观察，一边继续培养。目视检查是否有细菌混入，检查培养基是否混浊，用显微镜观察是否有微生物运动现象，并将结果记录于相应记录中；细胞消化、传代、冻存：当细胞汇合达到80％左右，拍照观察后，将培养瓶放入洁净工作台，然后用移液管吸弃培养基。pbs洗涤2次，加入2ml0.25％胰酶，倒置显微镜下发现贴壁细胞分离后，加入2ml完全培养基终止胰酶作用，血球计数板计数，并将结果记录于相应记录中。取2瓶t75培养瓶中的细胞以1:3传代到6瓶t175培养瓶中，取1瓶t75培养瓶的细胞进行冻存，每支冻存量应不小于200万个/支。建议：每次传代培养均为2:1比例进行培养及冻存，以获得较多的干细胞。细胞传代培养应不高于6代。5、细胞存储方法；冻存液配制：取50mldmso缓慢滴入450ml的血清替代品(gibco)中，混匀后，用15ml离心管分装冻存于-20℃冰箱中。按照冻存的细胞数量使用冻存液稀释，立即转入含异丙醇的程序降温盒中，并迅速转入到-80℃冰箱中过夜，然后将冻存的细胞转入到液氮罐中，并登记好客户姓名、编号、冻存日期、冻存细胞代数等信息。建议：细胞消化后的脂肪干细胞冻存细胞数量，p0代不少于200万个/ml，p1代不少于200万个/ml，p2代及之后的细胞冻存数量建议以500万的倍数进行冻存，但最高不应超过2000万。实施例2检测体系6、细胞质控检测方法：6.1、扩增曲线的建立6.1.1、mtt试剂配制：称取mtt0.5克，溶于100ml的pbs中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，即成5mg/ml试剂，放4℃避光保存。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。6.1.2、脂肪干细胞：取扩增进入平台期的p2代脂肪干细胞，细胞悬液浓度见表一，滴加入2.5块96孔板中，每孔滴加200μl，且96孔板边缘孔用无菌pbs填充，置于二氧化碳培养箱中培养，培养至第三天换液一次。表1、脂肪干细胞悬液浓度分组细胞浓度/孔重复1空白对照组621000635000648000651000066.1.3、每隔24h对干细胞进行mtt检测，共检测5天6.1.4、每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，继续培养4h。6.1.5、终止培养，小心吸去孔内培养液。6.1.6、每孔加入150ul二甲基亚砜，晃动10分钟，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪od490nm处测量各孔的吸光值，如图1。由图可知，最佳接种密度应为5000个/孔，即15000个/cm2，在最初的2天脂肪干细胞处于细胞生长的适应阶段，在2-4天进入对数生长期，第4天开始细胞生长减慢，进入对数生长期。6.2、细胞周期检测取p2代脂肪干细胞，培养3天后，细胞汇合度约为90％，用70％冰乙醇固定后的1×105(100μl)，pbs洗两次，加入pi染液(含rnase)300μl，混匀，避光孵育30分钟，流式细胞仪检测，如图2所示p2代脂肪第三天细胞周期结果显示g0/g1期的比例为96.78±0.51％，s期的比例为2.14±0.34％，g2/m期的比例为1.09±0.18％。说明细胞停止分裂，证明使用本体系培养的细胞在培养3天时即能达到平台期。6.3、细胞流式检测检测细胞免疫表型标志物有：阴性指标cd34、cd45、cd14和hla-dr；阳性指标cd105、cd49d、cd73、cd90。将收获的细胞用pbs悬浮，吹打均匀后转移至15ml离心管中，标明细胞编码、细胞代数、细胞量及客户姓名。每种标志物均取1×105细胞(100μl)，加入抗体20μl，混匀，避光孵育30分钟，pbs洗两次，流式细胞仪检测。，结果显示脂肪干细胞检测的阳性指标均高于95％，阴性指标均低于5％。如表2和图3所示。表2、流式指标检测结果6.4、感染性疾病检测取少许离心后的细胞上清液至15ml离心管中，用于无菌检测；另取15ml离心管，取上述所获细胞少许用于传染病的检测。具体检测指标如下：表3、干细胞感染性检测及其标准6.5、脂肪干细胞分化能力检测成脂实验：取p3代脂肪间充质干细胞接种于24孔板中,接种3个孔每孔接种105个，间充质干细胞培养基培养2天至细胞融合状态。用pbs清洗一次，更换为脂肪细胞诱导培养基(dmem+100u/ml抗生素+5％小牛血清(fbs)+0.1mmol/l3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(ibmx)+0.1mmol/l吲哚美辛+10mg/l胰岛素+1umol/l地塞米松)诱导12天，每3天全量换液。诱导结束后去除上清液，pbs清洗3次，4％多聚甲醛4℃固定过夜；pbs清洗2次，每次2分钟；先将水性固封剂于60℃温水中加热至液状；在配制油红o染液，按照油红o试剂配制贮备液，油红o：稀释液＝5:2，配制总体积为3.5ml染液，用滤纸过滤待用；将染液滴加至经pbs清洗过后的细胞孔板中，使其均匀覆盖在细胞表面，染色15分钟，之后用pbs洗掉孔板中多余的染液；用复染液染色3～5分钟，再用pbs冲洗2次；加水性固封剂固定细胞表面，镜检；如图4所示。成骨实验：取p3代脂肪间充质干细胞接种于24孔板中,接种3个孔每孔接种105个，间充质干细胞培养基培养2天至细胞融合状态。用pbs清洗一次，更换为成骨培养基(高糖dmem+10μg/l转化生长因子β1+100nmol/l地塞米松+6.25mg/l胰岛素+50nmol/l转铁蛋白β1+1％胎牛血清)，诱导12天，每3天全量换液。诱导结束后去除上清液，pbs清洗3次，4％多聚甲醛4℃固定过夜；pbs清洗2次，每次2分钟；1％茜素红染色30min，用蒸馏水洗去爬片上的多余染液。再用pbs冲洗2次；加水性固封剂固定细胞表面，镜检；如图5所示。成软骨实验：取p3代脂肪间充质干细胞接种于24孔板中,接种3个孔每孔接种105个，间充质干细胞培养基培养2天至细胞融合状态。用pbs清洗一次，更换为成软骨培养基(dmem+10％胎牛血清+2mg/l胰岛素+3mg/l转铁蛋白+1mmol/l丙酮酸+10nmol/l地塞米松+10μg/l转化生长因子β)诱导12天，每3天全量换液。诱导结束后去除上清液，pbs清洗3次，4％多聚甲醛4℃固定过夜；pbs清洗2次，每次2分钟；0.1％甲苯胺蓝液浸染20min。用蒸馏水洗去爬片上的多余染液。再用pbs冲洗2次；加水性固封剂固定细胞表面，镜检；结果如图6所示。检测结果表明，脂肪干细胞具有诱导分化为脂、骨、软骨的生物学效力，说明细胞诱导分化的多能性。6.6、细胞旁分泌检测取各代细胞，使用流式细胞仪检测分泌蛋白的含量。每孔加标准品或样品100μl，37℃孵育90分钟；弃去液体，每孔加入生物素化抗体工作液100μl，37℃孵育1小时；洗板3次加酶结合物工作液100μl，37℃孵育30分钟。洗板5次，每孔加底物溶液100μl，37℃避光孵育15分钟左右，加终止液50μl，用酶标仪检测egf、bfgf、tgf-β1细胞因子含量(mean±sd)表四、细胞因子含量(mean±sd)检测结果表明，脂肪干细胞可分泌egf、bfgf及tgf-β1等生长因子。且细胞代数对样本含量影响较小。6.7、动物安全性检测30只5～6周龄balb/c-nu裸鼠(体重20g±)，雌雄各半，适应实验室条件饲养一周。注射前记录动物体温、体重和饲料量。表五、动物实验分组及细胞注射剂量注射前记录动物体温、体重和饲料量。细胞悬液，台盼蓝检测细胞活力>95％。按分组剂量进行尾静脉注射，脂肪干细胞在2小时内使用完毕，对照组给予相应体积生理盐水。临床观察：一般状况：每天观察动物皮毛、行为、口鼻分泌物、进食、饮水、排泄等情况，每天测量并记录体重、体温及食物消耗变化及是否致瘤。动物死亡情况：对所有死亡动物进行病理解剖，并记录症状出现时间、持续时间，死亡时间、是否可逆等。临床病理学评估：所有动物在干细胞注射后14天处死，进行临床病理学评估。摘除小鼠眼球取血，进行血液学和血清学生物化学检测。血液学测定：红细胞(rbc)计数、白细胞(wbc)计数、血小板(plt)计数；白细胞分类计数、血红蛋白(hb)测定。血浆生化检测：全自动生化仪测定谷丙转氨酶、尿素氮、肌酐、葡萄糖、白蛋白、球蛋白及白球比变化，elisa法测定il-2、睾酮水平变化。全身主要脏器病理检查：观察脑、心、肺、肝、脾、肾、甲状腺/甲状旁腺、睾丸/卵巢等脏器外形、颜色、质地等肉眼可见改变，并进行称重，计算脏器指数。取肝、肾、脾和睾丸/卵巢，经福尔马林固定、石蜡切片，he染色，进行病理学观察。诊断标准：1、临床表现诊断标准：1、毛、行为、口鼻分泌物、进食、饮水、排泄等情况应正常；2、体温、体重无明显变化；2、临床病理学诊断标准：2.1病理学评估标准：a、血常规计数无明显变化b、血清指标及血清细胞因子无明显变化；组织病理性诊断标准：a、肝组织病理学诊断标准为：肝小叶廓完整，肝细胞排列整齐，无脂肪变性无淤血等；b、肾组织病理学诊断标准为：大小正常，肾血管无淤血，肾窦、肾小盏、肾小球无变形、无异状体出现，重量无显著差异。c、脾组织病理学诊断标准为：脾被膜未增厚，脾组织无淤血，无淋巴结增生。d、生殖系统组织病理学诊断标准为：雌性器官无平滑肌纤维改变，不同发育阶段的卵泡、黄体和白体正常；雄性器官生精上皮结构完整，生殖器官无异常。实验结果1.1小鼠一般情况变化尾静脉注射hadsc后连续观察14天，没有发现祼鼠的异常行为和死亡情况。与对照组相比较，各实验组动物进食和饮水、体温和体重都没有显著变化(见表6.2、6.3和图7)。说明hadsc尾静脉注射对祼鼠饮食、体温和体重等一般情况没有明显影响。表6.2.hadsc对裸鼠进食和饮水的影响(mean±sd)注：与同性别对照组比较，p>0.05。表6.3：hadsc对裸鼠体重增长的影响(mean±sd)注：与同性别对照组比较，p>0.05。1.病理学评估1.1小鼠血细胞常规计数的变化尾静脉注射hadsc后，连续观察14天后，摘眼球取血，进行血细胞计数常规检测，与正常对照组相比较，各剂量组雌性和雄性小鼠白细胞分类、红细胞、血红蛋白和血小板计数的值均没有显著性变化(p>0.05)，只有雌性小鼠高剂量组的白细胞计数明显减少(p<0.05)。说明hadsc对裸鼠血细胞常规计数基本没有影响，高剂量组雌性小鼠白细胞计数的减少。表4-1：hadsc注射对裸鼠血细胞计数的影响(mean±sd)注：*与相同性别对照组比较，p<0.05表4-2：hadsc注射对裸鼠血细胞计数的影响(mean±sd)1.2小鼠血清指标的变化尾静脉注射hadsc后第14天，摘眼球取血，离心后取血清，使用全自动生化仪进行相关血清学指标检测。表5的实验结果表明，与雌性对照组相比较，适剂量组谷丙转氨酶alt降低，血糖glu升高，高剂量组尿素urea升高。与雄性对照组相比较，高剂量组总蛋白tp、球蛋白glob、尿素urea降低。适剂量组尿素urea和肌酐crea降低。但是这些变化幅度较小，均在正常范围之内。表5-1：hadsc注射对祼鼠血清生化指标的影响(mean±sd)注：*与相同性别对照组比较，p<0.05表5-2：hadsc注射对祼鼠血清生化指标的影响(mean±sd)注：*与相同性别对照组比较，p<0.051.3小鼠血清细胞因子的变化尾静脉注射hadsc后第14天，摘眼球取血，离心后取血清，使用elisa试剂盒检测睾酮和il-2的变化，标准曲线见图8。与相同性别对照组比较，各剂量组睾酮和il-2的水平没有明显变化(见下表6)。表6：hadsc注射对祼鼠细胞因子指标的影响(mean±sd)1.4小鼠全身主要脏器指数的变化尾静脉注射hadsc后第14天，处死小鼠解剖，肉眼观察脑、心、肺、肝、脾、肾、甲状腺/甲状旁腺、睾丸/卵巢等脏器外形、颜色、质地等没有明显变化，脏器指数结果见表7-1、表7-2表7-3。与雌性对照组动物相比较，高剂量组雌性裸鼠的心脏、肺脏、肝脏、肾脏和胸腺等脏器器指数降低(p<0.05)。但是，与雄性对照组动物相比较，各剂量组雄性祼鼠的脏器指数没有明显变化(p>0.05)。表7-1：hadsc注射对祼鼠脏器指数的影响(mean±sd)注：*与相同性别对照组比较，p<0.05表7-2：hadsc注射对祼鼠脏器指数的影响(mean±sd)注：*与相同性别对照组比较，p<0.05表7-3：hadsc注射对祼鼠脏器指数的影响(mean±sd)注：*与相同性别对照组比较，p<0.052.5小鼠组织病理学常规检查结果尾静脉注射hadsc后第14天，处死小鼠解剖，采取的组织固定于10％福尔马林溶液中，按照常规石蜡切片制作方法，经过取材、修整、脱水、包埋、切片等步骤，进行常规苏木素-伊红(hematoxylin-eosin，he)染色。置于光学显微镜下进行样品的组织病理学观察。组织病理学观察结果如下图图9至图34.组织镜下描述：肝脏组织：各组中的肝小叶轮廓完整，肝细胞索排列整齐，肝细胞未见明显脂肪变性，肝窦轻度淤血，门管区血管轻度淤血。发现适量组1只雌性裸鼠肝组织出现点状坏死、碎片状坏死。对照组、适剂量组和高剂量组中的肝脏组织未见明显的计量差异变化。肾脏组织：各组中的肾小体大小如常，肾血管球少量红细胞，未见血管球玻璃样变，肾小球囊内未见新月体出现，肾小管上皮细胞未见空泡变，未见各种管型，间质血管淤血。对照组、适剂量组和高剂量组中的肾脏组织未见明显的计量差异变化。脾脏组织：各组中的脾被膜未见增厚，红髓轻度淤血，白髓相对缩小，白髓内淋巴小结未见明显增生。对照组、适剂量组和高剂量组中的脾脏组织未见明显的计量差异变化。生殖腺：雌性各组中的卵巢可见不同发育阶段的卵泡、黄体和白体，其间的基质细胞、网状纤维及散在的平滑肌纤维未见异常改变；雄性各组中的睾丸可见生精小管的生精上皮结构完整，支持细胞和生精细胞未见异常改变，管腔内可见精子，未见大量异常形态的精子。对照组、适剂量组和高剂量组中的生殖腺组织未见明显的计量差异变化。组织病理学诊断:各剂量组的组织未见明显的异常病理学改变，部分祼鼠的病理学变化可能为个体因素引起，没有显著的计量差异变化。三.实验结论尾静脉注射hadsc后14天，与同性别的对照组相比较，适量组和高剂量组祼鼠的活动、体温、饮食和体重等未见明显的异常变化；常规血液学检测和生化指标的变化也均在正常范围之内；睾酮和il-2也没有明显变化。与相同性别对照组相比较，高剂量组雌性裸鼠的心脏、肺脏、肝脏、肾脏和胸腺等脏器指数降低，雄性组的脏器指数没有明显变化，各剂量组的组织未见明显的异常病理学改变，部分祼鼠的病理学变化可能为个体因素引起，没有显著的计量差异。本实验结果表明，hadsc尾静脉注射没有引起裸鼠明显的急性毒性表现。下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例，并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例，都属于本发明的权利保护范围。当前第1页12