本发明属于微生物技术领域，涉及一种胶红酵母菌，更具体地说，本发明涉及一种高耐锑胶红酵母菌djhn070401及其分离筛选方法和应用。
背景技术
锑(sb)是与砷同一主族的类金属元素，因具有遗传毒性、致癌性及全球迁移性等特点被列为优先控制污染物，而天然水体则是大部分锑污染物的环境归宿和汇集库。因此，如何让含锑废水在排放前达标，是一项刻不容缓的科学任务。国内外传统的含锑废水处理技术有化学混凝沉淀、电化学沉淀、化学氧化还原、离子交换、膜处理技术等，这些技术虽具有一定的积极作用，但仍存在效率低、成本高、操作复杂、易产生二次污染等问题。为提高处理效益，国内外学者不断探索新的策略和方法。目前，吸附法是处理水体锑污染最常用的技术之一，寻找高效廉价环保的吸附材料亦成为了研究热点。经研究，学者们提出了安全、经济、环境友好的、也是有潜在价值的微生物吸附技术。利用微生物技术治理锑污染，关键是获得具有高度耐锑能力的菌株，但有关耐锑微生物的筛选、鉴定方法较少，相关技术仍然薄弱。
基于上述理由，特提出本申请。
技术实现要素：
本发明针对背景技术中所指出的问题及现有技术存在的不足，本发明的第一目的在于提供一种高耐锑胶红酵母菌djhn070401，本发明的第二个目的在于提供上述所述高耐锑胶红酵母菌djhn070401的分离筛选方法，本发明的第三个目的在于提供上述所述高耐锑胶红酵母菌djhn070401的应用，可用于含锑土壤或废水的处理。
为了实现本发明上述第一个目的，本发明采用的技术方案为：一种高耐锑胶红酵母菌djhn070401，其分类命名为：胶红酵母菌(rhodotorulamucilaginosa)djhn070401，已保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：cctccno：m2018212，保藏日期：2018年4月18日；所述的高耐锑胶红酵母菌djhn070401的18srrna序列如seqidno.1所示，26srrna基因序列如seqidno.2所示，its基因序列如seqidno.3所示。
本发明所述的高耐锑胶红酵母菌djhn070401，是从湖南锡矿山北矿冶炼厂附近农用土壤中分离筛选获得，具体是经平板抗性筛选获得。
本发明上述所述的高耐锑胶红酵母菌(rhodotorulamucilaginosa)djhn070401还具有如下性质：
1、微生物学特征
本发明的高耐锑胶红酵母菌djhn070401为革兰氏阴性菌，该菌单菌落呈粉红色，直径3～4mm，隆起，表面光滑，菌苔粘稠，显微镜观察，美兰染色结果为椭球型、出芽生殖，菌落形态如图1所示。
为了实现本发明的另一目的，本发明提供上述所述的高耐锑胶红酵母菌djhn070401的分离筛选方法，所述方法主要包括以下步骤：
取湖南锡矿山北矿冶炼厂附近农用土壤，加入到无菌水中，搅拌20～60min，使菌株从土样中充分洗脱下来，然后静置10～30min，将上清液加入到改进的9k液体培养基中，在30℃、150rpm的摇床中恒温培养1～2天；再将所述液体培养基分别涂布到低浓度的sb(ⅴ)和sb(ⅲ)的固体平板表面，待菌落长出后，依次递增划线接种到锑浓度更高的固体培养基上培养，测定菌株对不同价态锑的耐受能力，挑选耐锑能力最强的菌落，最后将菌落在平板表面划线转接多次进行菌株纯化，获得所述高耐锑胶红酵母菌djhn070401。
为了实现本发明的第三个目的，本发明提供上述所述胶红酵母菌djhn070401的应用，可用于含锑离子土壤或废水的治理。
所述的胶红酵母菌djhn070401作为锑离子吸附剂的应用。
一种锑离子吸附剂，所述吸附剂包含所述的胶红酵母菌djhn070401。
与现有技术相比，本发明涉及的一种高耐锑胶红酵母菌djhn070401及其分离筛选方法和应用具有如下的有益效果：
(1)本发明提供了对水体或土壤中锑离子具有极强耐受性的菌株的分离筛选、优化培养，初步构建了耐锑菌株的菌株库；
(2)本发明的胶红酵母djhn070401菌株为革兰氏阴性菌，对高浓度锑具有良好的耐受性能，不论在液体或者是固体培养基中，都具有较好的耐锑性能，因此该生防细菌在锑含量高的溶液和土壤中依然能够生存，可有效实现sb(ⅲ)和sb(ⅴ)在土壤或水体中迁移转化过程的控制，降低土壤或水体中锑毒性及生态危害，最终实现重金属sb污染的有效治理。
(3)本发明的胶红酵母djhn070401菌株对水体中锑(sb)离子具有较高的吸附容量且吸附速度快，对环境友好，是一种具有良好应用前景的菌株，对微生物吸附除锑技术的发展具有重要意义。
附图说明
图1是本发明实施例1的胶红酵母djhn070401平板筛选结果的照片；
图2是本发明实施例1的胶红酵母djhn070401细胞形态的照片；
图3是本发明实施例1的胶红酵母djhn070401透射电镜照片；
图4是本发明实施例4的胶红酵母djhn070401菌株在不同初始浓度锑的生长曲线；
图5是本发明实施例7的胶红酵母djhn070401菌株质粒的检测结果图。
具体实施方式
下面对本发明的实施案例作详细说明。本实施案例在本发明技术方案的前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施案例。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式做出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
实施例1胶红酵母djhn070401的分离筛选
本发明的胶红酵母，其属名为rhodotorula，种名为mucilaginosa，株名为djhn070401，菌株是从湖南锡矿山北矿冶炼厂附近农用土壤中分离筛选获得，具体通过平板抗性筛选获得。所述筛选方法属于本领域常规实验方法。具体方法及过程描述如下：
取10g待测土样，加入到装有90ml无菌水的三角瓶中，在磁力搅拌器上搅拌30min后，使菌株从土样上充分洗脱下来，静置20min；再取1ml上清液加入到改进的9k液体培养基(王曙光，徐哲，罗鹏程.一种改进的9k固体培养基制备方法[p].201510671854.7.)中培养，在30℃，150rpm的摇床中培养1～2天。再取营养液涂布到50mg/lsb(ⅴ)和50mg/lsb(ⅲ)的固体平板上，待菌落长出后，依次递增划线接种到锑浓度更高的固体培养基上培养，测定菌株对不同价态锑的耐受能力。耐锑能力最强的菌落被挑选出来进行后续的实验。将菌落在平板上划线转接3次以上进行菌株纯化。获得一株高效耐锑酵母菌，结果参见图1。菌株经形态(培养)、生理生化特征和18srrna等序列分析，鉴定为胶红酵母(rhodotorulamucilaginosa)，即本发明的胶红酵母djhn070401菌株。
图1所示照片为胶红酵母djhn070401菌落形态。图2所示照片为胶红酵母djhn070401在激光共聚焦显微镜下，放大40×10倍拍照。图3所示照片为胶红酵母djhn070401的透射电镜照片。
该菌种的培养条件、检测存活性条件是：(nh4)2so43.0g，kh2po40.5g，kcl0.1g，mgso4·h2o0.5g，ca(no3)2·2h2o0.01g，feso4·7h2o44.2g，18g琼脂粉，1000ml水，ph2.0，30℃下培养。
该菌单菌落呈粉红色，隆起，表面光滑，菌苔粘稠。显微镜观察，美兰染色结果为椭球型、出芽生殖。
实施例2胶红酵母djhn070401的分子鉴定
本实施例分别通过18srrna序列、26srrna序列和its序列对本发明的胶红酵母djhn070401进行测试分析。
2.1胶红酵母djhn070401的18srrna序列的测定与分析
真菌提取dna：取适量菌体样本8000r/m离心10min，弃上清；加入100μlstes重悬；加入80μl玻璃珠(直径0.1～0.2mm)，每管加入40μlte(ph＝8.0)；加入120μlpci(酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)；漩涡震荡10min；12000r/m离心10min，取上层水相到新的ep管中，加入等体积异丙醇，再加入1/5体积naac；-20℃沉淀15min，4℃12000r/m离心10min；弃上清，37℃空气中充分干燥dna，40μlte溶解作pcr模板备用；
利用真菌的通用引物对筛选到的菌株进行pcr鉴定：使用18srrna保守序列的上游引物ns1：5’-gtagtcatatgcttgtctc-3’(如seqidno.4所示)和下游引物ns8：5’-tccgcaggttcacctacgga-3’(如seqidno.5所示)，对胶红酵母djhn070401的18srrna基因片段进行pcr扩增，克隆并测序。
pcr反应体系为：
反应条件：94℃10min；94℃1min；55℃1min，72℃1.5min，32cycles；72℃10min，10℃∞。
测序后获得1703bp的片段，在genbank的登录号为mh611511(bankit2132254seq1(18srrna))，经过测序得到该菌属于胶红酵母菌，扩增片段的测序结果见seqidno.1所示。
另外，本发明上述所述胶红酵母djhn070401的18srrna测序blast结果如下表1所示。
表1胶红酵母djhn070401的18srrna测序blast结果表
2.2胶红酵母djhn070401的26srrna序列的测定与分析
利用酵母菌26srdna通用引物进行26srdna的扩增。
上游引物nl1：5’-gcatatcaataagcggaggaaaag-3’(如seqidno.6所示)；
下游引物nl4：5’-ggtccgtgtttcaagacgg-3’(如seqidno.7所示)。
pcr反应体系为：
反应条件：94℃10min；94℃1min；55℃1min，72℃1min，34cycles；72℃10min，10℃∞。
26srrna基因序列如seqidno.2所示。
2.3胶红酵母djhn070401itsrrna序列的测定与分析
利用酵母菌itsrdna通用引物进行26srdna的扩增。
上游引物its1：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’(如seqidno.8所示)；
下游引物its4：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’(如seqidno.9所示)。
pcr反应体系为：
反应条件：94℃10min；94℃1min；55℃1min，72℃1min，34cycles；72℃10min，10℃∞。
its序列测试分析如seqidno.3所示。
实施例3胶红酵母djhn070401抗锑性能测试
将分离得到的纯培养菌株接种于9k液体培养基100ml中，30℃振荡培养过夜。将菌液浓度稀释至10-2后，取60μl依次涂布于sb(ⅴ)浓度100、200、300、500、750、1000mg/l和sb(ⅲ)浓度50、100、150、200、300、400、500mg/l的固体培养基平板上，每个锑浓度梯度做3个平行平板。30℃恒温培养3d后，观察菌落生长情况。结果表明，分离得到的纯培养菌株在sb(ⅴ)浓度分别为100、200、300、500、750mg/l的固体培养基平板上均能够生长，但是在750mg/l的固体培养基平板上菌落数量显著减少，说明sb(ⅴ)浓度为750mg/l已经接近该分离菌株的极限浓度。同理，sb(ⅲ)浓度500mg/l接近菌株的极限浓度。
与其他研究报道相比较，胶红酵母djhn070401对重金属锑的抗性高于其他报道的微生物。菌株长期生存在重金属污染区，对重金属锑的强抗性可能与它的复杂的生存环境有关。
实施例4胶红酵母djhn070401生长曲线测试
将分离得到的纯培养菌株接种于新鲜牛肉膏蛋白胨培养基中培养至12h左右，然后取一定量的菌液(3％接种量)接入不同sb(ⅲ)浓度的牛肉膏蛋白胨培养基液体培养基(0mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l)，30℃，150rpm培养。以未接种的液体培养基为参比，在分光光度计于波长620nm处测定od值，绘制生长曲线，分析菌株在不同锑浓度液体培养基的生长情况。
酵母菌接种到新鲜培养基中一般都不能立即进行对数增长，而且对数生长的持续时间是有限的。图4是初始sb(ⅲ)浓度分别为0、20、50、100和200mg/l下，培养了30h后的rhodotorulamucilaginosadjhn070401生长曲线。由图可见，当sb(ⅲ)浓度为20、50mg/l时，重金属锑离子对菌株的生长无明显的抑制作用。当初始浓度大于100mg/l时，菌体的生长受到不同程度的抑制，对数生长期明显被推迟，而且进入对数期后生长明显偏低，到达对数稳定期的时间相对也延长。但是，对比不同锑浓度的菌株生长速率，结果发现菌株能在含sb(ⅲ)浓度50mg/l的液体培养基中正常生长，与对照组的生长速率相当，表明该菌株rhodotorulamucilaginosadjhn070401对锑具有较强的耐受性。
实施例5胶红酵母djhn070401的碳源氧化和同化检测
利用biologff微孔板测试微生物对微孔板中不同碳源的利用及氧化情况，测试使得有特征代谢的孔变成紫色或者浊度发生改变，从而使微生物在测试板上显示出“代谢指纹图谱”。所有必要的营养物质以及生化试剂都被预先填充、干化在96个孔中。在一部分孔中(a-c行)，四唑类氧化还原染料通过色度的变化来指示碳源的氧化情况。而剩下的孔(d-h行)则通过浊度的变化来显示微生物对碳源的利用情况。试验的操作过程如下：使用me培养基划线分离纯的的胶红酵母djhn070401，在2％me琼脂上培养基上，26℃培养24～48h。然后将分离到的纯种用棉签挑到ff-if接种液中，配成75％t(上下偏差2％)细胞浓度的菌悬液。将菌悬液按每孔100μl的量加到ff板，菌悬液通常包含孢子和菌丝片断。当培养时，就会利用到孔中的碳源，会发生下列某一个或两个变化：1，线粒体活性增加，形成微红-橙色颜色，在490nm处的光密度增加。2，细胞生长，浊度增加，同时在490nm和750nm处的光密度增加。a1孔不含碳源，同时作为色度和浊度的参照孔。鉴定板一般孵育1～4天。利用microstation读数仪在490nm和750nm定量检测每孔的色度和浊度反应。biologmicrologtm软件通过ff板上显颜色及浊度变化所产生的指纹图谱自动与数据库比对，寻找符合条件的结果。如果找到匹配的，所分离出来的微生物得到鉴定。
结果如下表2、3所示，其中表2为胶红酵母djhn070401菌株的碳源氧化结果表；表3为胶红酵母djhn070401菌株的碳源利用结果表。
表2胶红酵母djhn070401菌株的碳源氧化结果表
+：阳性反应；-：阴性反应
表3胶红酵母djhn070401菌株的碳源利用
+：阳性反应；-：阴性反应
实施例6胶红酵母djhn070401吸附性能测试
用摇瓶实验对菌株的锑吸附能力进行了初步研究。9个250ml的三角烧瓶中装100ml牛肉膏蛋白胨培养基，编号为no.1～9，分为3组：(1)1～3号为a组；(2)4～6号为b组；(3)7～9号为c组。a组不接种，b、c组接入3％的菌液，9个瓶子均放到30℃、180rpm的摇床中培养。24h后，把c组的3个瓶子进行高温灭菌(121℃，20min)。然后在9个瓶子中均加入sb(ⅲ)，使sb(ⅲ)的终浓度为10mg/l，再把9个瓶子放入摇床中培养。24h后，将培养液8000rpm离心10min，用原子吸收光谱法测定上清液中的锑浓度，取每组的平均数值作为实验数据，并计算它们的锑吸附率。
从表4可知，在锑的吸附实验中，活菌组b组和灭活组c组中锑等的浓度低于空白组a组。从节省时间和能源的角度考虑，生物吸附的适宜时间为24h。与sb(ⅲ)作用24h后，活菌和灭活菌溶液中的锑浓度分别下降3.64mg/l和2.79mg/l，对溶液中的sb(ⅲ)去除率分别达到36.40％和27.90％。结果表明抗锑rhodotorulamucilaginosadjhn070401的活菌和灭活菌都对水环境中的锑有一定去除作用，活菌的除锑效果比灭活菌好。表明微生物的重金属去除与菌株本身的特点有关，该菌株有较强的重金属抗性，其生长受重金属的毒性影响较小，它在水处理过程中有生物吸附和生物积累作用，而死菌体只有生物吸附作用，所以活菌的去除效果比死菌要好。
表4菌株rhodotorulamucilaginosadjhn070401对锑离子的吸附
实施例7胶红酵母djhn070401抗锑基因测试
质粒消除实验：参照文献(呼庆，齐鸿雁，窦敏娜，等.强抗镉蜡状芽孢杆菌的分离鉴定及其抗性机理[j].环境科学.2007,28(2):427-430；李钧敏，金则新.银离子抗性细菌质粒的分离与鉴定[j].应用生态学报.2006,17(2):305-308)中质粒消除的方法改进，将对数期培养菌株分别接种于含有0.3％sds、350μg/ml吖啶橙和40mmol/l苯甲酸钠的100ml牛肉膏蛋白陈培养基中，30℃振荡培养48h。将菌液浓度依次稀释至10-1、10-2后分别涂布于sb(ⅲ)为0、50、100mg/l的固体培养基平板上,每个浓度梯度做3个平行平板。30℃恒温培养3d后，观察菌落生长情况。
质粒提取实验：取培养至对数期的胶红酵母djhn070401菌液1.5ml，用酵母质粒提取试剂盒(sk2410-50t)提取质粒，方法按说明书操作。
图5是本实施例的胶红酵母djhn070401菌株质粒的检测结果图。结果表明，采用试剂盒提取菌体的质粒，电泳结果在凝胶成像系统下没有找到色带。菌株经过sds、吖啶橙和苯甲酸钠培养消除质粒处理后，将菌液浓度稀释至10-1、10-2后分别涂布在有锑和无锑的培养皿中，培养2天后，培养皿上都有菌落长出，菌落的数量没有明显差异，表面消除质粒的处理不影响菌落的抗锑性能。因此，可以初步认为，该胶红酵母菌株内没有质粒，抗性基因存在于染色体上。
序列表
<110>湖南科技大学
<120>一种高耐锑胶红酵母菌djhn070401及其分离筛选方法和应用
<130>无
<160>9
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1703
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gttccgaacttttacgcaataagagtgaaactcgcgaatggctcattaaatcagtcatag60
tttatttgatggtaccttactacatggataactgtggtaattctagagctaatacatgct120
gaaaaatcccgacttctggaagggatgtatttattagatccaaaaccaatggccttcggg180
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aaggacacgcagcaggcgcgcaaattatcccctggcaacactttgccgagatagtgacaa420
taaataacaatgcagggctcttacgggtcttgcaattggaatgagtacaatttaaatccc480
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