本发明涉及一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，属于微生物以及基因工程技术领域。
背景技术
不饱和脂肪酸是指含有一个或多个双键的脂肪酸，其主要包含油酸、亚油酸、亚麻酸等，其中，油酸在工业应用中用途广泛，亚麻酸人体内不能自身合成，为必需脂肪酸对维持人体健康具有重要的作用。
现如今，人们因饮食习惯不当等原因，常缺乏不饱和脂肪酸的摄入，可导致生长迟缓、生殖障碍、皮肤损伤等问题，医药保健、工业应用等领域对于不饱和脂肪酸，特别是油酸、亚麻酸等的需求日益增加，因此，急需找到一种能够大量生产优质油酸、亚麻酸等不饱和脂肪酸的方法。
高山被孢霉是一种典型的产油丝状真菌，由于其产油能力显著，可作为多不饱和脂肪酸(pufas)的来源，然而高山被孢霉的产脂能力有限并受诸多因素影响，为提高高山被孢霉脂质合成的能力，并对其合成机理进行探究，可从分子水平对脂质合成相关基因进行遗传改造。
经研究，乙酰辅酶a和nadph是脂肪合成的关键因素，脂肪酸的生成需要提供前体乙酰辅酶a以及还原力来源nadph。
通常认为，磷酸戊糖途径和苹果酸酶是细胞内主要的nadph来源；也有研究表明氨基酸代谢和脂质合成有重要关系，如亮氨酸和赖氨酸代谢、脯氨酸和谷氨酸代谢、丝氨酸代谢、苯丙氨酸代谢等，其中，苯丙氨酸羟化酶(pah)可催化苯丙氨酸反应生成酪氨酸，此步骤是苯丙氨酸代谢的限速反应，且最终可生成nadph。
目前，动物体内的苯丙氨酸羟化系统已经完成了分子生物学鉴定，其包含以下要素：苯丙氨酸羟化酶(pah；ec1.14.16.1)、蝶啶甲醇胺脱水酶(pcd；ec4.2.1.96)、二氢蝶啶还原酶(dhpr；ec1.5.1.34)以及氧化辅助因子bh4和分子氧，其中，pah及其辅助因子bh4可能与脂质代谢相关，人类pah基因的突变可导致苯丙酮尿症(pku)，pku患者体内如aa和epa等长链脂肪酸的含量会降低，而油酸的含量则升高。
王鸿超等前期对高山被孢霉进行了全基因组测序，并完成了高山被孢霉苯丙氨酸羟化系统的分子生物学鉴定，从分子水平上在真菌中证明了苯丙氨酸羟化系统的存在，并通过在培养基中添加pah抑制剂，发现高山被孢霉的脂质合成能力下降；bh4是nos的辅助因子，张陈等人已证明bh4代谢增强提高了高山被孢霉脂肪酸和nadph含量的同时也增强了pah基因的转录水平；本发明则选取pah基因为研究对象，尝试提高高山被孢霉生产不饱和脂肪酸的能力，此研究对于产油真菌高山被孢霉的基础理论研究及产品开发均具有重要的意义。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明以苯丙氨酸羟化酶(pah)基因为目的基因，以pbig2-ura5s-its为表达载体，以高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株ccfm501为宿主菌株，通过根癌农杆菌介导的方法过表达pah基因，构建了一种生产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，其生产不饱和脂肪酸的能力可提升将近30％，且其对于产油真菌高山被孢霉的基础理论研究及产品开发均具有重要的意义。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌，所述工程菌包含重组质粒与表达宿主；所述重组质粒包含目的基因以及表达载体；所述目的基因为苯丙氨酸羟化酶(pah)基因；所述表达载体为pbig2-ura5s-its；所述表达宿主为高山被孢霉。
所述表达载体pbig2-ura5s-its记载于公开号为cn103571762a，公开日为2014年02月12日的专利中。
在本发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸羟化酶(pah)基因来源于高山被孢霉(mortierellaalpina)atcc#32222。
在本发明的一种实施方式中，所述苯丙氨酸羟化酶(pah)的核苷酸序列为seqidno.1。
在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主为高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株ccfm501；所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株ccfm501已于2013年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为cgmccno.8414。
所述高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株ccfm501记载于公开号为cn103468581a，公开日为2013年08月09日的专利中。
在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒通过农杆菌介导转化进入表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述农杆菌为根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)。
在本发明的一种实施方式中，所述农杆菌介导转化为先将重组质粒转化入农杆菌后，再用含重组质粒的农杆菌转化表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述含重组质粒的农杆菌需进行培养为孢子后再转化表达宿主；所述培养为将含有重组质粒的农杆菌在含有利福平和卡那霉素的yep固体培养基平板上培养，挑取培养得到的单克隆菌落接种至含有利福平和卡那霉素的液体yep培养基中再进行培养，将得到的培养液离心收集菌体，倒掉上清，加入im培养基重悬菌体后再离心收集菌体，倒掉上清，加入im培养基重悬菌体并调整菌浓度后进行培养，将培养得到的农杆菌培养液与高山被孢霉孢子液按照一定的比例混合，涂布于铺有玻璃纸的im固体培养基进行培养，将玻璃纸转移到含有壮观霉素和头孢噻肟抗生素的sc固体培养基上进行培养持续观察菌落在sc固体培养基表面上的生长情况，若长出明显菌落，及时将菌落外沿挖出，继续接种于sc固体培养基上进行培养，待sc固体培养基表面上的菌落长出后，再挑取菌丝转接于sc固体培养基以排除阴性转化子，重复此操作多次后，将生长的菌落接种至gy固体培养基培养至产生大量优化后的含有重组质粒的农杆菌孢子。
在本发明的一种实施方式中，所述培养为将含有重组质粒的农杆菌在含有利福平和卡那霉素的yep固体培养基平板上划线，于28℃倒置避光培养48小时后，挑取单克隆菌落接种至含有利福平和卡那霉素的液体yep培养基中，再于28℃，200rpm避光培养48小时，将得到的培养液于4000g离心5min收集菌体，倒掉上清，加入im培养基重悬菌体，再于4000g离心5min，倒掉上清，加入im培养基重悬菌体，将得到的重悬菌体用im培养基调整菌浓度至od600为0.3，于28℃，200rpm摇床避光培养至od600到1.0，取浓度至od600为1.0的农杆菌培养液与浓度为1×108/ml的高山被孢霉孢子液按照体积比1:1进行混合，均匀涂布于铺有玻璃纸的im固体培养基上，于23℃避光培养24-36小时，将玻璃纸转移到含有壮观霉素和头孢噻肟抗生素的sc固体培养基上，于18℃避光培养12h，随后转移至25℃培养，持续观察菌落在sc固体培养基表面上的生长情况，若长出明显菌落，及时在菌落外沿挖出面积大约为2mm2的区域，继续接种于sc固体培养基上，于25℃培养，待sc固体培养基表面上的菌落长出后，再挑取菌丝转接于sc固体培养基以排除阴性转化子，重复此操作三次后，将生长的菌落接种至gy固体培养基，于28℃培养至产生大量优化后的含有重组质粒的农杆菌孢子。
在本发明的一种实施方式中，所述利福平的浓度为100μg/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述卡那霉素的浓度为100μg/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述壮观霉素的浓度为100μg/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述头孢噻肟抗生素的浓度为100μg/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述yep培养基的成分包含浓度为10g/l的酵母提取物、浓度为10g/l的胰蛋白胨、浓度为5g/l的氯化钠以及水。
在本发明的一种实施方式中，所述yep固体培养基的成分包含浓度为10g/l的酵母提取物、浓度为10g/l的胰蛋白胨、浓度为5g/l的氯化钠、浓度为20g/l的琼脂以及水。
在本发明的一种实施方式中，所述im培养基的成分包含浓度为1.74g/l的k2hpo4、浓度为1.37g/l的kh2po4、浓度为0.146g/l的nacl、浓度为0.49g/l的mgso4·7h2o、浓度为0.078g/l的cacl2、浓度为0.0025g/l的feso4·7h2o、浓度为0.53g/l的(nh4)2so4、浓度为7.8g/l的mes、浓度为1.8g/l的葡萄糖、浓度为5g/l的甘油以及浓度为200μm的乙酰丁香酮(as)；所述im培养基的ph为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述im固体培养基的成分包含浓度为1.74g/l的k2hpo4、浓度为1.37g/l的kh2po4、浓度为0.146g/l的nacl、浓度为0.49g/l的mgso4·7h2o、浓度为0.078g/l的cacl2、浓度为0.0025g/l的feso4·7h2o、浓度为0.53g/l的(nh4)2so4、浓度为7.8g/l的mes、浓度为1.8g/l的葡萄糖、浓度为5g/l的甘油、浓度为20g/l的琼脂以及浓度为200μm的乙酰丁香酮(as)；所述im培养基的ph为6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述sc固体培养基的成分包含浓度为5g/l的无氨基酸与硫酸铵的酵母氮源、浓度为1.7g/l的硫酸铵、浓度为20g/l的葡萄糖、浓度为20mg/l的腺嘌呤、浓度为30mg/l的络氨酸、浓度为1mg/l的甲硫氨酸、浓度为2mg/l的组氨酸、浓度为4mg/l的赖氨酸、浓度为4mg/l的色氨酸、浓度为5mg/l的苏氨酸、浓度为6mg/l的异亮氨酸、浓度为6mg/l的亮氨酸、浓度为6mg/l的苯丙氨酸、浓度为2mg/l的精氨酸以及水。
在本发明的一种实施方式中，所述gy固体培养基的成分包含浓度为20g/l的葡萄糖、浓度为10g/l的酵母提取物、浓度为2g/l的硝酸钾、浓度为1g/l的磷酸二氢钠、浓度为3g/l的七水硫酸镁、浓度为20g/l的琼脂以及水。
本发明提供了应用上述一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌生产得到的脂肪酸。
本发明提供了上述一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌在生产脂肪酸方面的应用。
有益效果：
(1)本发明以苯丙氨酸羟化酶(pah)基因为目的基因，以pbig2-ura5s-its为表达载体，以高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株ccfm501为宿主菌株，通过根癌农杆菌介导的方法过表达pah基因，构建了一种生产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌；
(2)本发明得到的含有苯丙氨酸羟化酶(pah)基因的过表达重组菌株的pah基因的相对表达水平提高了2.6倍，总脂产量相比野生型提高了约8.9％，油酸和亚麻酸分别提高了28％和15％，nadph的相对含量提高了24.3％；
(3)本发明证明了pah在脂质合成过程中具有重要作用，为深入解析高山被孢霉脂质合成机理，使之成为生产功能性脂质的细胞工厂提供理论依据。
附图说明
图1为二元表达载体pbig2-ura5s-pahslient的构建示意图；
图2为二元表达载体pbig2-ura5s-pah的构建示意图；
图3为干扰和过表达pah基因的高山被孢霉重组菌株鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；
其中，m：dna标准样品、1：m.alpina-pah、2：m.alpina-ipah、3：野生型高山被孢霉；
图4为干扰菌株m.alpina-ipah与高山被孢霉野生型菌株中pah基因转录水平；
图5为过表达菌株m.alpina-pah与高山被孢霉野生型菌株pah基因转录水平；
图6干扰菌株m.alpina-ipah与高山被孢霉野生型菌株脂肪酸相对组成；
图7为过表达菌株m.alpina-pah与高山被孢霉野生型菌株脂肪酸相对组成；
图8为重组菌株与高山被孢霉野生型菌株nadph相对含量；
其中，其中，m.alpina为野生型对照、m.alpina-pah为过表达重组菌株、m.alpina-ipah为干扰重组菌株。
具体实施方式
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
本发明涉及的培养基如下：
broth培养基：20g/l的葡萄糖、5g/l的酵母提取物、1g/l的kh2po4、0.25g/l的mgso4·7h2o、10g/l的kno3，ph为6.0。
yep培养基：10g/l的酵母提取物、10g/l的胰蛋白胨、5g/l的氯化钠以及水。
yep固体培养基：10g/l的酵母提取物、10g/l的胰蛋白胨、5g/l的氯化钠、20g/l的琼脂以及水。
mm培养基：1.74g/l的k2hpo4、1.37g/l的kh2po4、0.146g/l的nacl、0.49g/l的mgso4·7h2o、0.078g/l的cacl2、0.0025g/l的feso4·7h2o、0.53g/l的(nh4)2so4、7.8g/l的mes、1.8g/l的葡萄糖、5g/l的甘油。
im培养基：1.74g/l的k2hpo4、1.37g/l的kh2po4、0.146g/l的nacl、0.49g/l的mgso4·7h2o、0.078g/l的cacl2、0.0025g/l的feso4·7h2o、0.53g/l的(nh4)2so4、7.8g/l的mes、1.8g/l的葡萄糖、5g/l的甘油以及200μm的乙酰丁香酮(as)，ph为6.8。
im固体培养基：1.74g/l的k2hpo4、1.37g/l的kh2po4、0.146g/l的nacl、0.49g/l的mgso4·7h2o、0.078g/l的cacl2、0.0025g/l的feso4·7h2o、0.53g/l的(nh4)2so4、7.8g/l的mes、1.8g/l的葡萄糖、5g/l的甘油、20g/l的琼脂以及200μm的乙酰丁香酮(as)，ph为6.8。
sc固体培养基：5g/l的无氨基酸与硫酸铵的酵母氮源、1.7g/l的硫酸铵、20g/l的葡萄糖、20mg/l的腺嘌呤、30mg/l的络氨酸、1mg/l的甲硫氨酸、2mg/l的组氨酸、4mg/l的赖氨酸、4mg/l的色氨酸、5mg/l的苏氨酸、6mg/l的异亮氨酸、6mg/l的亮氨酸、6mg/l的苯丙氨酸、2mg/l的精氨酸以及水。
gy固体培养基：20g/l的葡萄糖、10g/l的酵母提取物、2g/l的硝酸钾、1g/l的磷酸二氢钠、3g/l的七水硫酸镁、20g/l的琼脂以及水。
soc复苏培养基：20g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母粉、0.5g/l的氯化钠、2.5mm的氯化钾，10mm的氯化镁，20mm的葡萄糖以及水。
lb固体培养基：10g/l的胰蛋白胨、5g/l的酵母粉、10g/l的氯化钠、20g/l的琼脂以及水。
本发明涉及的缓冲液如下：
内切酶缓冲液cutsmartbuffer：50mm乙酸钾(potassiumacetate)、20mm(tris-乙酸)tris-acetate、10mm乙酸镁(magnesiumacetate)、100μg/mlbsa以及水，ph为7.9。
本发明涉及的检测方法如下：
琼脂凝胶电泳分析：取1μgrna在1.2％的变性胶(含1.5％甲醛)中电泳，观察rna完整性。
rt-qpcr检测：取0.5-1μg总rna为模板，根据primescriptrtreagentkit(takara,otsu,shiga,japan)试剂盒说明进行操作，获得重组菌株的cdna；使用abi-prism7900sequencedetectionsystem(appliedbiosystems,ca)按照sybrgreenpcrmastermix(appliedbiosystems,ca)的说明进行rt-qpcr反应，反应体系为20μl，其中含power
脂肪酸甲酯检测：采用gc-2010(shimadzuco.，japan)，色谱柱为db-waxetr(30m×0.32mm，0.22μm)，氢火焰离子检测器检测，气化室和检测器温度分别为240℃和260℃，分流方式进样1μl，分流比10:1，载气为氮气。程序升温：初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以4℃/min升到220℃，保持20min。通过与商业化的脂肪酸甲酯标准品(37种脂肪酸甲酯混标，supelco，usa)和加入内标c15:0的质量比较，定性、定量分析样品中脂肪酸组分。
实施例1：高山被孢霉pah编码基因的克隆
根据高山被孢霉(m.alpina)atcc#32222的pah基因的序列信息，设计引物对pf/pr、p1/p2和p3/p4，下划线部分分别为酶切位点bamhi、xmai、hindiii、nhei、bamhi和xmai，以pah编码基因为模板，分别用引物pf/pr、p1/p2和p3/p4、kod高保真聚合酶，进行pcr扩增，得到pah(1338bp)、核苷酸序列为seqidno.15的pahsf和核苷酸序列为seqidno.16的pahsr基因片段(180bp)。
pcr程序为：94℃3min，94℃30s，55℃30s，68℃1.5min，30个循环，68℃5min；再对pcr产物进行纯化，纯化产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳验证。
核苷酸序列为seqidno.2的pf：cgcggatccaacatctcgctctcgcgcatc
核苷酸序列为seqidno.3的pr：tccccccgggtgcaaaagtgtccaggtcca
核苷酸序列为seqidno.4的p1：cccaagcttaacatctcgctctcgcgcatc
核苷酸序列为seqidno.5的p2：ctagctagctgtctgcaaaagtgtccaggtcca
核苷酸序列为seqidno.6的p3：cgagctcaacatctcgctctcgcgcatc
核苷酸序列为seqidno.7的p4：tccccccgggtgtctgcaaaagtgtccaggtcca
实施例2：二元表达载体的构建
用限制性内切酶bamhi、xmai过夜酶切实施例1克隆的基因片段pah及载体pbig2-ura5s-its，酶切体系(100μl)为：2μlbamhi，2μlxmai，30μl质粒或pcr产物，10μlcutsmartbuffer，56μl去离子水，37℃金属浴酶切12h后纯化；用限制性内切酶hindiii、nhei过夜酶切基因片段pahsf及载体pbig2-ura5s-its，酶切体系(100μl)为：2μlhindiii，2μlnhei，30μl质粒或pcr产物，10μlcutsmartbuffer，56μl去离子水，37℃金属浴酶切12h后纯化。
用t4连接酶将酶切纯化后的基因片段pah、pahsf分别与载体pbig2-ura5s-its连接，4℃下12h，得到重组表达载体pbig2-ura5s-pah和pbig2-ura5s-itpahsf，连接体系为(100μl)：10μl目的基因酶切后片段，30μl载体酶切后片段，10μl连接酶buffer，5μlt4连接酶，45μl无菌水，22℃连接3h。
用限制性内切酶bamhi和xmai过夜酶切基因片段pahsr及载体pbig2-ura5s-itpahsf，酶切体系(100μl)为：2μlbamhi，2μlxmai，30μl质粒或pcr产物，10μlcutsmartbuffer，56μl去离子水，37℃金属浴酶切12h后纯化。
用t4连接酶将酶切纯化后的基因片段pahsr与载体pbig2-ura5s-itpahsf连接，22℃连接3h，得到重组表达载体为pbig2-ura5s-pahsilent(pah的rnai基因的核苷酸序列为seqidno.8)。
连接体系为(10μl)：2μl目的基因酶切后片段，6μl载体酶切后片段，1μl连接酶buffer，1μlt4连接酶，22℃连接3h。(二元表达载体pbig2-ura5s-pahsilent的构建如图1，二元表达载体pbig2-ura5s-pah的构建见图2，)
实施例3：二元表达载体的验证
将实施例2所得的重组表达载体pbig2-ura5s-pahsilent和pbig2-ura5s-pah电转化大肠杆菌top10感受态细胞，方法如下：
1)无菌状态下取80μl感受态细胞，加入1-2μl上述连接产物pbig2-ura5s-pahsilent和pbig2-ura5s-pah，吹吸混匀；
2)将上述混匀的感受态细胞移入预冷过的电转杯中，避免产生气泡；
3)将电转杯放入bio-rad电转仪，调到合适预设程序档位，根据仪器说明电转，电压条件为1.8kv；
4)电转后的感受态细胞移入含有1mlsoc复苏培养基的1.5ml无菌离心管中，37℃，150rpm孵育1小时；
5)取200μl涂布含有100μg/ml卡那霉素的lb固体培养基平板，倒置37℃培养过夜；
6)挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得二元表达载体pbig2-ura5s-pahsilent和pbig2-ura5s-pah。
实施例4：制备含二元表达载体的根癌农杆菌
将实施例3所得的二元表达载体pbig2-ura5s-pahsilent和pbig2-ura5s-pah电击转化根癌农杆菌的方法参照转化大肠杆菌top10的方法，分别得到含有质粒pbig2-ura5s-pahsilent和pbig2-ura5s-pah的根癌农杆菌。
实施例5：含二元表达载体的根癌农杆菌的优化
步骤如下：
1)将实施例4所得的含有质粒pbig2-ura5s-pahsilent和pbig2-ura5s-pah的根癌农杆菌在含有100μg/ml利福平和100μg/ml卡那霉素的yep固体培养基平板上划线，28℃倒置避光培养48小时；
2)挑取单克隆接种至20ml含有100μg/ml利福平和100μg/ml卡那霉素的液体yep培养基中28℃，200rpm避光培养48小时；
3)4000g离心5分钟收集菌体，倒掉上清，加5mlim培养基重悬菌体，4000g离心5分钟，倒掉上清，加2mlim培养基重悬菌体；
4)用im培养基调整菌浓度至od600为0.3，置于28℃，200rpm摇床避光培养至od600到1.0；
5)取100μl根癌农杆菌与100μl高山被孢霉孢子混合，均匀涂布于铺有玻璃纸的im固体培养基上，23℃避光培养24-36小时；
6)将玻璃纸转移到含有100μg/ml壮观霉素和100μg/ml头孢噻肟抗生素的sc平板(sc-cs)上，18℃避光培养12h，随后转移至25℃培养；
7)持续观察菌落在sc-cs平板上的生长情况，若长出明显菌落，及时用尖头镊子将菌落外沿挖出(大约2mm2)，接种于sc-cs平板上，继续正置于25℃培养箱中培养；
8)待sc-cs平板上的转化子长出后，挑菌丝转接于sc-cs平板，重复筛选3次，排除阴性转化子；
9)将筛选3次后生长的菌落接种至gy平板，28℃培养至产生大量含二元表达载体的孢子。
实施例6：重组高山被孢霉工程菌的构建
取实施例5中所得的孢子液构建重组高山被孢霉工程菌，步骤如下：
1)以4ml生理盐水来冲刷gy平皿表面，收集实施例5所得的孢子液于一个无菌1.5ml离心管中，过25μm滤膜；
2)调整根癌农杆菌的浓度，od600为0.3、0.7、1.0左右，各取100μl高山被孢霉菌液与根癌农杆菌混匀涂布于im固体培养基上，23℃避光培养2-3天；
3)随时用无菌镊子挑出生长的真菌菌丝sc-cs平板上，25℃培养2-3天；
4)观察高山被孢霉在平板上的生长情况，挑出在sc-cs平板上生长的菌丝接种于gy斜面上；
5)将上述步骤4)中平板上的高山被孢霉菌株孢子在gy斜面上传代三次；
6)将稳定遗传的菌株鉴定为干扰和过表达pah基因的重组高山被孢霉菌株，保藏于gy斜面上；
7)提取鉴定正确的重组高山被孢霉菌株的基因组dna，用一对与启动子和终止子特异性结合的引物进行pcr验证：
核苷酸序列为seqidno9的p5(sense)：cacacacaaacctctctcccact
核苷酸序列为seqidno.10的p6(antisense)：caaatgaacgtatcttatcgagatcc；
通过琼脂凝胶电泳分析来鉴定重组菌株，结果如图3，m.alpina-pah菌株产物条带有ura5(818bp)表达单元和pah(1338bp)单元，m.alpina-ipah菌株产物条带为ura5(818bp)表达单元，野生型高山被孢霉无条带，电泳结果表明过表达和干扰载体分别成功整合到高山被孢霉基因组中。
实施例7：重组高山被孢霉工程菌中pah基因转录水平的rt-qpcr检测
根据pah序列和内参18srdna序列设计如下引物：
核苷酸序列为seqidno.11的p7(sense)：ccgccgattgggactatga
核苷酸序列为seqidno.12的p8(antisense)：gacctgcttcgccagtttctc
核苷酸序列为seqidno.13的p9(sense)：ctattggcggaggtctattcgt
核苷酸序列为seqidno.14的p10(antisense)：gcacgcattcggataattggt
取实施例6所得的重组高山被孢霉工程菌的总rna进行rna完整性检测，步骤如下：
1)将实施例6中得到的重组高山被孢霉工程菌进行培养离心，取约0.1g上清液中的菌体于预冷的灭酶研钵中，加液氮充分研磨；
2)加入1mltrizol(invitrogen，carlsbad，ca，usa)继续研磨成粉末状后，室温溶解；
3)将溶解后液体用无酶枪头吸出约1ml于无酶离心管中，添加200μl三氯甲烷颠倒混匀，室温放置2min；
4)12000rpm，4℃离心15min，吸取上层水相于新的无酶离心管中；
5)添加等体积异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min，12000rpm，4℃，离心15min；
6)用无酶枪头吸去异丙醇；
7)添加1ml新配75％乙醇，12000rpm，4℃，离心15min后，去上清；
8)室温放置干燥，用100μl无酶水溶解rna沉淀，-80℃保存；
9)浓度测定：取1μlrna用nanodrop2000测定浓度；
10)变性胶电泳检测rna完整性。
反转录合成重组高山被孢霉工程菌的cdna进行rt-qpcr检测。
rt-qpcr结果如图4和5所示，m.alpina为野生型对照，m.alpina-pah为过表达重组菌株，与对照组相比，过表达菌株中pah基因转录水平上调了2.6倍，说明转化的pah基因表达原件成功实现了转录；m.alpina-ipah为干扰重组菌株，rna干扰菌株中的pah基因的转录水平下降了一半，说明转化的pah基因表达原件成功抑制了转录。
实施例8：重组高山被孢霉工程菌中nadph的提取与检测
取实施例6所得的重组高山被孢霉工程菌中nadph进行检测，步骤如下：
1)将实施例6中得到的重组高山被孢霉工程菌进行培养离心，取约0.1g上清液中的菌体于2mlep管中，加入1mlnadp/nadphextrationbuffer，组织破碎仪破碎后，置于冰上10min，离心(1000xg，10min)；
2)转移上清至10kda超滤管中，过滤除去酶；
3)剩余步骤参考说明书进行；
计算出nadph质量后，结合高山被孢霉酶菌体干湿重比算出nadph重量/菌体重量(mg/g)，结果如图6所示，过表达重组菌株m.alpina-pah中的nadph水平与对照菌株显著性升高，干扰重组菌株m.alpina-ipah中的nadph水平与对照菌株显著性降低，进一步证明了干扰pah对细胞内的nadph水平产生了影响。
实施例9：重组高山被孢霉工程菌产脂肪能力的检测
1)采用盐酸反复冻融破壁的方式，用有机溶剂提取高山被孢霉干菌体中油脂；
2)将高山被孢霉野生型菌株与实施例6获得的重组高山被孢霉工程菌接种于broth培养基中，28℃，200r/min摇床培养7天；
3)收集菌体后真空冷冻干燥，并称重计算生物量；
4)用研钵将菌体研磨成粉末，精确称取50mg菌粉于提脂瓶，加入2ml4mol/l盐酸；
4)80℃水浴1h，-80℃冷却15min，重复一次且震荡混匀，于80℃水浴1h；
5)冷却至室温，加入1ml甲醇，震荡混匀；
6)加入1ml氯仿，震荡10min，6000g离心3min，小心吸取下部氯仿于新提脂瓶中；
7)重复步骤(6)两次；
8)合并氯仿(约3ml)，加入1ml饱和氯化钠，震荡混匀，3000g离心3分钟。收集氯仿层于新提脂瓶中。再继续加入1ml氯仿于原瓶，3000g离心3分钟。合并氯仿(约4ml)；
9)氮吹干燥得到粗脂；
10)向上述粗脂中分别加入100μl2.02mg/ml内标c15:0和1ml10％盐酸甲醇溶液，60℃水浴3h，每隔半小时振荡1min；
11)冷却至室温后加入2ml正己烷和1ml饱和nacl溶液，震荡混匀，4000rpm离心3min；
12)吸出200μl正己烷层于新瓶，加入800μl正己烷混匀后转入气相瓶，得到脂肪酸甲酯溶液；
13)进行脂肪酸甲酯检测。
其中总脂肪酸含量用单位菌体中总脂肪酸的质量表示。(表1是野生型高山被孢霉与重组菌株脂肪酸的组成)
表1高山被孢霉菌株与重组菌株脂肪酸组成比较
表1和图7表明，本发明得到的重组菌株m.apina-ipah完成了干扰，m.apina-ipah的总脂肪酸含量由34.5％降到了30.4％，不饱和脂肪酸产量无显著性变化；证明了高山被孢霉脂质合成和pah的相关性；表1和图8表明，本发明得到的重组菌株m.apina-pah完成了过表达，m.apina-pah的总脂肪酸产量由34.5％升高到了37.6％，油酸和亚麻酸分别提高了28％和15％，得到了产脂肪酸，尤其是产不饱和脂肪酸能力提升的菌株，这对高山被孢霉分子改造来解析脂质合成机理，为后续工业化生产功能性脂质提供了理论依据。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种产不饱和脂肪酸能力提升的重组高山被孢霉工程菌
<160>16
<170>patentinversion3.3
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